離子交換分離純化蛋白原理總結(jié)歸納

1、離子交換分離純化蛋白原理及應(yīng)用離子交換劑基質(zhì)主要有樹脂、纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和硅膠(HPLC等 離子交換樹脂一般只適合分離小分子物質(zhì)如氨基酸等，不適合分離蛋白質(zhì)等大分子 物質(zhì)，一方面是因為大分子不易進入樹脂緊密交聯(lián)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，另一方面因為交聯(lián) 聚苯乙烯骨架疏水性很強，用于蛋白質(zhì)分離時，會出現(xiàn)疏水性的不可逆吸附。此外, 離子交換樹脂的機械強度較差，而且樹脂的體積常隨著溶劑離子強度的變化發(fā)生溶 脹和收縮。根據(jù)交換基團的電荷性質(zhì)進行分類：陽離子交換樹脂：強酸型含磺酸基團(R-S03H)中等酸型含磷酸基團(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂：強堿 含季胺基團-N+(CH3

2、)3弱堿含叔胺、伯胺基團-N(CH3)2陰離子交換樹脂對化學試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。弱酸型一只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型一只能在酸性pH范圍內(nèi)使用1"離子交換纖維素 的種類很多，可分為陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素兩大類。 由于這些材料是纖維狀的，大部分活性基團分布在表面，所以，適合于分離蛋白質(zhì) 等生物大分子。陰離子交換纖維素一DEAE纖維素,具二乙胺乙基，陽離子交換纖維 素一CM纖維素,具有羧甲基，分別是應(yīng)用得最廣泛的陰離子交換纖維素和陽離子交 換纖維素。另外，根據(jù)纖維素顆粒的物理結(jié)構(gòu)不同，可分為“纖維型”和“微晶型” 兩大類?！拔⒕汀币蝾w粒細、比重大，能制成緊密

3、的柱，交換容量大，分辨率高。離子交換凝膠：離子交換葡聚糖凝膠 和聚丙烯酰胺凝膠 具有許多優(yōu)點，分離大分子 物質(zhì)，不會引起被分離物質(zhì)的變性戒失活，非特異性吸附很低；交換容量大（為離子交換纖維素的3-4倍）；容易制成微球型，因此裝柱和層析時的流速都較易控制。它 的缺點是隨著洗脫液的離子強度和 pH的變化，床體積變化大，明顯影響流速；另外， 由于它的凝膠性質(zhì)，有時會把大分子物質(zhì)排阻在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之外。女口：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG、瓊脂糖（Sepharose）平衡緩沖液：它的離子強度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。 其次是要使各個待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當?shù)慕Y(jié)

4、合。增強洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力，降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫緩沖液：在離子交換層析中一般常用 梯度洗脫，通常有改變離子強度和改變pH 兩種方式。改變離子強度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子交 換劑結(jié)合的各個組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有 較大的影響，故一般通常采用改變離子強度的梯度洗脫。強酸性陽離子換劑H啲結(jié)合力比對Na啲??；H型SP Sepharose FF沖 I I（Nacl、NaOH NH4OH NH4CI洗脫 磷酸緩沖液平衡弱酸性陽離子交換劑對H+勺結(jié)合力遠

5、比對Na+勺大；Na型 CM纖維素NAOH或 HCL H+或 Na+洗脫強堿性陰離子交換劑對0H-的結(jié)合力比對C1-的小得多；0H型弱堿性陰離子交換劑對0H-的結(jié)合力比對Cl-的大。Cl型DEAE纖維素Nacl、NaOH乙酸銨（NH4A） 磷酸根（PO3-）洗脫 Tris-Hcl、磷酸鹽緩沖 液平衡。陰離子交換劑堿性堿性緩沖液 酸性蛋白 蛋白pl v pH時 帶負電陽離子交換劑堿性酸性緩沖液堿性蛋白pl > pH時 帶正電DEAE纖維陰離子交換劑純化分離酸性蛋白堿性緩沖液CM纖維素陽離子交換劑純化分離堿性蛋白酸性緩沖液堿性越強，就越容易被陽離子交換劑吸附蛋白在pH58穩(wěn)定時，則應(yīng)選擇陰離

6、子交換劑；蛋白在pH5以下穩(wěn)定時，則可選擇陽離子交換劑。陰離子交換劑，PH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì)。陽離子交換劑，一般pH>4條件下 使用，DEAE纖維素吸附酶和蛋白質(zhì)時常用 pH為79,然后提高鹽濃度或降低 pH使之洗脫。CMk纖維素常選在pH4.56.0左右吸附蛋白質(zhì)，然后提高 pH或鹽濃度進行洗脫。聲干?_ I |! ” _一 匚二例：用離子交換，那首先就要考慮是要陽離子還是陰離子，還有就是你的目的物的PH值蛋白質(zhì)是pl=6.27陰離子交換，用pH8.0-9.0的緩沖液首先利用緩沖液PH值把目的蛋白給結(jié)合到柱子上，然后用合適的鹽離子洗脫下來。陰離子交換柱：上樣緩沖液20mM Tris-HCl，用0 0.5M NaCI梯度洗脫，流速約2ml/min 。 ' I 廣 W二：廣 1. -. X ' I 點尹注意：首先是蛋白的等電點是多少選擇 pH值，掛柱時pH盡量不要超過pI值的2個 點。NacI的濃度可以設(shè)梯度，平衡時用 0.1mol之后可以選擇0.3