膠體金的相關(guān)知識

1、免疫層析試紙包被技術(shù)簡介試紙生產(chǎn)過程中一般有三種 溶液的包被處理，即 質(zhì)控溶液，檢測溶 液，和結(jié)合物溶液（膠體金）。質(zhì)控和 檢測溶液就是C/T 線上包被的溶液。在免疫層 析試紙硝酸纖維素 膜表面進(jìn)行C/T線的包被，是試紙生產(chǎn)制作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。免疫診斷試劑中満加桿-«»，-樣品涼動(dòng)方向 樣品峑段測號T用桂鱗c狽水*M+展析膜"C硝酸幷犁未醍）PVCtt使用的硝酸纖維素膜有兩類，一種是免疫滲濾產(chǎn)品用的，按孔徑選擇一般采用 0.45um-1.2um的膜，與分子生物學(xué)中用的印跡轉(zhuǎn)移膜一樣。 WhatmarSchleicher & Schuell的膜屬于純采用10

2、0%勺純硝酸纖維素，蛋白結(jié)合能力較高。另一類 即免疫層析用膜，一般按側(cè)向流動(dòng)速度來劃分，常用的范圍一般在120-180秒/4cm。目前市場上的硝酸 纖維素膜材以帶塑料底襯 為主，也有部分的膜不帶 底襯。不帶底襯的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有適當(dāng)差別。鑒于流動(dòng)封閉技 術(shù)的普及，C/T線的包被 目前流行先將膜粘貼在塑 料支持底板上，然后直接 將塑料板放入儀器上進(jìn)行 劃線操作，干燥后進(jìn)行其 他部分的貼板組裝，這種 劃膜工藝可簡稱為劃板。但部分產(chǎn)品的工藝要求先直接在膜上劃好 C/T線，然后用特定配方的溶液將膜 進(jìn)行浸泡封閉處理，干燥后再貼膜及其他部分材料，這種劃膜工藝可簡稱為劃 膜。在結(jié)合物溶

3、液（膠體金）的包被上，較多的用戶傾向于用氣動(dòng)噴頭進(jìn) 行定量操作。在科研及研發(fā)項(xiàng)目中，往往噴一條線或幾條線就夠用了，因此在 單維往復(fù)平臺(tái)上一次噴一條線也可接受。鑒于膠體金膜切條寬度一般在 3-7mm,不方便一條條依次地在移動(dòng)平臺(tái)上固定和取放。因此在批量生產(chǎn)過程 中，一般建議采用成片的膠體金墊，用三維平臺(tái)往復(fù)來回地間隔噴線，一次即 可噴出二三十條。此后將噴好的金干燥再裁切成條，這樣的操作會(huì)效率高，適 合規(guī)模生產(chǎn)。在某些免疫層析試紙產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中，層析膜材或樣品墊膜材需要用特定溶液進(jìn)行整平面包被，要求效果均勻，如層析膜和樣品墊的特定封閉處理。而一般的浸泡或鋪金工藝滿足不了要求。這時(shí)可用氣動(dòng)噴頭疊加噴

4、線成面。通 過對溶液量和氣體壓力的調(diào)節(jié)，往往可以取得好的效果。劃膜筆定伸展長度和角度劃線時(shí)完Air Sprayer劃線/噴金/噴線/噴點(diǎn)技術(shù)劃膜筆采用PEEK材質(zhì)的 中空纖維管，屬于接觸式成 線方式。相比其問世前的不 銹鋼針管和拉伸玻璃纖維 管而言，該纖維管具有優(yōu)良 的韌性和恰到好處的柔軟 度，劃膜筆頭與膜面接觸的 端面經(jīng)過特細(xì)砂紙打磨，以全不會(huì)損傷微孔膜結(jié)構(gòu)。纖維管內(nèi)孔直徑為0.23mm，試劑溶液內(nèi)的正常溶質(zhì)不可能堵塞該纖維管，同時(shí)液體流出時(shí)沒有積累壓力，管道內(nèi)的溶液隨高精度泵的推動(dòng)即時(shí)流出，使 高精度泵的恒穩(wěn)液流得到完美表現(xiàn)。該劃膜筆的PEEK管材在剛面世的2000年即被Biodot 公司

5、選用為Frontline，延用至今，可見其性能的完美。但膜面劃線效果并不唯一取決于泵和劃膜筆頭。溶液均勻勻速地劃于膜面后，如膜的親水性不均勻，溶液潤濕擴(kuò)散效果不好，形成的線條也就不會(huì)整齊均勻。在某些不選用硝酸 纖維素類膜而選用其他材質(zhì)（如特細(xì)玻璃纖維，其表面不夠平滑細(xì)膩）的試紙產(chǎn)品中，劃 膜筆的溶液無法均勻穩(wěn)定的傳遞到膜材的各個(gè)纖維，其成線完全靠溶液在纖維間的被動(dòng)擴(kuò) 散，效果也就不如人意了。氣動(dòng)噴頭層析試紙中的結(jié)合物（膠體金）材質(zhì)一般采用玻璃纖 維、聚酯纖維、特種層析紙或無 紡布。鑒于這些材質(zhì)的纖維網(wǎng)間 隙大，纖維分布不夠均勻，因此 將結(jié)合物（膠體金）溶液通過恒 定壓力的氣體霧化后噴射在膜材

6、的纖維網(wǎng)內(nèi)，使溶液一次性主動(dòng) 擴(kuò)散在特定的面積范圍內(nèi)，其效 果遠(yuǎn)優(yōu)于將溶液直接噴射或劃膜 筆頭劃在該類材質(zhì)表面。鑒于溶液通過高精度泵 恒定推進(jìn)，氣體壓力恒穩(wěn)控制，因此其噴射的溶 液線很均勻，溶液量可控制調(diào)節(jié)，效果也容易重 復(fù)。在一般的夾心法試紙中，結(jié)合物（膠體金） 經(jīng)常通過將整條或整片膜材放入溶液中浸泡或通過特定的工藝進(jìn)行溶液平鋪， 然后將膜材干燥。當(dāng)有溶液在膜材上流動(dòng)時(shí)，干燥后的膜材平面上結(jié)合物（膠體金）往往分布不均勻。而在競爭法的 產(chǎn)品中，試紙條上結(jié)合物的量直接關(guān)系 到cutoff值，因此競爭法產(chǎn)品更需要用 氣動(dòng)噴頭進(jìn)行結(jié)合物（膠體金）的均勻 噴線。氣動(dòng)噴頭主要部件為中心的溶 液不銹鋼管與

7、壓縮氣管。溶液通過高精 度步進(jìn)泵從不銹鋼管中均勻穩(wěn)定地流 出，迅即被四周的恒壓流動(dòng)氣體霧化， 直接噴射出噴孔，氣體和液體完全同步 流動(dòng)，不會(huì)有任何脫尾或大點(diǎn)現(xiàn)象。氣 動(dòng)噴頭體積小巧精致，直徑約8mm可以 將多個(gè)噴頭并排進(jìn)行噴金，大大提高工 作效率。電磁閥噴射頭在高精度泵的配合下，噴射頭通過對特種電磁閥的開閉控制調(diào)節(jié)塑料 管內(nèi)溶液壓力，在特定壓力下開閥，液體即噴射成線或成滴。層析試紙生產(chǎn)溶 液噴射成線，與劃膜筆頭成線的差異不在于液體的量有差異，而在于溶液在膜 空隙中擴(kuò)散的速度有差異，前者主動(dòng)擴(kuò)散，后者被動(dòng)擴(kuò)散。當(dāng)層析膜材質(zhì)性能穩(wěn)定時(shí)，這方面并不導(dǎo)致免疫反應(yīng)信號的差異。Biodot將電磁閥的高頻震

8、蕩開關(guān)與高精度步進(jìn)泵的同步程序控制形 成的噴射技術(shù)申請了專利。但該技術(shù)的致命缺陷是電磁閥及噴嘴經(jīng)常出現(xiàn)不可 預(yù)見的堵塞或散射現(xiàn)象。同時(shí)其壟斷性的電磁閥成本一直居高不下。目前有客 戶開始直接將電磁閥拆下，直接接上劃膜筆，可得到穩(wěn)定的劃線效果。金標(biāo)公 司提供成套的劃膜筆及支架進(jìn)行由噴線至劃線的改造。劃膜/噴線/噴點(diǎn)/噴金儀器簡介金標(biāo)公司提供三種溶液包被平臺(tái)：平臺(tái)移動(dòng)式、 帶連續(xù)式、劃膜筆移動(dòng)式。移動(dòng)式平臺(tái)平臺(tái)移動(dòng)式共有三種產(chǎn)品，即HM3O10HM3O30 HM3230是目前市場上使用量最大的品種。 平臺(tái)式儀器能適應(yīng)多種試紙 包被工藝，如劃膜工藝（直接在 NC膜上劃線），劃板工藝（在貼膜的底板上劃

9、線），噴金工藝，封閉工藝（對樣品墊及膜均勻噴涂）等。新建立免疫層析試紙 條研發(fā)生產(chǎn)平臺(tái)的客戶，如果沒有以往的成熟經(jīng)驗(yàn)確認(rèn)后續(xù)規(guī)模生產(chǎn)只需要特定單一的工藝流程，建議最好采購這類平臺(tái)式儀器，以適應(yīng)后續(xù)生產(chǎn)研發(fā)中不同產(chǎn) 品不同工藝的需要。該系列儀器可配制多達(dá)六個(gè)單聯(lián)泵，或多個(gè)8聯(lián)泵。具體請 咨詢。輸送帶式平臺(tái)輸送帶式平臺(tái)目前品種為HM8000主要 適合劃板操作，即先貼膜后劃線的工藝。它能極 大的提高生產(chǎn)效率，單人操作時(shí)正?？蛇_(dá)到 800-1000大板/小時(shí)（按膜長度約300米/小時(shí)）的速度。出于省人工，提高效率的目的，歐美廠家較偏愛卷式劃膜儀器，卷式儀器的速度一般也就300米/小時(shí)，而劃膜后往往還是

10、由手工進(jìn)行貼膜。而達(dá)到同 樣速度的HM8000則要求先貼膜，后劃板。此外卷式劃膜儀器的購置費(fèi)用很大，維護(hù)費(fèi)用也偏高。同時(shí)這種儀器生產(chǎn)時(shí)需要上卷卸卷，劃膜完收卷前需要臨時(shí)的 干燥處理，收卷后還需要進(jìn)一步干燥。收卷后干燥一般要求用真空工藝， 如果用 一般的烘干工藝，則需要將卷膜人工松散開來，費(fèi)工費(fèi)力。相比較 HM800Q更 加沒有優(yōu)勢。劃膜噴金模塊金標(biāo)公司特殊設(shè)計(jì)了劃膜/噴金/噴線模塊。當(dāng)平臺(tái)同時(shí) 配置劃膜噴金頭時(shí)，該模塊可同時(shí)安裝四根劃膜筆頭， 一個(gè)氣動(dòng)噴頭。劃膜筆頭和氣動(dòng)噴頭的高度可獨(dú)立調(diào)整， 避免在噴金模式時(shí)劃線筆頭的高度不夠而與平臺(tái)面的工 件如磁壓條等發(fā)生碰撞，或在劃線模式時(shí)噴金頭與平臺(tái)

11、上工件碰撞。四個(gè)劃線筆頭的間隔距離可通過外插的鑰匙頭帶動(dòng)微型絲桿進(jìn)行無級調(diào)節(jié)。劃線筆頭的旋轉(zhuǎn)角度可適當(dāng)調(diào)節(jié)。此外根據(jù)需要可調(diào)節(jié)不銹鋼夾頭間隙，劃線筆在孔隙中能自由抽動(dòng)，以調(diào)整劃線筆頭的探伸長度，確保筆頭對硝酸纖維素膜的適當(dāng)壓力，保證層析膜表面溶液成線的效果。該模塊可用來將Biodot的電磁閥噴射頭改造為劃膜筆。金標(biāo)公司開發(fā)了多種機(jī)型的切刀。所有切刀的刀具都采用特種耐磨的合金鋼材料， 采用面磨剪切方式，刀片間隙可調(diào)。機(jī)器的送料系統(tǒng)經(jīng)過特殊改進(jìn)設(shè)計(jì)，改用了特 殊耐磨的特種塑膠材料和送料傳動(dòng)電機(jī)，能保證良好的斬切精度。大部分機(jī)械部件 采用數(shù)控機(jī)床加工，保證了質(zhì)量和裝配精度。公司購買了高精度數(shù)控磨床，

12、長期提 供刀具平面修磨服務(wù)。產(chǎn)品名稱產(chǎn)品代號工作速 度板寬mni殘留mm吹風(fēng)擋料器工作效率微電腦自動(dòng)斬切 機(jī)ZQ20002009813選配無9500條/小時(shí)微電腦快速斬切 機(jī)ZQ240024012813選配選配11400條/小時(shí)數(shù)控咼速斬切機(jī)ZQ40004509813選配選配21000條/小時(shí)數(shù)控快速斬切機(jī)ZQ500040012813選配選配19000條/小時(shí)數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)ZQ42004509820選配無21000條/小時(shí)免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold tech nique)作者：發(fā)布日期：(2009-05-10)瀏覽次數(shù)：0次膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的

13、優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。 在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生 物芯片中都可能例用到。1971年Faulk和Taytor將膠體金引人免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫 學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析 法(immu no chromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法 (Dot-immuogold filtratio n assay DIGFA)用于檢測HBsAg、HCG和抗雙鏈DNA抗體等，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)。(一) 基本原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作

14、為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCb）在還原劑如檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠 體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是 靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA PHA ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫 和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。（

15、二）膠體金的制備膠體金的制備一般采用還原法，根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制 備膠體金顆粒的方法如下：1枸櫞酸三鈉還原法（1） 10nm膠體金粒的制備：取 0.01 % HAuCb水溶液100ml，加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液 3ml, 加熱煮沸30min，冷卻至4C,溶液呈紅色。（2） 15nm膠體金顆粒的制備：取0.01 % HAuCb水溶液100ml，加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液 2ml，加熱煮沸15min30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K 2CG0.5ml，混勻即可。（3） 15nm 18nm20nm 30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取 0.

16、01 % HAuCb水溶液100ml，加熱煮沸。 根據(jù)需要迅速加入 1%枸櫞酸三鈉水溶液 4ml、2.5ml 、1ml 或 0.75ml ，繼續(xù)煮沸約 5min， 岀現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、1820nm、30nm和50nmo金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改 變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見表表1 100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響1%檸檬酸三鈉 ml0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍(lán)灰紫灰紫紅1紅橙紅橙吸收峰（nm）2202405355

17、25522518徑粒（nm）14797.571.54124.5152. 鞣酸-枸櫞酸鈉還原法用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠A液：1% HAuCh水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。B液：1 %枸櫞酸三鈉 4ml, 1 %鞣酸0.7ml , 0.1Mol/L K?CG液0.2ml ,混合，加入雙餾水至 20ml將A液、B液分別加熱至60 C,在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表2所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及冷CO的用量。表2鞣酸-枸櫞酸鈉還原法試劑配制表金粒直徑A液B液(nm)1 %HAuC4

18、雙餾水1 %枸櫞酸三鈉0.1MOI/L K 2CQ1%鞣酸雙餾水517940.200.7015.101017940.0250.1015.8751517940.00250.0115.98753白磷還原法在120ml雙蒸餾水中加入 1.5ml 1%氯金酸和 1.4ml O.1mol/L K2CO3 ，然后加入 1ml五分之一 飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置 15 分鐘，在回流下煮沸直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法 制得的膠體金直徑約 6nm,并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實(shí)驗(yàn)室不宜采 用。要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級后制得膠體金顆粒直徑的變異系

19、數(shù)（CV）可小于15%。4制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)（ 1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定 的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn) 定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（ 2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45卩m過濾，以除去其中的聚合物和其它可能 混入的雜質(zhì)。（3）配制膠體金溶液的 pH以中性（pH7.2 ）較好。4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。(5)氯金酸配成1%水溶液在4 C可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于

20、氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好 將整個(gè)小包裝一次性溶解。(三) 免疫膠體金的制備膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。1 待標(biāo)記蛋白溶液的制備由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對低離子強(qiáng) 度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對澄清無細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心 除去。將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對0.005Mol/L pH7.0 NaCI 溶液中4 C透析過夜

21、，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4 C離心1h，去除聚合物。2 待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備以O(shè).IMoI/L K2CO3或0.1MoI/L HCI調(diào)膠體金液的 pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0 ;標(biāo)記McAb 時(shí)，調(diào)至8.2 ;標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至 7.6 ;標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.96.2 ;標(biāo)記ConA時(shí)， 調(diào)至8.0 ;標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至910 (表2)。由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測定為宜。表3 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金的PH蛋白質(zhì)PH抗體8.0-9.0SPA6.0過氧化物酶8.0低密度脂蛋白5.5ConA8.0親和素9.0-10.0

22、3 膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定(1) 根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。(2) 將標(biāo)記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0 硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5卩g/ml50卩g/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10 % NaCI溶液，混勻后靜置 2h,觀察結(jié)果。（ 4）結(jié)果觀察，對照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出 由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象； 而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定 1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白

23、質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適 當(dāng)增加10%20%。4膠體金與蛋白質(zhì)（ IgG ）的結(jié)合將膠體金和IgG溶液分別以O(shè).IMoI/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體 金溶液，繼續(xù)攪拌 10min ，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用 穩(wěn)定劑是5 %胎牛血清（BSA和1 %聚乙二醇（分子量 20KD）。加入的量：5 % BSA使溶液終濃 度為 1%；1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?10。5膠體金標(biāo)記蛋白的純化（ 1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速 度和離心時(shí)間。用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金

24、一羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min , 5nm金膠粒用1 800r/min ） 20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用 6 000g，4C離心1h ； 20nm40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4 C離心1h。仔細(xì)吸岀上清，沉淀物用含1 % BSA的PB液（含0.02 % NaN3，將沉淀重懸為原體積的1/10，4 C保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18 C保存一年以上。為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心 , 分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。（2）凝膠過濾

25、法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/51/10。再經(jīng) 1 500r/min 離心 20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠 S-400 ）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm x20cm，加樣量為床體積的 1 /10,以 0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含 0.1 % BSA, 0.05 % NaN3, pH8.2 者用 IgG 標(biāo)記物），流速為 8mI/h 。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾岀的液體為微黃色， 有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨

26、濃度的增加而紅 色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫岀略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合 物過濾除菌、分裝,4 C保存。最終可得到70%80%的產(chǎn)量。6膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定（ 1）膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥 后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察。計(jì)算100 個(gè)金顆粒的平均直徑。（2） 膠體金溶液的 OD520nm直測定：膠體金顆粒在波長510nm550nm之間岀現(xiàn)最大吸收值峰。用 0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含 1% BSA, 0.02 % NaN3 將膠體金蛋白試劑作1 : 20 稀釋，OD520=0.

27、25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.20.4。（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（Ml IGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或 抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測相應(yīng)的抗原或抗體，對金標(biāo)記蛋白的特異性和敏 感性進(jìn)行鑒定。7. 膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存 膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。 金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒 外面的水化膜

28、使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加 溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液 pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì) 的等電點(diǎn)，女口 ConA，過氧化物酶等，當(dāng) pH較低時(shí)保持穩(wěn)定，提高 pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電 點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶液可用0.20.5mg/ml PEG20000作為穩(wěn)定劑。在410 C貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。(四) 膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用 膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡便，方法敏感、特異，不需

29、要使用放射性同位素，或 有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的 免疫組化法外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等。1. 液相免疫測定將膠體金與抗體結(jié)合，建立微量凝集試驗(yàn)檢測相應(yīng)的抗原，如間接血凝一樣，用肉眼可直 接觀察到凝集顆粒。利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理，建立均相溶膠顆粒免疫測定法(Sol particle immunoassay ,SPIA)已成功地應(yīng)用于 PCG的檢測，直接應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。2. 膠體金在電鏡水平的應(yīng)用膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過應(yīng)

30、用不 同大小的顆?；蚪Y(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為3 15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。 315nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細(xì)胞。膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測。組織抗原的檢測。 金標(biāo)記在電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負(fù)染色、雙標(biāo) 記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。實(shí)驗(yàn)證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既 可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時(shí)適用于科研和診斷。3. 膠體金在光鏡水平的應(yīng)用膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均 可應(yīng)用。主要用于：用單克窿抗體或抗血清檢測細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。檢測培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，組織中或亞薄切片中抗原的檢測。 膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾 等缺點(diǎn)。4. 金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體，通過流