基因重組PowerPointPresentation

1、 DNADNA重組技術重組技術2021/5/281DNADNA重組技術前言重組技術前言2021/5/282一、重組一、重組DNADNA技術的誕生技術的誕生（一）重組（一）重組DNADNA技術誕生的理論基礎技術誕生的理論基礎 1.40 1.40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎是年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎是DNADNA 肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌2021/5/2832021/5/2842021/5/2853 3、5050年代末和年代末和6060年代提出了年代提出了“中心法則中心法則”和操和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼?？v子學說，并成功地破譯了遺傳密碼。中心法則中心法則2021/5/2862021/5/287

2、操縱子操縱子(operon)(operon) 用基因表達調(diào)控的原理解釋了酶誘導的本質(zhì)。用基因表達調(diào)控的原理解釋了酶誘導的本質(zhì)。2021/5/288（二）關鍵性實驗技術問世為重組（二）關鍵性實驗技術問世為重組DNADNA技術奠定基礎技術奠定基礎 1. 1.DNADNA分子的切割與連接技術分子的切割與連接技術 2. 2.載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 3. 3.SouthernSouthern雜交、雜交、DNADNA序列分析和聚合酶鏈式反應序列分析和聚合酶鏈式反應2021/5/289二二. .重組重組DNADNA技術的定義及步驟技術的定義及步驟（一）重組（一）重組

3、DNADNA技術技術1 1、重組、重組DNADNA技術（技術（recombinant DNA recombinant DNA technology):technology): 按照人的意愿，在體外對按照人的意愿，在體外對DNADNA分子進行重組，分子進行重組，再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該繁殖，以獲得該DNADNA分子的大量拷貝，表達相關基分子的大量拷貝，表達相關基因的產(chǎn)物，是進行基因功能研究的基本方法。因的產(chǎn)物，是進行基因功能研究的基本方法。2021/5/2810w9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。21.11.4

4、21.11.4Thursday, November 04, 2021w10、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。16:54:1316:54:1316:5411/4/2021 4:54:13 PMw11、人總是珍惜為得到。21.11.416:54:1316:54Nov-214-Nov-21w12、人亂于心，不寬余請。16:54:1316:54:1316:54Thursday, November 04, 2021w13、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。21.11.421.11.416:54:1316:54:13November 4, 2021w14、抱最大的希望，作最大的努力。2021年11月4日星期四下

5、午4時54分13秒16:54:1321.11.4w15、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。2021年11月下午4時54分21.11.416:54November 4, 2021w16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2021年11月4日星期四16時54分13秒16:54:134 November 2021w17、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。下午4時54分13秒下午4時54分16:54:1321.11.411w9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。21.11.421.11.4Thursday, November 04, 2021w10、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。16:54:1316

6、:54:1316:5411/4/2021 4:54:13 PMw11、人總是珍惜為得到。21.11.416:54:1316:54Nov-214-Nov-21w12、人亂于心，不寬余請。16:54:1316:54:1316:54Thursday, November 04, 2021w13、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。21.11.421.11.416:54:1316:54:13November 4, 2021w14、抱最大的希望，作最大的努力。2021年11月4日星期四下午4時54分13秒16:54:1321.11.4w15、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。2021年11月下午4時54分2

7、1.11.416:54November 4, 2021w16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2021年11月4日星期四16時54分13秒16:54:134 November 2021w17、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。下午4時54分13秒下午4時54分16:54:1321.11.4122021/5/2813（二）重組（二）重組DNADNA技術的重大意義技術的重大意義 1. 1.填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝。填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝。 2. 2.縮短了進化時間?？s短了進化時間。 3. 3.使人能對生物體進行定向構(gòu)造。使人能對生物體進行定向構(gòu)造。2021/5/2814第一節(jié)第一節(jié)

8、常用的工具酶常用的工具酶工具酶工具酶(Tool enzymes)(Tool enzymes)： DNADNA重組技術，需要利用一些酶在體外對重組技術，需要利用一些酶在體外對DNADNA進行切割、連接等基因操作，這些酶常被稱進行切割、連接等基因操作，這些酶常被稱為工具酶。為工具酶。2021/5/2815主要工具酶主要工具酶w限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶wDNADNA連接酶連接酶w逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶wDNADNA聚合酶聚合酶w堿性磷酸酶堿性磷酸酶w末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶wTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶2021/5/2816是一類能識別和切割雙鏈是一類能識別和切割雙鏈DNADNA分子中特定

9、堿基順序分子中特定堿基順序的核酸水解酶。的核酸水解酶。2021/5/2817一、限制性內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)1.1.簡稱限制酶，是簡稱限制酶，是DNADNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具 2.2.能識別和切割雙鏈能識別和切割雙鏈DNADNA分子特異序列的核酸水解酶分子特異序列的核酸水解酶 3. 3.在細菌體內(nèi)與相伴存在的修飾酶（甲基化酶）共在細菌體內(nèi)與相伴存在的修飾酶（甲基化酶）共同構(gòu)成細菌的限制修飾體系，起限制外來同構(gòu)成細菌的限制修飾體系，起限制外來DNADNA、保護自身保護自身DNADNA的作用的作用 2021/5/2818二二

10、. .命名命名第一個字母（大寫、斜體）第一個字母（大寫、斜體） 該酶的微生物屬名該酶的微生物屬名第二、三個字母（小寫、斜體）第二、三個字母（小寫、斜體） 代表微生物種名代表微生物種名第四個字母（斜體）第四個字母（斜體） 代表寄主菌的株或型代表寄主菌的株或型用羅馬數(shù)碼用羅馬數(shù)碼I I、IIII、IIIIII等區(qū)分同一株具等區(qū)分同一株具 有不同特異性的酶有不同特異性的酶2021/5/2819例例 流感嗜血桿菌中三個酶的命名：流感嗜血桿菌中三個酶的命名：Haemophilus influenzae dHaemophilus influenzae d 屬名屬名 種名種名 株系株系 H in dH in

11、 d I I II II III III Hind Hind I I Hind Hind II II Hind Hind III III 2021/5/2820三三. .分類分類 根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為：是否具有修飾酶活性可分為： I I型型 IIII型型 IIIIII型型2021/5/28211.1.I I型限制酶型限制酶屬于復合功能酶，兼有修飾和切割屬于復合功能酶，兼有修飾和切割DNADNA兩種特性。兩種特性。2021/5/28222.2.IIIIII型酶型酶與與I I型酶特性類似，也有甲基化功能，但型酶特性類似，也

12、有甲基化功能，但無無ATPATP酶和酶和DNADNA解旋酶活力。解旋酶活力。在在DNADNA鏈上有特異位點切割，其切割位點鏈上有特異位點切割，其切割位點在識別位點以外。在識別位點以外。2021/5/28233. 3. IIII型酶型酶（1 1）IIII型酶的識別型酶的識別 識別序列一般為識別序列一般為4-64-6個堿基對，通常是反轉(zhuǎn)重個堿基對，通常是反轉(zhuǎn)重復順序，具有復順序，具有180180的旋轉(zhuǎn)對稱性。的旋轉(zhuǎn)對稱性。（2 2）IIII型酶的切割功能型酶的切割功能平末端（平末端（blunt end)blunt end) 在識別順序的對稱軸上，對雙鏈在識別順序的對稱軸上，對雙鏈DNADNA同時切

13、割。同時切割。2021/5/282455端粘性末端（端粘性末端（cohesive end)cohesive end) 在識別順序的雙側(cè)末端切割在識別順序的雙側(cè)末端切割DNADNA雙鏈，于對稱雙鏈，于對稱軸的軸的55末端切割。末端切割。2021/5/2825 33端粘性末端端粘性末端 在識別順序的雙側(cè)末端切割在識別順序的雙側(cè)末端切割DNADNA雙鏈，雙鏈，于對稱軸的于對稱軸的33末端切割。末端切割。2021/5/28264.4.少數(shù)有特殊性質(zhì)的少數(shù)有特殊性質(zhì)的IIII型酶型酶異源同工酶（異源同工酶（isoschizomerisoschizomer） 定義：定義： 來源不同但能識別和切割同一位點的

14、酶。來源不同但能識別和切割同一位點的酶。2021/5/2827同尾酶（同尾酶（isocaudarner) isocaudarner) 為識別與切割順序相互有關的酶。為識別與切割順序相互有關的酶。 有些限制酶的識別序列包含在另一些限制酶有些限制酶的識別序列包含在另一些限制酶的識別順序之中的識別順序之中 酶來源不同，但它們作用后能產(chǎn)生相同的粘酶來源不同，但它們作用后能產(chǎn)生相同的粘性末端。性末端。552021/5/2828特點：特點：兩個同尾酶消化的兩個同尾酶消化的DNADNA片段，可以相互連接，片段，可以相互連接，連接后的重組連接后的重組DNADNA分子，可以被其中一種酶識分子，可以被其中一種酶識

15、別，也可能原來的任何一個同尾酶均不能識別。別，也可能原來的任何一個同尾酶均不能識別。2021/5/2829 （1 1）酶活力單位）酶活力單位 限制性內(nèi)切酶活力單位規(guī)定如下：在合適溫度、pH值和離子強度等條件下，1小時內(nèi)完全消化1g特異DNA底物所需的酶量，定義為一個活力單位。5.5.限制性內(nèi)切酶活力單位和星號活力限制性內(nèi)切酶活力單位和星號活力2021/5/2830（2 2） 星號活性星號活性 限制性內(nèi)切酶在非標準反應條件下，對識別序限制性內(nèi)切酶在非標準反應條件下，對識別序列的特異性下降，能切割一些與特異識別順序列的特異性下降，能切割一些與特異識別順序類似的序列，類似的序列，一般在酶的右上角加一

16、般在酶的右上角加* *表示。表示。如克隆過程中需同時進行雙酶切，應選用二種如克隆過程中需同時進行雙酶切，應選用二種酶都能接受的反應緩沖體系（可查閱試劑供應酶都能接受的反應緩沖體系（可查閱試劑供應商手冊獲得），否則可能出現(xiàn)星號活性。商手冊獲得），否則可能出現(xiàn)星號活性。2021/5/2831（3 3）特點：）特點：星號活力的識別形式常對標準識別順序中星號活力的識別形式常對標準識別順序中兩側(cè)的堿基沒有特異性。兩側(cè)的堿基沒有特異性。2021/5/28322021/5/2833（4 4）產(chǎn)生的原因）產(chǎn)生的原因 a.a.高甘油含量（高甘油含量（5%5%V/V)V/V) b. b.內(nèi)切酶用量過大，一般為內(nèi)切

17、酶用量過大，一般為 100100U/U/ g DNAg DNA c. c.低離子強度低離子強度2525mmol/Lmmol/L d. d.高高pHpH值值 pH8.0pH8.0 e. e.含有機溶劑：含有機溶劑：DMSODMSO、乙醇、乙烯二乙醇乙醇、乙烯二乙醇 MnMn2+2+、CuCu2+2+、CoCo2+2+、ZnZn2+2+等非等非MgMg2+2+的離子存在的離子存在 2021/5/2834（5 5）常見容量發(fā)生星號活力的酶有：）常見容量發(fā)生星號活力的酶有：EcoREcoRI I、HindHindIIIIII、KpnKpnI I、PstPstI I、ScaIScaI、SalSalI I

18、、XmnXmnI I、HinfHinfI I、BssHBssHIIII、EcoREcoRV V2021/5/2835（6 6）其他注意事項）其他注意事項 ： 底物底物DNADNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚溶液不能含大于溶液不能含大于1010mmol/Lmmol/L的的EDTAEDTA、SDSSDS和過量的鹽和過量的鹽2021/5/2836反應緩沖體系中一般加入反應緩沖體系中一般加入2-2-巰基乙醇或二硫蘇巰基乙醇或二硫蘇糖醇防止含巰基酶的氧化失活糖醇防止含巰基酶的氧化失活加入牛血清白蛋白穩(wěn)定酶活性加入牛血清白蛋白穩(wěn)定酶活性操作時應注意混勻反應體系，這也是常見的酶操

19、作時應注意混勻反應體系，這也是常見的酶切失敗原因之一切失敗原因之一2021/5/28376.6.甲基化酶甲基化酶許多細菌有限制修飾系統(tǒng)許多細菌有限制修飾系統(tǒng)限制（降解）外來限制（降解）外來DNADNA，并通過對自身并通過對自身DNADNA的的修飾而起保護作用修飾而起保護作用2021/5/2838類限制修飾系統(tǒng)類限制修飾系統(tǒng)由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)一種為限制性內(nèi)切酶，另一種為獨立的甲基化酶一種為限制性內(nèi)切酶，另一種為獨立的甲基化酶這兩種酶識別序列相同這兩種酶識別序列相同如如PstPst甲基化酶使甲基化酶使A A甲基化形成甲基化形成5-5-CTGCCTGCm mAG-3

20、AG-3 大腸桿菌株一般有大腸桿菌株一般有damdam甲基化酶和甲基化酶和dcmdcm甲基化酶甲基化酶2021/5/2839甲基化酶的應用甲基化酶的應用w甲基化酶亦是分子克隆的重要工具酶甲基化酶亦是分子克隆的重要工具酶w當制備克隆用雙鏈當制備克隆用雙鏈cDNAcDNA時，外源時，外源DNADNA片段可用片段可用M.M.EcoR EcoR 甲基化酶處理，使雙鏈甲基化酶處理，使雙鏈cDNAcDNA內(nèi)部內(nèi)部EcoR EcoR 位點則因甲基化受到保護而不被切割位點則因甲基化受到保護而不被切割 2021/5/28407.7.IIII型限制酶的用途型限制酶的用途（1 1）DNADNA重組克隆及亞克隆重組克

21、隆及亞克?。? 2）DNADNA雜交與序列分析雜交與序列分析（3 3）改建質(zhì)粒）改建質(zhì)粒（4 4）構(gòu)建基因組）構(gòu)建基因組DNADNA物理圖譜和文庫等物理圖譜和文庫等 2021/5/2841二、二、DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)(DNA polymerase)1 1、大腸桿菌、大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I及其大片段（及其大片段（KlenowKlenow片段）片段）（1 1）大腸桿菌）大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I 特性：具有特性：具有3 3種酶活性種酶活性2021/5/28422021/5/28432021/5/28442021/5/2845c. 5c

22、. 533外切酶活性：外切酶活性： 能從游離的能從游離的55末端降解末端降解DNADNA成為單核苷酸。成為單核苷酸。2021/5/2846（2 2）KlenowKlenow片段片段 從大腸桿菌從大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I中去除中去除5533外外切酶活性，即得切酶活性，即得KlenowKlenow片段。片段。 其只具有其只具有 5 533聚合酶活性聚合酶活性 3355外切酶活性外切酶活性 2021/5/284735kD76kD苦草桿菌蛋白酶裂解全酶苦草桿菌蛋白酶裂解全酶5 3外切外切酶酶5 3聚合酶聚合酶 3 5外切外切酶酶5 3聚合酶聚合酶 3 5外切外切酶酶KlenowKleno

23、w片段片段DNADNA聚合酶聚合酶I I全酶全酶2021/5/2848應用應用1.1.催化催化DNADNA切口平移反應，置備高比活切口平移反應，置備高比活DNADNA探針。探針。( (大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I）2021/5/28492.2.對對DNADNA分子進行末端標記（分子進行末端標記（KlenowKlenow）2021/5/28502 .2 .Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶(1)(1)特性：特性： 耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶來自于嗜熱的棲熱水生菌來自于嗜熱的棲熱水生菌Thermus aquaticus Thermus aquaticus 中純化而

24、來的。中純化而來的。 5533聚合酶活性聚合酶活性 5533外切酶活性外切酶活性 最佳作用溫度為最佳作用溫度為75-8075-80 C C 2021/5/28513.3.反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNARNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶，RDDPRDDP）reverse transcriptasereverse transcriptase（1 1）特性特性催化從催化從RNARNA為模板的為模板的DNADNA聚合反應聚合反應 具具3355RNARNA外切酶活性，能特異性降解外切酶活性，能特異性降解RNA RNA DNADNA雜交分子中的雜交分子中的RNARNA部分部分 具具DNADNA指

25、導的指導的DNADNA聚合酶（聚合酶（DDDPDDDP）的功能的功能 能以能以mRNAmRNA為模板催化合成出互補的為模板催化合成出互補的DNADNA（cDNAcDNA） 2021/5/2852（2 2）分類）分類 禽源反轉(zhuǎn)錄酶禽源反轉(zhuǎn)錄酶 來自禽或骨髓細胞瘤病毒（來自禽或骨髓細胞瘤病毒（AMVAMV） 具有聚合酶活性及強的具有聚合酶活性及強的RNARNA酶酶H H活性活性 無無3355外切酶活性。外切酶活性。 溫度溫度4242 C C pH8.6 pH8.6時活性較高時活性較高 2021/5/2853鼠源反轉(zhuǎn)錄酶鼠源反轉(zhuǎn)錄酶 來自來自MoloneyMoloney鼠白血病病毒（鼠白血病病毒（M

26、-MLVM-MLV）具有聚合酶活性及相對較弱的具有聚合酶活性及相對較弱的RNARNA酶酶H H活性活性 無無3355外切酶活性外切酶活性 溫度溫度3737 C C pH7.6pH7.6時活性較高時活性較高 2021/5/28542021/5/28552021/5/28564.4.末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶） 催化催化dNTPdNTP加到加到DNADNA分子的分子的33羥基端羥基端2021/5/28572021/5/2858三、三、DNADNA連接酶連接酶1.1.定義：定義：DNA Ligases are DNA Ligases are primari

27、ly responsible for primarily responsible for joining the gaps that form joining the gaps that form in DNA during replicationin DNA during replication(i.e., the joining of (i.e., the joining of Okazaki fragments formed by Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging discontinuous or lagging s

28、trand replication), DNA strand replication), DNA repair, and recombination.repair, and recombination. 催化雙鏈催化雙鏈DNADNA一端的一端的33OHOH與另一雙鏈與另一雙鏈DNA5DNA5的的磷酸根形成磷酸根形成33，5-5-磷酸磷酸二酯鍵，使具有相同粘性二酯鍵，使具有相同粘性末端或平末端的末端或平末端的DNADNA末端連末端連接起來。接起來。2021/5/2859三、三、DNADNA連接酶連接酶w注意：注意：DNADNA連接酶只能作用于雙鏈連接酶只能作用于雙鏈DNADNA分子而不能分子而不

29、能將二個單鏈將二個單鏈DNADNA分子連接。分子連接。wDNADNA連接酶是重要的基因重組的工具酶連接酶是重要的基因重組的工具酶 應用應用DNADNA連接酶將具有相同粘性末端或平端的連接酶將具有相同粘性末端或平端的DNADNA分子連接起來。分子連接起來。2021/5/2860wDNADNA連接酶的特點：連接酶的特點：T4T4噬菌體噬菌體DNADNA連接酶和大腸桿菌連接酶和大腸桿菌DNADNA連接酶連接酶T4T4噬菌體噬菌體DNADNA連接酶能連接帶粘性末端或平末端連接酶能連接帶粘性末端或平末端 的的DNADNA分子分子大腸桿菌大腸桿菌DNADNA連接酶不能連接平末端連接酶不能連接平末端DNAD

30、NA分子分子DNADNA重組技術常用重組技術常用T4T4噬菌體噬菌體DNADNA連接酶連接酶2021/5/2861T4T4噬菌體噬菌體DNADNA連接酶連接帶粘性末端連接酶連接帶粘性末端DNADNA分子的效率分子的效率遠高于連接平末端的遠高于連接平末端的DNADNA分子分子連接反應需要連接反應需要ATPATP、MgMg2+2+和二硫蘇糖醇，最適和二硫蘇糖醇，最適pHpH為為7.27.47.27.4，ATPATP為連接反應提供能量，二硫蘇糖醇為連接反應提供能量，二硫蘇糖醇可提高連接效率可提高連接效率 2021/5/28622021/5/28634.4.用途：用途：連接帶匹配粘端的連接帶匹配粘端的

31、DNADNA分子。分子。使平端的雙鏈使平端的雙鏈DNADNA分子互相連接或與合成分子互相連接或與合成 接頭相連接。接頭相連接。2021/5/28645.5.反應例解：反應例解：（1 1）互補粘端）互補粘端DNADNA( (或切口間的連接或切口間的連接) ) 5 5 ACGACGOHOH pAATTCGT 3pAATTCGT 3 3 TGCTTAAp 3 TGCTTAAp HOHOGCA 5GCA 5 ATPATP、MgMg2+2+ T T4 4連接酶連接酶 55 ACGACGAATTCGT 3AATTCGT 3 33 TGCTTAATGCTTAAGCAGCA 552021/5/2865（2 2

32、）平端連接）平端連接5 5 C G AC G AOG OG p pC G T A 3C G T A 33 G C T3 G C Tp p OHOHG C A T 5G C A T 5 ATPATP、MgMg2+ 2+ T T4 4連接酶連接酶 55 CGACGACGTACGTA 33 33 GCTGCTGCATGCAT 552021/5/28662021/5/2867四、四、T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)(T4 PNK) 催化將催化將ATPATP的的 - -磷酸轉(zhuǎn)移到磷酸轉(zhuǎn)

33、移到DNADNA鏈的鏈的55末端末端2021/5/2868（2 2）交換反應）交換反應過量的過量的ADPADP使使T T4 4多核苷酸激酶將多核苷酸激酶將5-5-末端磷酸從磷酸化的末端磷酸從磷酸化的DNADNA鏈中轉(zhuǎn)移到鏈中轉(zhuǎn)移到ADPADP上生成上生成ATPATP，然后再從然后再從 - -3232PdATPPdATP上將標記上將標記的的 磷酸轉(zhuǎn)移到磷酸轉(zhuǎn)移到DNADNA鏈上，使其重新磷酸化。鏈上，使其重新磷酸化。2021/5/2869用途用途標記標記DNADNA鏈的鏈的55末端末端連接反應連接反應2021/5/2870五、堿性磷酸酶五、堿性磷酸酶alkaline phosphatase (C

34、IAP)alkaline phosphatase (CIAP)1.1.特性：特性： 催化去除催化去除DNADNA、RNARNA和和dNTPdNTP的的55磷酸的反應。磷酸的反應。2.2.分類分類（1 1）細菌堿性磷酸酶（）細菌堿性磷酸酶（BAP)BAP)（2 2）牛小腸堿性磷酸酶（牛小腸堿性磷酸酶（CIP)CIP)3.3.用途用途（1 1）在用）在用T T4 4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶和3232P P標記標記55末端前，去末端前，去除除DNADNA或或RNARNA的的55磷酸。磷酸。（2 2）去除）去除DNADNA片段片段55磷酸以防止自身環(huán)化。磷酸以防止自身環(huán)化。2021/5/287120

35、21/5/2872AGCTTTCGAA2021/5/28732021/5/2874第二節(jié)第二節(jié) 常用載體常用載體二、噬菌體載體三、穿梭載體四、人工染色體一、質(zhì)粒載體2021/5/2875一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體1. 質(zhì)粒載體是應用最廣的載體質(zhì)粒載體是應用最廣的載體2. 2. 質(zhì)粒載體大多是在天然松馳型質(zhì)粒的基礎上經(jīng)質(zhì)粒載體大多是在天然松馳型質(zhì)粒的基礎上經(jīng)人工改造拼接而成人工改造拼接而成3. 3. 這類質(zhì)粒在宿主蛋白質(zhì)合成及染色體復制停止這類質(zhì)粒在宿主蛋白質(zhì)合成及染色體復制停止后尚能繼續(xù)復制。質(zhì)粒擴增時，通過加入氯霉素后尚能繼續(xù)復制。質(zhì)粒擴增時，通過加入氯霉素抑制大腸桿菌蛋白質(zhì)合成，達到進一步提

36、高質(zhì)粒抑制大腸桿菌蛋白質(zhì)合成，達到進一步提高質(zhì)?？截悢?shù)的目的拷貝數(shù)的目的2021/5/2876理想質(zhì)粒載體應具備特點理想質(zhì)粒載體應具備特點1. 1. 松馳型復制子（如松馳型復制子（如ColE1ColE1） 復制子（復制子（repliconreplicon）是質(zhì)粒自我增殖所必需是質(zhì)粒自我增殖所必需2. 2. 幾個單一的酶切位點（或多克隆位點）幾個單一的酶切位點（或多克隆位點） 以便目的以便目的DNADNA片段插入片段插入一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體2021/5/2877一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體3. 3. 插入失活的篩選標記插入失活的篩選標記一般應具有兩種抗菌素抗性標志一般應具有兩種抗菌素抗性標志如氨

37、芐青霉素抗性基因（如氨芐青霉素抗性基因（AmpAmpr r）和四環(huán)素抗性和四環(huán)素抗性基因（基因（TetTetr r）等等4.4.分子量相對較小和較高的拷貝數(shù)分子量相對較小和較高的拷貝數(shù)5.5.缺點：容量較小，一般只能接受小于缺點：容量較小，一般只能接受小于1515kbkb的的DNADNA2021/5/2878一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體(plasmidvector)（一） pBR322質(zhì)粒載體 （二） pUC質(zhì)粒載體系列2021/5/2879（一） pBR322質(zhì)粒載體pBR322pBR322載體是最早被廣泛應用克隆的載體之一，至今尚載體是最早被廣泛應用克隆的載體之一，至今尚在使用。在使用。 pB

38、R322pBR322載體的組成載體的組成源于源于ColE1ColE1的派生質(zhì)粒的派生質(zhì)粒pMB1pMB1的復制起始位點（的復制起始位點（oriori）來源于來源于pSF2124pSF2124質(zhì)粒易位子質(zhì)粒易位子Tn3Tn3的的AmpAmpr r來源于來源于pSC101pSC101質(zhì)粒的質(zhì)粒的TetTetr r一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體2021/5/2880pBR322pBR322質(zhì)粒載體和特點質(zhì)粒載體和特點1. 1. 帶有一個復制起始點（帶有一個復制起始點（oriori） 2. 2. 抗生素抗性基因（抗生素抗性基因（AmpAmpr r和和TetTetr r）作選擇標記作選擇標記3. 3. 數(shù)個單

39、一的限制性酶切位點數(shù)個單一的限制性酶切位點 當外源基因插入這些抗性位點時，就分別成為當外源基因插入這些抗性位點時，就分別成為AmpAmp敏感（敏感（AmpsAmps）或或TetTet敏感（敏感（TetsTets），），即插入失活即插入失活一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體2021/5/28814. 4. 較小的分子量較小的分子量 易于自身易于自身DNADNA的純化，而且能有效地克隆的純化，而且能有效地克隆6 6kbkb大大小的外源小的外源DNADNA片段。片段。5. 5. 較高的拷貝數(shù)較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素擴增后，每個細胞達經(jīng)氯霉素擴增后，每個細胞達1000300010003000個拷貝。個拷貝。 一、質(zhì)

40、粒載體一、質(zhì)粒載體2021/5/2882 一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體rrpBR332質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖2021/5/2883（二）（二） pUCpUC質(zhì)粒載體系列質(zhì)粒載體系列w在在pBR322pBR322基礎上改建而成基礎上改建而成 一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體2021/5/2884典型的典型的pUCpUC質(zhì)粒載體有質(zhì)粒載體有4 4個組成部分個組成部分來自來自pBR322 pBR322 質(zhì)粒的復制起始點質(zhì)粒的復制起始點AmpAmpr r基因基因大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZLacZ）的啟動子及的啟動子及其編碼其編碼-肽鏈的肽鏈的DNADNA序列，稱為序列，稱為LacZLacZ

41、基因基因位于位于LacZLacZ基因中靠近基因中靠近5-5-端的一段多克隆位點端的一段多克隆位點區(qū)段，但并未破壞該基因的功能區(qū)段，但并未破壞該基因的功能2021/5/2885pUC系列的優(yōu)越性最通用的大腸桿菌克隆載體之一最通用的大腸桿菌克隆載體之一優(yōu)點優(yōu)點具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)構(gòu)建構(gòu)建pUCpUC系列時僅保留了系列時僅保留了pBR322pBR322的復制子和的復制子和AmpAmpr r具有來自大腸桿菌具有來自大腸桿菌LacZLacZ操縱子的操縱子的LacZLacZ基因，基因，適應于組織化學篩選重組體適應于組織化學篩選重組體 一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體2021

42、/5/2886 一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體rpUC18/pUC19質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)2021/5/2887二、噬菌體載體二、噬菌體載體(phagevector)w噬菌體載體 w粘粒載體稱柯斯質(zhì)粒（cosmid）w單鏈絲狀噬菌體載體 2021/5/2888二、噬菌體載體二、噬菌體載體gt10（插入型）結(jié)構(gòu)插入型）結(jié)構(gòu)2021/5/2889二、噬菌體載體二、噬菌體載體Charon40（替換型）結(jié)構(gòu)替換型）結(jié)構(gòu)75%105%2021/5/2890wCOS位點位點:噬菌體兩端存在噬菌體兩端存在12bp的互補序列的互補序列.w噬菌體載體可以存在兩種生長方式噬菌體載體可以存在兩種生長方式:溶菌性生長溶

43、菌性生長:噬菌體感染宿主后環(huán)化成并大噬菌體感染宿主后環(huán)化成并大量復制裝配成量復制裝配成噬菌體顆粒噬菌體顆粒,最終導致宿主裂解最終導致宿主裂解.溶源性生長溶源性生長:DNA整合到宿主染色體基因組整合到宿主染色體基因組中中,復制遺傳給子代復制遺傳給子代,宿主細胞不破壞宿主細胞不破壞.2021/5/2891二、噬菌體載體二、噬菌體載體r粘粒載體粘粒載體pJB8結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)粘粒載體組成:質(zhì)粒+ 噬菌體連接位點:通過COS位點形成2021/5/2892二、噬菌體載體二、噬菌體載體M13mp18/M13mp19結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)典型絲狀噬菌體典型絲狀噬菌體:M13噬菌體噬菌體主要特點主要特點:單鏈閉單鏈閉環(huán)環(huán)DNA分子

44、分子主要優(yōu)點主要優(yōu)點:可以獲可以獲得和分離大量單鏈得和分離大量單鏈形式的形式的DNA分子分子2021/5/2893三、穿梭載體三、穿梭載體（shuttle vector）w帶有原核和真核細胞的復制起始點w常將真核生物的克隆載體構(gòu)建成穿梭載體，使其先在大腸桿菌中擴增，將目的基因與之構(gòu)成合適的重組體后，再轉(zhuǎn)入真核細胞w若加上適當?shù)恼婧藛幼拥仍?，則成為真核表達載體，能在真核細胞中表達插入載體中的外源基因2021/5/2894三、穿梭載體（三、穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）真核系統(tǒng)載體還必需具備適當?shù)暮Y選標記真核系統(tǒng)載體還必需具備適當?shù)暮Y選標記一種篩選標記是，

45、使用遺傳缺陷型細胞株與載一種篩選標記是，使用遺傳缺陷型細胞株與載體的基因產(chǎn)物互補（如體的基因產(chǎn)物互補（如TKTK基因產(chǎn)物）?；虍a(chǎn)物）。另一種普遍使用的是抗新霉素基因。因此，真另一種普遍使用的是抗新霉素基因。因此，真核克隆載體的構(gòu)成一般由來自噬菌體、質(zhì)粒和核克隆載體的構(gòu)成一般由來自噬菌體、質(zhì)粒和病毒的病毒的DNADNA元件構(gòu)建而成。元件構(gòu)建而成。2021/5/2895三、穿梭載體（三、穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（一）SV40（猿猴病毒）載體2021/5/2896（一）SV40（猿猴病毒）載體 真核表達載體中的調(diào)控元件大都來源于真核表

46、達載體中的調(diào)控元件大都來源于SV40SV40的的調(diào)控順序和復制信號調(diào)控順序和復制信號 用用SV40SV40作為載體有兩種方式作為載體有兩種方式用用SV40 DNASV40 DNA與外源與外源DNADNA構(gòu)建重組子，轉(zhuǎn)染細構(gòu)建重組子，轉(zhuǎn)染細胞后允許細胞形成含外源胞后允許細胞形成含外源DNADNA的病毒顆粒；的病毒顆粒；重組子不包裝成病毒顆粒，而象質(zhì)粒一樣在重組子不包裝成病毒顆粒，而象質(zhì)粒一樣在細胞中復制或整合到染色體組中。細胞中復制或整合到染色體組中。 三、穿梭載體（三、穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）2021/5/2897例：PSVK3質(zhì)粒 wPSVK3PS

47、VK3是一類廣泛適用于哺乳動物細胞系表達外源基是一類廣泛適用于哺乳動物細胞系表達外源基因的穿梭載體。因的穿梭載體。三、穿梭載體（三、穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）2021/5/2898PSVK3PSVK3具有下列構(gòu)件：具有下列構(gòu)件：原核系統(tǒng)構(gòu)件：復制子和絲狀噬菌體復制起始位點原核系統(tǒng)構(gòu)件：復制子和絲狀噬菌體復制起始位點fl;fl;篩選標志（篩選標志（AmpAmpr r）；）；啟動子（啟動子（T7T7啟動子）。啟動子）。真核系統(tǒng)構(gòu)件：真核系統(tǒng)構(gòu)件： SV40SV40復制起始點；復制起始點；SV40SV40早期啟動子早期啟動子RNARNA修飾信號：修飾信號：SV40SV40小小T T抗原拼接信號；抗原拼接信號；SV40SV40早期區(qū)早期區(qū)mRNA polyAmRNA polyA加尾信號。加尾信號。多克隆位點：多克隆位點：SV40SV40啟