基因功能研究方法

1、1基因功能研究方法基因功能研究方法2 隨著生物學(xué)研究在分子水平上的不斷深入和推進(jìn)，越來越多的新基因得以成功克隆，對新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。31. 1. 微陣列分析微陣列分析 微陣列(microarray) 是近年來發(fā)展起來的可用于大規(guī)?？焖贆z測基因差異表達(dá)、基因組表達(dá)譜、DNA 序列多態(tài)性、致病基因或疾病相關(guān)基因的一項(xiàng)研究基因功能的新技術(shù)。它包括cDNA微陣列(cDNA microarray)和DNA芯片。4 原理原理: : 將成千上萬條DNA片段(cDNA、表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag ,EST) 或特異的寡核

2、苷酸片段) 按橫行縱列方式有序點(diǎn)樣在固相支持物上。固相支持物為硝基纖維膜或尼龍膜時(shí)稱為微陣列。固相支持物改為指甲蓋大小的玻片或硅片時(shí)所形成的微陣列就稱為DNA芯片。5 微陣列法分析過程微陣列法分析過程 首先用來自不同生理狀態(tài)和發(fā)育階段的mRNA 作為模板,以放射性同位素或熒光標(biāo)記的dNTP為底物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再用所得cDNA與微陣列或DNA芯片進(jìn)行雜交,然后通過計(jì)算機(jī)對結(jié)果進(jìn)行判讀和處理,這樣就可以知道芯片中哪些基因在細(xì)胞里表達(dá),哪些基因不表達(dá);同樣也可以測知哪些基因的表達(dá)水平高,哪些基因的表達(dá)水平低。6 芯片的制作目前常用的基因芯片制作方法：目前常用的基因芯片制作方法： 接觸點(diǎn)樣法、噴

3、黑法、原位合成法。接觸點(diǎn)樣法、噴黑法、原位合成法。接觸點(diǎn)樣法：接觸點(diǎn)樣法：是將樣品直接點(diǎn)在基體上，其優(yōu)點(diǎn)是儀器結(jié)是將樣品直接點(diǎn)在基體上，其優(yōu)點(diǎn)是儀器結(jié)構(gòu)簡單、容易研制，是一種快速、經(jīng)濟(jì)、多功能的儀器，構(gòu)簡單、容易研制，是一種快速、經(jīng)濟(jì)、多功能的儀器，可以在可以在3.6cm3.6cm2 2面積內(nèi)點(diǎn)上面積內(nèi)點(diǎn)上1000010000個(gè)個(gè)cDNAcDNA。不足之處是每個(gè)。不足之處是每個(gè)樣品都必須合成好、經(jīng)過純化、事先保存的。樣品都必須合成好、經(jīng)過純化、事先保存的。7噴黑法噴黑法: :是以定量供給的方式，通過壓電晶體或其他推進(jìn)是以定量供給的方式，通過壓電晶體或其他推進(jìn)形式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻

4、璃載體上。同樣形式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻璃載體上。同樣需要合成好的純樣品，包括需要合成好的純樣品，包括cDNAcDNA、染色體、染色體DNADNA片段和抗體。片段和抗體。在在 1 c m1 c m2 2面 積 上 可 噴 射面 積 上 可 噴 射 1 0 0 0 01 0 0 0 0 個(gè) 點(diǎn) 。個(gè) 點(diǎn) 。8原位合成法：原位合成法：主要是美國主要是美國AffymetrixAffymetrix公司開發(fā)的寡聚核苷公司開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻酸原位光刻DNADNA合成技術(shù)。合成技術(shù)。采用的采用的技術(shù)原理技術(shù)原理是在合成堿基單體的是在合成堿基單體的55羥基末端連上一個(gè)羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基

5、，利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后逐個(gè)將光敏保護(hù)基，利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后逐個(gè)將55端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。此方法的成完畢。此方法的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長，是合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長，在在1.6cm1.6cm2 2面積上合成面積上合成4040萬組寡核苷酸。萬組寡核苷酸。9信號檢測與結(jié)果分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理10112. 2. 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中,然

6、后觀察該細(xì)胞生物學(xué)行為的變化,從而了解該基因的功能。這是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和是否持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)兩方面因素的影響。主要方法有物理的、化學(xué)的和生物的方法。12 物理方法物理方法1. DNA直接注射法: 是目的基因?qū)氲淖詈唵畏椒? 但注入量有限, 能夠接觸到的細(xì)胞有限,故獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率很低, 多通過腫瘤局部多點(diǎn)注射給藥。2. 顆粒轟擊技術(shù):將目的基因包被金屬以后,利用高壓發(fā)射裝置, 加速包裹目的基因的金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞,從而提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。 13化學(xué)方法化學(xué)方法1.脂質(zhì)體載體：方法具有安全、簡單、低毒、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，適用于注射方法進(jìn)行

7、器官靶向性轉(zhuǎn)移并有一定的轉(zhuǎn)移效率。是除病毒載體轉(zhuǎn)移方法之外的另一種有價(jià)值的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法。 141516172.受體介導(dǎo)法：利用肝細(xì)胞上富含轉(zhuǎn)移因子和糖蛋白受體的特點(diǎn)，人工合成多聚陽離子氨基酸，進(jìn)而連接轉(zhuǎn)移因子(或糖蛋白)和目的基因構(gòu)成復(fù)合物，通過與肝細(xì)胞表面的受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。 優(yōu)點(diǎn):靶向性好，但受體介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡會被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，易被溶酶體降解而造成目的基因表達(dá)時(shí)間短暫，表達(dá)效率低下。利用腺病毒與內(nèi)吞小泡相融合而將其破壞釋放出外源DNA，可提高轉(zhuǎn)化效率。18生物學(xué)方法生物學(xué)方法 ( (主要通過構(gòu)建病毒載體來完成主要通過構(gòu)建病毒載體來完成) )病毒表達(dá)載體病毒表達(dá)載體:以病毒為

8、載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)因其轉(zhuǎn) 染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用。1.逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus，Rv):構(gòu)建簡單，裝載外源基因容量最大達(dá)8kb，整合入宿主細(xì)胞基因組而無病毒蛋白表達(dá)。但僅能感染分裂期細(xì)胞，體外制備滴度較低，且其隨機(jī)整合有引起“插入性突變”的可能。192.腺病毒腺病毒(adenovirus, Adv): 為近年肝細(xì)胞肝癌基因治療中報(bào)告最多的一種病毒載體。裝載外源基因容量最大達(dá)35kb，不整合入宿主細(xì)胞基因組因而避免插入突變的危險(xiǎn)，能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。但易引起宿主免疫反應(yīng)而使轉(zhuǎn)染效率下降。20213. 3. 反義技術(shù)反義技術(shù) 反義技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理,利

9、用人工或生物合成的特異互補(bǔ)的DNA 或RNA 片段(或其修飾產(chǎn)物) 來抑制或封閉目的基因的表達(dá)。包括反義寡核苷酸技術(shù)(Antisense oligonuclerotides , ASON)、反義RNA技術(shù)和核酶(Ribozyme)技術(shù)。223.1 反義寡核苷酸技術(shù) 反義核苷酸是一類經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達(dá)載體表達(dá)的寡核苷酸片段，長度多為15-30個(gè)核苷酸，通過堿基互補(bǔ)原理，干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工乃至輸出和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化等。根據(jù)結(jié)合部位的不同分為反義DNA（asDNA）、反義RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。233.2 反

10、義RNA技術(shù) 反義RNA 技術(shù)是利用基因重組技術(shù),構(gòu)建人工表達(dá)載體,使其離體或體內(nèi)表達(dá)反義RNA ,反義RNA 能與靶mRNA形成較穩(wěn)定的二聚體,從而抑制靶基因的表達(dá)。其作用機(jī)理可能在DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯多水平上抑制靶基因的表達(dá)。24 3.3 核酶技術(shù) 核酶(Ribozyme) 技術(shù)是一類具催化活性的特殊RNA 分子,通過堿基配對原則特異性滅活靶RNA 分子?？闪呀馀c其互補(bǔ)的mRNA及在DNA內(nèi)插入DNA片段構(gòu)成三鏈結(jié)構(gòu)，單個(gè)核酶分子可以結(jié)合多個(gè)mRNA 分子并使之在特定部位斷裂,而其本身具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),不易受RNase 攻擊,因而催化效率比反義RNA 高。常見的核酶有錘頭狀、發(fā)夾狀

11、和斧頭狀三種,應(yīng)用最多的是錘頭狀核酶。25 最常用的為反義寡脫氧核苷酸（反義寡核苷酸），其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性（堿基互補(bǔ)）、設(shè)計(jì)容易、多樣且合成簡單及高度的局部性和針對性。26 反義義技術(shù)術(shù)的兩種兩種技術(shù)術(shù)路線線將表達(dá)與體內(nèi)基因或?qū)⒈磉_(dá)與體內(nèi)基因或mRNAmRNA互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)入互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的體內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的mRNAmRNA失活，失活，從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)體外合成體外合成mRNAmRNA互補(bǔ)的核苷酸類似物，通過靜脈互補(bǔ)的核苷酸類似物，通過靜脈注射等途徑進(jìn)入細(xì)胞，特異性的與目標(biāo)注射等途徑進(jìn)入細(xì)胞，特異性的與目

12、標(biāo)mRNAmRNA作作用用27反義寡聚核苷酸與mRNA特異性結(jié)合，阻斷翻譯過程284.4.基因敲除和敲入基因敲除和敲入4.1 基因敲除( Gene knockout ) 又稱基因打靶 (genetargeting) ,是同源重組技術(shù)的形象說法。通過一定的途徑使特定的基因失活或缺失的技術(shù)。它是指用外源DNA 與受體細(xì)胞基因組中順序相同或者非常相近的基因發(fā)生同源重組,整合到受體細(xì)胞基因組中并得到表達(dá)的一種外源DNA 導(dǎo)入技術(shù)。29 優(yōu)點(diǎn)：此技術(shù)整合位點(diǎn)確定、精確,轉(zhuǎn)移基因頻率較高,既可以用正?；蚯贸蛔兊幕?以進(jìn)行性狀的改良和遺傳病的治療;又可以用突變的基因敲除正常的基因,以研究此基因在發(fā)育和

13、調(diào)控方面的作用。30目前利用基因敲除得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的程序可簡述如下目前利用基因敲除得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的程序可簡述如下: : (1) 克隆基因組中某一基因的全部或部分DNA 序列, 用插入、刪除、置換、修飾等手段重建DNA 序列,使之成為靶載體; (2) 將靶載體導(dǎo)入小鼠的胚胎干細(xì)胞中,使外源DNA 與胚胎干細(xì)胞基因組相應(yīng)部分發(fā)生同源重組,將靶載體的DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中; 31 (3) 將胚胎干細(xì)胞受體細(xì)胞注入小鼠的囊胚,將這些囊胚導(dǎo)入假孕母鼠子宮中,產(chǎn)生的雄性嵌合鼠子代與正常的雌鼠交配即可獲得生殖系統(tǒng)攜帶該基因的純合鼠,進(jìn)而分析被剔除基因的功能。32334.2 基因敲入基因敲入 基因敲除

14、技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的強(qiáng)有力手段,但對于許多基因來說,簡單的失活常導(dǎo)致令人費(fèi)解的無改變的表型。最常見的解釋是某些其它基因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中證明這一點(diǎn)十分困難。基因敲入即通過基因打靶用一種基因替換另一種基因以確定它們是否具有相同功能。34 基因敲入的設(shè)計(jì),是一個(gè)類似于普通基因敲除法的一步同源重組過程。不同之處在于,設(shè)計(jì)打靶載體時(shí)需將靶基因第一個(gè)外顯子的N-端序列缺失,并將新的替換基因置于靶基因的調(diào)控序列之下,使其能精確地按照靶基因的調(diào)控模式表達(dá)。此方法不僅能用一種基因置換另一種基因,且可以系統(tǒng)地改變基因的結(jié)構(gòu),分析其蛋白產(chǎn)物各功能區(qū)的作用。356.6.人工染色體的轉(zhuǎn)

15、導(dǎo)人工染色體的轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行蛋白功能分析和基因表達(dá)調(diào)控的有力手段,但使用小的質(zhì)粒重組體存在表達(dá)水平低、缺乏組織特異性等缺點(diǎn),若將大的DNA片段克隆入酵母人工染色體( YACs)或細(xì)菌染色體，可產(chǎn)生較好的表達(dá)水平和組織特異性,并可精確地調(diào)節(jié)同源重組。36酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。此外，YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。37 YAC DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法主要有核注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)和酵母原生質(zhì)體融合等。采用

16、YAC 轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的方式可使導(dǎo)入基因的水平與內(nèi)源基因相當(dāng),并且具有類似于天然的剪接機(jī)理,適用于復(fù)雜的基因功能分析。3839酵母人工染色體酵母人工染色體( (適用于克隆大片段適用于克隆大片段DNA，0.22Mb。) )40YAC YAC 要具備的主要功能成份要具備的主要功能成份 1 1）著絲粒：著絲粒：mitosismitosis姊妹染色單體和減姊妹染色單體和減I I同源染色同源染色體分離之必需。體分離之必需。2 2）端粒：端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲。保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲。3 3）自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（ARSARS）元件：）元件：是染色體自主復(fù)制是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)

17、。的復(fù)制起點(diǎn)。構(gòu)建構(gòu)建YACYAC需要需要4 4個(gè)短序列：個(gè)短序列：2 2個(gè)端粒，著絲粒，個(gè)端粒，著絲粒，ARSARS元元件，與外源件，與外源DNADNA連接成線性連接成線性DNADNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆?？寺　?417.7.基因誘捕技術(shù)基因誘捕技術(shù) 基因誘捕是通過物理、化學(xué)、生物等方法將一個(gè)帶有外源基因如抗藥基因或報(bào)告基因的DNA 載體導(dǎo)入到ES 細(xì)胞中. 外源基因通過捕獲到的內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控元件獲得表達(dá)的同時(shí), 使內(nèi)源的基因功能喪失. 利用cDNA 末端快速擴(kuò)增法( rapidamplification of cDNA ends , RACE) 或者質(zhì)粒拯救法可以獲知

18、外源基因整合位點(diǎn)旁側(cè)的序列. 通過顯微注射或ES 細(xì)胞融合技術(shù)可以獲得特定基因缺失的動(dòng)物用于功能研究.428.8.新的晶體解析方法新的晶體解析方法 結(jié)合已建立的大規(guī)模蛋白原核分泌表達(dá)與純化技術(shù)系統(tǒng),將對大量新基因編碼蛋白進(jìn)行晶體培養(yǎng)，通過計(jì)算機(jī)分析,以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因功能的方法。43 目前已成功制備了耐熱鄰苯二酚2 ,3-雙加氧酶、耐熱堿性磷酸酯酶的蛋白質(zhì)晶體,并收集了X-衍射數(shù)據(jù). 在國內(nèi)首次獲得了硒化耐熱鄰苯二酚2 ,3-雙加氧酶的晶體,在日本的同步輻射光源上收集了3 個(gè)波長的分辨率為2. 0 的衍射數(shù)據(jù)。另外,耐熱堿性磷酸酯酶的多對同晶置換法的結(jié)構(gòu)解析也在進(jìn)行之中.通過計(jì)算機(jī)分析,對

19、不同來源的木糖異構(gòu)酶的( G+ C) %與蛋白質(zhì)耐熱性之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。44 發(fā)現(xiàn)精氨酸和一些疏水氨基酸的含量與編碼序列的( G + C) %表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性,這個(gè)發(fā)現(xiàn)揭示了蛋白熱穩(wěn)定性與DNA 熱穩(wěn)定性相一致的內(nèi)在規(guī)律,闡明了高( G+ C) %的生物適合于高溫環(huán)境的機(jī)制。459 9 基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究究 細(xì)胞各種基本功能的完成離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。 因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子，也是研究新基因功能的一個(gè)十分重要的方面。 目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基于親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和近年來建立和廣泛應(yīng)用的酵母雙雜交系統(tǒng)等。46免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀技術(shù) 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。 該方法的優(yōu)點(diǎn)是：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，所處的環(huán)境條件也是接近天然狀態(tài)的，能夠反映體內(nèi)的相互作用情況，也可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物，但應(yīng)該注意，有時(shí)免疫共沉淀的蛋白質(zhì)并非是直接相互作用，而是間接的相互作用，其靈敏度也相對較低。47酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)是一種基于轉(zhuǎn)錄重建而建立的研究生物大分子相互作用的簡便而有效的研究方法。