3酶的分離純化

1、l將酶從細胞或發(fā)酵液中取將酶從細胞或發(fā)酵液中取出，再與雜質分開，獲得出，再與雜質分開，獲得所需的酶產品。所需的酶產品。l酶的分離純化工作酶的分離純化工作, ,是酶學是酶學研究的基礎研究的基礎. .l酶的純化過程就目前而言酶的純化過程就目前而言, ,還是門實驗科學還是門實驗科學. .酶的純化過程與一般蛋白純酶的純化過程與一般蛋白純化過程相比有本身獨有的特化過程相比有本身獨有的特點點: :一是特定的一種酶在細胞一是特定的一種酶在細胞中含量很少中含量很少; ;二是酶可通過測二是酶可通過測定活力的方法加以跟蹤定活力的方法加以跟蹤. .1 1、建立一個可靠和快速的測活方法；、建立一個可靠和快速的測活方法

2、；2 2、酶原料的選擇；、酶原料的選擇；3 3、酶的提?。?、酶的提取；4 4、酶的提純；、酶的提純；5 5、酶的純度檢驗。、酶的純度檢驗。酶分離純化的一般原則酶分離純化的一般原則: :第一節(jié)第一節(jié) 細胞破碎細胞破碎（link)link)第二節(jié)第二節(jié) 酶的提取酶的提取 ( (link)link)第三節(jié)第三節(jié) 沉淀分離沉淀分離( (link) link) 第四節(jié)第四節(jié) 離心分離離心分離第五節(jié)第五節(jié) 過濾與膜分離過濾與膜分離 第六節(jié)第六節(jié) 層析分離層析分離第七節(jié)第七節(jié) 電泳分離電泳分離 第八節(jié)萃取分離第八節(jié)萃取分離 第九節(jié)第九節(jié) 酶的結晶酶的結晶 第十節(jié)第十節(jié) 濃縮與干燥濃縮與干燥本章主要內容本章主

3、要內容: :gov一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎?；蛴贸暡ㄌ幚砥扑椤植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般常用與石英砂和適當?shù)牡任镔|組成的細胞壁，一般常用與石英砂和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能提取液一起研磨的方法破碎或用纖維素酶處理也能達到目的。達到目的。v細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細胞壁的細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽

4、聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。糖）。l細胞的破碎方法：細胞的破碎方法：l一、機械破碎法一、機械破碎法 l二、物理破碎法二、物理破碎法 l三、化學破碎法三、化學破碎法 l四、酶學破碎法四、酶學破碎法 backl原理：機械運動所產生的剪力作用于細胞原理：機械運動所產生的剪力作用于細胞l1 1 機械搗碎法：搗碎機，機械搗碎法：搗碎機，10000rpm10000rpm，實驗、生產規(guī)模，實驗、生產規(guī)模 均可均可l2 2 研磨法：研缽、石磨、球磨

5、、細菌磨等研磨器械，研磨法：研缽、石磨、球磨、細菌磨等研磨器械， 效率較低效率較低l3 3 勻漿法：勻漿器，用于顆粒細小的組織細胞勻漿法：勻漿器，用于顆粒細小的組織細胞 破碎程度高。對酶破碎少，難于工業(yè)化。破碎程度高。對酶破碎少，難于工業(yè)化。back一、機械破碎法一、機械破碎法包括包括: :1 1、溫度差破碎法、溫度差破碎法; ;2 2、壓力差破碎法、壓力差破碎法; ;3 3、超聲波破碎法、超聲波破碎法; ;二、物理破碎法二、物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細胞破碎素的作用使組織細胞破碎1、溫度差破碎法、溫度差破碎法冷凍冷凍 高溫，用于脆

6、弱易破菌，難以工業(yè)化高溫，用于脆弱易破菌，難以工業(yè)化; ;于冷藏庫或干冰反復于零下于冷藏庫或干冰反復于零下15152020使之凍固，然后緩慢使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片由于滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結變性。脂蛋白凍結變性。 或或: :將材料投入沸水中，于將材料投入沸水中，于9090左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰左右維持數(shù)分鐘，立即

7、置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。 2、壓力差破碎法、壓力差破碎法高壓沖擊法高壓沖擊法用活塞或沖擊錘加高壓沖擊菌體細胞和冰晶石英用活塞或沖擊錘加高壓沖擊菌體細胞和冰晶石英沙等混合物。沙等混合物。突然降壓法突然降壓法加壓至加壓至30mp30mp以上，打開出口閥突然降為常壓以上，打開出口閥突然降為常壓爆破性減壓法爆破性減壓法用氮氣或二氧化碳充壓至幾十至幾百大氣壓。用氮氣或二氧化碳充壓至幾十至幾百大氣壓。滲透壓差法滲透壓差法利用滲透壓的變化而使細胞破碎，常用于從海洋利用滲透壓的變化而使細胞破碎，常用于從海洋微生物中提取某些酶。微生物中提取某些酶。頻率頻

8、率 1020khz1020khz，功率，功率100150w100150w，溫度，溫度010010o oc c， ph47ph47，時間，時間310min310min，間隔多，間隔多次次; ;對數(shù)生長期細胞，細胞濃度和溶液粘對數(shù)生長期細胞，細胞濃度和溶液粘度不宜太高。暴露于度不宜太高。暴露于9 910khz10khz聲波或聲波或1010500khz500khz超聲波所產生的機械振動，只要有超聲波所產生的機械振動，只要有設備該法方便設備該法方便. .且效果也好，但一次處理且效果也好，但一次處理量較小量較小; ;應用超聲波處理時應注意避免溶應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在液中氣泡的存在;

9、;處理一些超聲波敏感的處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。蛋白質酶時宜慎重。3、超聲波破碎法、超聲波破碎法在超聲波的作用下，細胞膜由于空穴作用而破碎。破壞程在超聲波的作用下，細胞膜由于空穴作用而破碎。破壞程度與輸出功率、破碎時間密切相關，與頻率關系不大度與輸出功率、破碎時間密切相關，與頻率關系不大。操作條件操作條件back三、化學破碎法三、化學破碎法應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結構改變或破壞。構改變或破壞。有機溶劑（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使細胞膜的磷脂有機溶劑（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的

10、透過性，再經提取可使膜結合酶結構破壞，從而改變細胞膜的透過性，再經提取可使膜結合酶或胞內酶等釋出胞外?；虬麅让傅柔尦霭?。 1、有機溶液、有機溶液粉碎后的新鮮材料在粉碎后的新鮮材料在00以下加入以下加入5 51010倍量的丙酮，迅速倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙白質一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。醚洗，經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。操作操作表面活性劑表面活性劑( (溶于液體后，具有使

11、表面張力顯著降低作用的物質溶于液體后，具有使表面張力顯著降低作用的物質)和和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細胞膜結構細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細胞膜結構破壞，增加膜的透過性。破壞，增加膜的透過性。離子型表面活性劑會使酶的結構破壞，不用之。離子型表面活性劑會使酶的結構破壞，不用之。常用的非離子型表面活性劑為：常用的非離子型表面活性劑為： triton(triton(辛基酚聚氧乙烯醚辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚 ); tween( tween(聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐酯酯,吐溫吐溫,聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸三硬脂酸酯酯 ) )用凝膠層析

12、等方法除去表面活性劑，以便酶的進一用凝膠層析等方法除去表面活性劑，以便酶的進一步純化。對膜結合酶的提取特別有效。步純化。對膜結合酶的提取特別有效。2、表面活性劑、表面活性劑back四、酶學破碎法四、酶學破碎法在一定條件下，通過外加的酶或細胞本身存在的酶在一定條件下，通過外加的酶或細胞本身存在的酶的作用，使細胞破碎。的作用，使細胞破碎。簡單原理簡單原理: :溶菌酶處理時，它能水解構成枯草溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1、外加酶、外加酶1g1g菌體加菌

13、體加1 110mg10mg溶菌酶，溶菌酶， ph6.2ph6.27.01h7.01h內完全溶菌。于生內完全溶菌。于生理食鹽水或理食鹽水或0.2mol0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形質沒有脫出。質沒有脫出。蝸牛酶及纖維素酶蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。也常被選為破壞細菌及植物細胞用。革蘭氏陽性菌：細胞結構和形狀依賴于壁上的肽多糖，革蘭氏陽性菌：細胞結構和形狀依賴于壁上的肽多糖，溶菌溶菌酶酶能專一性作用于肽多糖的能專一性作用于肽多糖的-1-1，4-4-糖苷鍵。糖苷鍵。革蘭氏陰性菌：除了革蘭氏陰性菌：除了溶菌酶外，另加溶菌酶外，另

14、加edtaedta才有效。才有效。酵母：其細胞壁的主要成分是酵母：其細胞壁的主要成分是-1-1，3-3-葡聚糖，需加葡聚糖，需加-葡聚葡聚糖酶糖酶；霉菌：其細胞壁含有幾丁質，可用霉菌：其細胞壁含有幾丁質，可用幾丁質酶幾丁質酶；植物細胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。植物細胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。將待破碎的鮮材料在一定將待破碎的鮮材料在一定phph和適當?shù)臏囟认?，利用自身的蛋和適當?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。

15、于溫室污染。于溫室3030左右較早溶化。左右較早溶化。自體融解過程中自體融解過程中phph顯著變化，隨時要調節(jié)顯著變化，隨時要調節(jié)phph。自溶溫度選在自溶溫度選在0 044，因自溶時間較長，不易控制，所以制，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質時較少用。備活性蛋白質時較少用。適宜的自溶條件：溫度、適宜的自溶條件：溫度、phph值、離子強度等值、離子強度等加入噬菌體感染細胞加入噬菌體感染細胞電離輻謝電離輻謝2、自溶法、自溶法backl是指在一定條件下，用適當?shù)娜軇┨幚砗冈?，是指在一定條件下，用適當?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。也稱酶的抽提。使酶充分溶解到溶劑中的過

16、程。也稱酶的抽提。l目的目的: 讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞l大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。因此蛋白質的提取一般以水為主。l稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶度大，稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質的最常用溶劑。也是提取蛋白質的最常用溶劑。 鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象: :在一定濃度的鹽存在下在一定濃度的鹽存在下, ,酶的溶解度增加酶的溶解度增加. .鹽析

17、現(xiàn)象鹽析現(xiàn)象: :當鹽的濃度太高當鹽的濃度太高, ,蛋白的濃度反而下降蛋白的濃度反而下降, ,從溶液中析出從溶液中析出. .一般采用稀鹽溶液，一般采用稀鹽溶液，0.020.05mol/l0.020.05mol/l。 等滲鹽溶液尤以等滲鹽溶液尤以0.020.020.05mol/l0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和碳酸磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。鹽緩沖液常用。0.15mol/l0.15mol/l氯化鈉溶液應用也較多。如氯化鈉溶液應用也較多。如6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶用磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/l0.1mol/l碳酸氫鈉液提取等。碳酸氫鈉液提取等。一、酶提取的主要方法一、酶提取的主要方法1、

18、鹽溶液提取、鹽溶液提取蛋白質提取液的蛋白質提取液的phph值首先應保證在蛋白質穩(wěn)定的范值首先應保證在蛋白質穩(wěn)定的范圍內，即選擇在偏離等電點兩側。圍內，即選擇在偏離等電點兩側。如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏堿一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。堿一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。液提取。 2、酸溶液提取、堿溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取原則：原則：如細胞色素如細胞色素c c屬堿性蛋白質，常用稀酸提取；屬堿性蛋白質，常用稀酸提??；

19、肌肉甘油醛肌肉甘油醛-3-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿提??；提??；某些蛋白質或酶與其分物質結合常以離子鍵形式某些蛋白質或酶與其分物質結合常以離子鍵形式存在，選擇存在，選擇ph3ph36 6范圍對于分離提取是有利的。范圍對于分離提取是有利的。與脂質結合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶需用有機與脂質結合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶需用有機溶劑提取。溶劑提取。有機溶劑提取用于提取蛋白質的實例至今是不多的。一些和脂有機溶劑提取用于提取蛋白質的實例至今是不多的。一些和脂結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋

20、白質，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取?；蛳A液中，可用不同比例的有機溶劑提取。例例:從一些粒線體（從一些粒線體（mitochondria)mitochondria)及微粒體（及微粒體（microsome)microsome)等含多量等含多量脂質物質中提取蛋白質時，采用脂質物質中提取蛋白質時，采用mortonmorton的丁醇法效果較好。的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與因丁醇使蛋白質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與水也能溶解水也能溶解10%10%，因此具有脂質與水之間的表面活性作用，可占，因此具有脂質與水之間的表面活性作用，可

21、占據(jù)蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂質的再結合，使據(jù)蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂質的再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。蛋白質在水中溶解能力大大增加。3、有機溶劑提取、有機溶劑提取二、影響酶提取的主要因素二、影響酶提取的主要因素1、溫度、溫度為了防止酶變性失活，溫度不宜高；為了防止酶變性失活，溫度不宜高；多數(shù)酶的提取溫度在多數(shù)酶的提取溫度在55以下；以下；耐溫較高的酶可適當提高溫度，以提高酶溶解度和擴散速率。耐溫較高的酶可適當提高溫度，以提高酶溶解度和擴散速率。少數(shù)對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜少數(shù)對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變

22、性分離且也有利于提取和進一步純化。蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37375050條件下提取，條件下提取，效果比低溫提取更好。效果比低溫提取更好。2 2、phph值值為了防止酶的變性，為了防止酶的變性，phph不宜過高或過低；溶液的不宜過高或過低；溶液的phph值應遠離酶的等電點，以增加酶的溶解度。值應遠離酶的等電點，以增加酶的溶解度。3 3、提取液的體積、提取液的體積提取液的用量增加，可提高提取率；提取液的用量增加，可提高提取率；過量，酶濃度降低，不利進一步純化。過量，酶濃度降低，不利進一步純化。l從細胞中提取得到的

23、生物大分子往往是不從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質，必須進一步分離純凈的，含有大量雜質，必須進一步分離純化，這一階段可分為純化，這一階段可分為粗分級分離和細分粗分級分離和細分級分離級分離兩步進行。兩步進行。l蛋白質分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特蛋白質分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。 性質性質 方法方法v分子大小分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾v 溶解度溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀等電點沉淀、

24、鹽析、有機溶劑沉淀v電荷電荷 電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析v吸附性質吸附性質 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）v對配體分子對配體分子 親和層析親和層析 的生物親和力的生物親和力主要是利用主要是利用鹽析鹽析法、等電點法、等電點沉淀沉淀、有機溶劑、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低但分辨率低.1 1、粗分級分離、粗分級分離l一般蛋白質

25、樣品經粗制分級后，體積較小，雜一般蛋白質樣品經粗制分級后，體積較小，雜質大部分被除去。進一步提純，通常使用高分質大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的辨率的柱層析及電泳柱層析及電泳方法。方法。l常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。析、疏水吸附層析、親和層析。l常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。聚焦電泳。l另外，結晶也是蛋白質分離純化的方法之一，另外，結晶也是蛋白質分離純化的方法之一，制備的結晶物常常作為蛋白質結構分析之用。制備的結晶物常常作為蛋白質結構分析之用。

26、back改變某些條件，使溶液中某種溶質溶解度降低，改變某些條件，使溶液中某種溶質溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達到與其它溶質分離。從而從溶液中沉淀析出，達到與其它溶質分離。是酶分離純化常用的方法之一。是酶分離純化常用的方法之一。其本質是降低溶液的溶解度。其本質是降低溶液的溶解度。方法有鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、方法有鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、復合沉淀等復合沉淀等,表表4-3.在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質和酶因溶解度各不相同在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質和酶因溶解度各不相同而分離。而分離。鹽為什么會改變蛋白酶的溶解度？鹽為什么會改變蛋白酶的溶解度？鹽在溶液中離解

27、為正負離子，反離子作用改變蛋白酶分子表面鹽在溶液中離解為正負離子，反離子作用改變蛋白酶分子表面的電荷；同時離子存在改變水活度使分子表面水化膜改變。的電荷；同時離子存在改變水活度使分子表面水化膜改變。一、鹽析沉淀法一、鹽析沉淀法鹽溶是加鹽使蛋白質融入水中，鹽析是加鹽使蛋白質鹽溶是加鹽使蛋白質融入水中，鹽析是加鹽使蛋白質沉淀出來。兩者所加的鹽類不同，其作用機制也毫無關系。沉淀出來。兩者所加的鹽類不同，其作用機制也毫無關系。 在低鹽濃度下在低鹽濃度下, ,蛋白質和酶溶解度隨鹽濃度升高而增加蛋白質和酶溶解度隨鹽濃度升高而增加鹽溶鹽溶鹽析鹽析鹽濃度升高到一定濃度后鹽濃度升高到一定濃度后, ,蛋白酶的溶解

28、度又隨蛋白酶的溶解度又隨著鹽濃度升高而減少著鹽濃度升高而減少, ,蛋白酶沉淀析出蛋白酶沉淀析出. .一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水籠一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間的吸無法有效隔離蛋白質的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間的吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非極性區(qū)域，引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非極性區(qū)域，就越容易用硫酸銨沉淀下來。就越容易用硫酸銨沉淀下來。式中：式中：s s、soso：蛋白質或酶在離子強度為：蛋白質或酶在離子強度為i i和和0 0時的溶解度（時的溶解度（g/

29、lg/l）ksks：鹽析常數(shù)，取決于鹽的性質和酶的結構：鹽析常數(shù)，取決于鹽的性質和酶的結構i i：離子強度：離子強度, ,與離子濃度與離子濃度m mi i和離子價數(shù)和離子價數(shù)z zi i有關。有關。 i=1/2mi=1/2mi iz zi i2 2酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度的關系式：酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度的關系式：蛋白質和酶在溶液中的溶解度與蛋白質和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度有密切的關系溶液中的離子強度有密切的關系=logso =logso ：取決于酶的性質，也與溫度和：取決于酶的性質，也與溫度和phph有關。有關。ksks：主要取決于鹽性質。與離子價數(shù)成正比

30、，與離子半徑與溶：主要取決于鹽性質。與離子價數(shù)成正比，與離子半徑與溶液介電常數(shù)成反比。液介電常數(shù)成反比。與與ksks確定后，蛋白酶溶解度決定于確定后，蛋白酶溶解度決定于i iksks分段鹽析分段鹽析: : t t、phph一定下改變離子強度一定下改變離子強度分段鹽析分段鹽析: : 一定鹽和離子強度下，改變一定鹽和離子強度下，改變t t、phph常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。磷酸鈉等。鹽析所需添加飽和硫酸銨體積式：鹽析所需添加飽和硫酸銨體積式：溫度和溫度和phph一定時，一定時，soso為常數(shù)，為常數(shù)，l

31、 不同的蛋白質分子，由于其分子表面的極不同的蛋白質分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調節(jié)蛋白質的中鹽濃度，可以使一樣，因此調節(jié)蛋白質的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質分別沉淀。如：不同的蛋白質分別沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(nh(nh4 4) )2 2soso4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出分段鹽析分段鹽析l常用的鹽析劑是硫酸銨，因為它的鹽析能力強，常用的鹽析劑是硫酸銨，因為它的鹽析能力強，在水中的溶解度大，價

32、格便宜，濃度高時也不在水中的溶解度大，價格便宜，濃度高時也不會引起蛋白質活性喪失。會引起蛋白質活性喪失。 鹽析沉淀的蛋白質仍保持天然構象，即仍有活鹽析沉淀的蛋白質仍保持天然構象，即仍有活性。性。l蛋白質用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才蛋白質用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進一步精提純。脫鹽常用能進一步精提純。脫鹽常用透析法透析法。 透析透析是將含有小分子雜質是將含有小分子雜質的蛋白質溶液裝在半透膜（的蛋白質溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水中進行，析袋里放在蒸餾水中進行，可不斷更換蒸餾水，直至雜可不斷更換蒸餾水，直至雜質被除去。質被除去。透析

33、袋透析袋蛋白質溶液蛋白質溶液蒸餾水蒸餾水利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質（如酶、蛋白質、氨基酸等）具有不的兩性電解質（如酶、蛋白質、氨基酸等）具有不同的等電點這一特性進行分離純化的方法。同的等電點這一特性進行分離純化的方法。等電點時，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白等電點時，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白質仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶質仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶液中除雜和與其它方法聯(lián)系使用。液中除雜和與其它方法聯(lián)系使用。二、等電點沉淀法二、等電點沉淀法圖圖例例 介電常數(shù)介電常數(shù) 溶質分子之間

34、的引力溶質分子之間的引力 溶解度溶解度有機溶劑有機溶劑 溶質分子周圍的水膜破壞溶質分子周圍的水膜破壞 酶和蛋白質的氫鍵破壞酶和蛋白質的氫鍵破壞 空間結構變化空間結構變化 形成疏水層形成疏水層三、有機溶劑的沉淀法三、有機溶劑的沉淀法利用酶等物質在有機溶液中的溶解度不同而使之分離的方法。利用酶等物質在有機溶液中的溶解度不同而使之分離的方法。介電常數(shù)介電常數(shù)permittivity permittivity 亦稱相對電容率。是指在同一容器亦稱相對電容率。是指在同一容器中用某一物質為電介質和真空時的電容的比值。介電常數(shù)通常中用某一物質為電介質和真空時的電容的比值。介電常數(shù)通常隨溫度和介質中傳播的電磁波

35、的頻率而變。電介質的介電常數(shù)隨溫度和介質中傳播的電磁波的頻率而變。電介質的介電常數(shù)越大，極化能力越強；介電常數(shù)越小，絕緣性能越好。用越大，極化能力越強；介電常數(shù)越小，絕緣性能越好。用rr表示表示 （1 1）所析出酶沉淀比鹽析法析出的易于）所析出酶沉淀比鹽析法析出的易于 離心分離或過濾；離心分離或過濾；（2 2）不含無機鹽，適于食品工業(yè)用酶制）不含無機鹽，適于食品工業(yè)用酶制 劑的制備；劑的制備；（3 3）易于除去或回收。）易于除去或回收。 優(yōu)點：優(yōu)點：缺點：缺點：易于引起酶的變性失活，需低溫操作和沉淀易于引起酶的變性失活，需低溫操作和沉淀析出后盡快分離。析出后盡快分離。酶酶+ +酶沉淀劑酶沉淀劑

36、 復合物沉淀復合物沉淀 分離分離 從復合物中析出酶從復合物中析出酶 四、復合沉淀法四、復合沉淀法常用的酶沉淀劑：常用的酶沉淀劑： 單寧（加入量為酶液的單寧（加入量為酶液的0.11%0.11%。）。） 聚丙烯酸（聚丙烯酸（3040%3040%）等高分子聚合物）等高分子聚合物l使雜蛋白變性沉淀，而酶不受影響；使雜蛋白變性沉淀，而酶不受影響；l熱穩(wěn)定性好的，可進行熱處理；熱穩(wěn)定性好的，可進行熱處理；l改變改變phph或加入某些金屬離子使雜蛋白除去；或加入某些金屬離子使雜蛋白除去；back離心：借助離心機旋轉所產生的離心力，使不同大離心：借助離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小、密度的物質分離的技術；

37、小、密度的物質分離的技術；要根據(jù)欲分離物質及雜質的大小、密度和特性的不要根據(jù)欲分離物質及雜質的大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。1 1、常速離心機、常速離心機 最大轉速最大轉速8000rpm(r/min),8000rpm(r/min),相對離心力相對離心力(rcf)10(rcf)104 4g g以下以下, ,用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等分離；用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等分離；2 2、高速（冷凍）離心機、高速（冷凍）離心機 1 110104 4-2.5-2.510104 4rpmrpm，相對離心力，相對離心力10104

38、 410105 5g,g,用于沉淀、細胞器等分離；用于沉淀、細胞器等分離；3 3、超速離心機、超速離心機 轉速轉速2.5-82.5-810104 4rpmrpm，相對離心力，相對離心力5 5* *10105 5g g；用；用于于dnadna、rnarna蛋白質及細胞器病毒分離純化；檢測純度；沉降蛋白質及細胞器病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。系數(shù)和相對分子量測定等。l分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機裝有光學檢測系統(tǒng)、自動記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；裝有光學檢測系統(tǒng)、自動記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；一、離心機的種類

39、與用途一、離心機的種類與用途臺式高、臺式高、超速離心超速離心機機0.6-10萬萬轉轉/分以上分以上離心機離心機制備性制備性分析性分析性分析性超速離心機分析性超速離心機普通離心機普通離心機冰凍離心機冰凍離心機臺式（或地臺式（或地面式）普通面式）普通離心機離心機大容量冰大容量冰凍離心機凍離心機小于小于0.6萬萬轉轉/分分高速冰凍高速冰凍離心機離心機0.6-2.5萬萬超速冰凍超速冰凍離心機離心機2.5-8萬或萬或更高更高( (分析性超速離心主要用于分析性超速離心主要用于檢測大分子物質的沉降特檢測大分子物質的沉降特征和結構等征和結構等) )概述概述所分離的顆粒大小和密度相差較大所分離的顆粒大小和密度相

40、差較大: :常速、高速離心常速、高速離心; ;若從樣品液中分離若從樣品液中分離2 2種以上大小和密度不同的顆粒：差速離心種以上大小和密度不同的顆粒：差速離心; ;超速離心超速離心: :差速離心法和密度梯度離心法，后者又分速率區(qū)帶離差速離心法和密度梯度離心法，后者又分速率區(qū)帶離心和等密度離心。心和等密度離心。二、離心方法的選用二、離心方法的選用1、差速離心、差速離心采用不同離心速度與時間，使不同沉降速度的顆采用不同離心速度與時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離；粒分批分離；已破碎的細胞已破碎的細胞 沉淀（細胞核）沉淀（細胞核） 上清液上清液 沉淀（細胞膜碎片、沉淀（細胞膜碎片、線粒體、溶酶體）線粒

41、體、溶酶體） 上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白體）沉淀（核糖核蛋白體） 上清液（可上清液（可溶性組分）溶性組分）500g,1010 000g,10100 000g,3h2、密度梯度離心、密度梯度離心又稱又稱速率速率區(qū)帶離心區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質分離的方法；沉降系數(shù)較接近的物質分離的方法；原理原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。域上形成區(qū)帶的方法。介質梯度應預先形成，介質梯度應預先形成，介質的最大密度要小于所有樣品顆粒的密

42、度。介質的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；度梯度；操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶；度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶；可用來分離核酸、蛋白質、核糖體亞基及其它成分可用來分離核酸、蛋白質、核糖

43、體亞基及其它成分密度升高密度升高3、等密度離心、等密度離心原理原理：當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，在密度梯度介質中，顆粒或向下沉降，或向上浮起，在密度梯度介質中，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶，從而使不同浮力密度的物質得到分離區(qū)帶，從而使不同浮力密度的物質得到分離；區(qū)別區(qū)別:離心介質、密度梯度范圍與密度梯度離心不同，離心介質、密度梯度范圍與密度梯度離心不同，欲分離的顆欲分離的顆粒密度處于離心介質密度范圍內。粒密度處于離心介質密度范圍內。介質有：氯化

44、銫、硫酸銫、溴化銫、三碘苯衍生物等。介質有：氯化銫、硫酸銫、溴化銫、三碘苯衍生物等。操作：介質溶液與樣品液混合均勻，足夠時間離心。操作：介質溶液與樣品液混合均勻，足夠時間離心。介質梯度不需預先制備，離心時把密度均一的介質液和樣品混合后介質梯度不需預先制備，離心時把密度均一的介質液和樣品混合后裝入離心管，裝入離心管，通過離心形成梯度通過離心形成梯度，讓顆粒在梯度中進行再分配。，讓顆粒在梯度中進行再分配。常用來分離提取核酸、亞細胞器和質粒。常用來分離提取核酸、亞細胞器和質粒。密度梯度密度梯度低速離心用低速離心用rpmrpm表示，表示，高速、超高速離心用相對離心力（高速、超高速離心用相對離心力（rc

45、frcf）表示。）表示。三、離心條件的確定三、離心條件的確定1、離心力、離心力離心力離心力離心加速度離心加速度相對離心力相對離心力（rcf）2、離心時間、離心時間不同離心方法，離心時間的概念不同。不同離心方法，離心時間的概念不同。對常數(shù)離心、高速離心、差速離心對常數(shù)離心、高速離心、差速離心, ,指顆粒完全指顆粒完全沉降到離心管底的時間沉降到離心管底的時間, ,沉降時間或澄清時間沉降時間或澄清時間; ;等密度梯度離心等密度梯度離心, ,指顆粒完全到達等密度點時平指顆粒完全到達等密度點時平衡時間，衡時間，平衡時間平衡時間; ;對密度梯度對密度梯度, ,指形成界限分明區(qū)帶的時間，指形成界限分明區(qū)帶的

46、時間，區(qū)帶區(qū)帶形成時間形成時間; ;沉降時間沉降時間沉降系數(shù)已知顆粒沉降系數(shù)已知顆粒效率因子效率因子ks s：沉降系數(shù)；：沉降系數(shù)；:角速度；角速度；r1r1，r2:r2:轉軸中心到液面與管底距離。轉軸中心到液面與管底距離。k k與轉子半徑和轉速有關；與轉子半徑和轉速有關；實際操作中：實際操作中：1 1，某一顆粒，某一顆粒s s定值，故定值，故k k小，小，t t也小，效率高（轉子的選擇）；也小，效率高（轉子的選擇）；2,2,轉子與離心機確定，具體顆粒而言，轉子與離心機確定，具體顆粒而言，2 2t t是常數(shù)，故可調整是常數(shù)，故可調整與與t t得相同效果。得相同效果。指顆粒從樣品液面完全沉降到離

47、心管底所需的時間指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時間; ;決定于沉降速度和沉降距離。決定于沉降速度和沉降距離。一般為一般為4 4o oc c。穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；超高速離心需冷凍。超高速離心需冷凍。phph值應處于酶穩(wěn)定的值應處于酶穩(wěn)定的phph范圍。范圍。3、溫度和、溫度和ph值值過濾過濾 借助過濾介質將大小不同，形狀不同的物借助過濾介質將大小不同，形狀不同的物質分離的技術質分離的技術介質有濾紙、纖維、陶瓷、高分子膜等。介質有濾紙、纖維、陶瓷、高分子膜等。以膜為過濾介質的過濾稱以膜為過濾介質的過濾稱膜分離膜分離技術；技術；微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析都

48、屬微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析都屬于膜分離技術于膜分離技術表表4-4 過濾的分類與特性（過濾的分類與特性（p112） 類別類別 截留的顆粒大小截留的顆粒大小 主要物質主要物質 過濾介質過濾介質粗濾粗濾2um2um酵母、霉菌、動植物細酵母、霉菌、動植物細胞、固形物胞、固形物濾紙、濾布、纖濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷維、多孔陶瓷微濾微濾0.22um0.22um細菌、灰塵細菌、灰塵微濾膜微濾膜超濾超濾20a0.2um20a0.2um病毒、生物大分子病毒、生物大分子超濾膜超濾膜反滲透反滲透20a20a生物小分子、生物小分子、鹽、離子鹽、離子反滲透膜反滲透膜一、非膜過濾一、非膜過濾截留顆粒直徑大于截留

49、顆粒直徑大于2m,2m,用于分離酵母、霉菌、動植物細胞、培用于分離酵母、霉菌、動植物細胞、培養(yǎng)基殘渣等。過濾介質有濾紙、濾布、多孔陶瓷等。養(yǎng)基殘渣等。過濾介質有濾紙、濾布、多孔陶瓷等。(1)(1)常壓過濾常壓過濾以液位差為推動力，易操作，分離效果差，難成規(guī)模。以液位差為推動力，易操作，分離效果差，難成規(guī)模。(2)(2)加壓過濾加壓過濾以壓力泵或壓縮空氣為推動力。效果較好，生產上應用廣泛。以壓力泵或壓縮空氣為推動力。效果較好，生產上應用廣泛。(3)(3)減壓過濾減壓過濾真空過濾、抽濾。多用于粘性不大的物料。真空過濾、抽濾。多用于粘性不大的物料。1 1、粗濾、粗濾l微孔過濾微孔過濾, ,截留顆粒直徑截留顆粒直徑0.20.22m2m，光學顯微鏡可見，光學顯微鏡可見顆粒，采用微孔陶瓷