8哺乳動物表達系統(tǒng)

1、哺乳動物基因工程哺乳動物基因工程基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動物基因工程高等植物基因工程d 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移8 哺乳動物基因工程c 高等哺乳動物的載體系統(tǒng)b 高等哺乳動物的受體系統(tǒng)a 高等哺乳動物基因工程的基本概念e 利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白a 高等哺乳動物基因工程的基本概念8 哺乳動物基因工程高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物細胞基因表達技術(shù)高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程細胞哺乳動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多

2、肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價模型b 高等哺乳動物的受體系統(tǒng)8 哺乳動物基因工程高等哺乳動物細胞的生長特性高等哺乳動物受體細胞的條件高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記常用的高等哺乳動物受體細胞高等哺乳動物細胞的生長特性正常的哺乳類動物細胞具有下列四大生物學特征： 錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂 血清依賴性：細胞必須具有生長因子才能生長 接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制 形態(tài)依賴性：細胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變某些特征而越過生理臨界

3、點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。高等哺乳動物受體細胞的條件以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞應(yīng)具備下列條件 細胞系特征 喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大 遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存 合適的標記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持 生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制 規(guī)模培養(yǎng) 大多數(shù)正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能 安全性能好 不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（prpp）次

4、黃嘌呤核苷一磷酸（hmp）次黃嘌呤核苷（hr）gmpamp尿嘧啶核苷一磷酸（ump）胸腺嘧啶核苷一磷酸（tmp）胸腺嘧啶核苷（tr）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）（tk）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（ap）氨基喋呤（ap）從頭合成途徑補救合成途徑高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（tk）編碼基因缺陷的受體細胞（tk -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（hat培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）編碼基因缺陷的受體細胞不能在含有次黃嘌呤

5、核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（hat培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因hprt與之遺傳互補（hprt -）高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記遺傳標記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機理aph- 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 g418 aph滅活g418dhfr 二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤 dhfr變體抗氨甲喋呤 hph- 潮霉素b磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素b hph滅活潮霉素b tk- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 tk合成tmpxgprt- 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 xgprt合成gmpada- 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ada滅活xyl-a 常用的高等哺乳動物受體細胞

6、迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（cho），其優(yōu)勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準確基因轉(zhuǎn)移和載體表達系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國fda確認為安全的基因工程受體細胞（gras）c 高等哺乳動物的載體系統(tǒng)8 哺乳動物基因工程人腺病毒dna猴空泡病毒dna（sv40）人乳多瘤病毒dna（bkv）人牛痘病毒dna人腺病毒dna 腺病毒科為線狀雙鏈腺病毒科為線狀雙鏈dna病毒，無包膜，呈二十面體病毒，無包膜，呈二十面體，共有，共有93個個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。

7、成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒有目前已鑒定的人腺病毒有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是主要是c亞屬的亞屬的2型（型（ad2）和）和5型（型（ad5）病毒。）病毒。 腺病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目腺病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。腺病毒的生物學特性人腺病毒dna腺病毒的基因組dnaitritre1e2e3e4iva2val1l2l3l4l5 腺病毒基因組dna全長36 kb，其包裝上限為原基因組的105%， dna兩端各有一個反

8、向重復序列（itr）；e1-e4為早期基因，與病毒基因組的復制及晚期基因的表達調(diào)控有關(guān)，其中e3編碼晚期基因的調(diào)控因子， l1-l5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；iva2和va均為病毒rna聚合酶的亞基編碼基因。e3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復制功能，因而在構(gòu)建載體時往往除去這個2.2 kb的片段，使得載體的裝載量提高到4 kb以上。人腺病毒dna基因重排低基因重排低 外源基因與病毒外源基因與病毒dna重組后能穩(wěn)定復制幾重組后能穩(wěn)定復制幾個周期個周期安全性能好安全性能好 不整合人的染色體不整合人的染色體dna，不會導致惡性腫，不會導致惡性腫瘤瘤宿主范圍廣宿主范圍廣 對受體細胞

9、是否處于分裂期要求不嚴格對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格使用效果好使用效果好 外源基因在載體上容易高效表達外源基因在載體上容易高效表達腺病毒dna載體的特點猴多瘤病毒dna（sv40） sv40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由，由vp1、vp2、vp3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀的雙鏈環(huán)狀dnasv40可以與所有哺乳動物宿主細胞可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白中的組蛋白h2、h3、h4結(jié)合，從而使其結(jié)合，從而使其dna形成類似核形成類似核小體的小體的微型染色體微型染色體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)

10、。 sv40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生動物后，便發(fā)生非同源整合非同源整合而致癌。而致癌。sv40的生物學特性猴多瘤病毒dna（sv40）sv40的基因組dna t / t基因編碼病毒的小抗基因編碼病毒的小抗原和大原和大抗原與病毒的致癌作用抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān)密切相關(guān) sv40在裂解宿主細胞前的晚在裂解宿主細胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒個病毒dna拷貝，因此十分拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白適合用于高效表達外源蛋白sv40 dnaorivp2tvp3vp1t猴多瘤病

11、毒dna（sv40）sv40 dna-質(zhì)粒dna雜合載體的構(gòu)建 重組的sv40 dna分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源dna片段不能太大。為了盡量提高sv40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的sv40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。aproriviral genegptsv40 oripv2-gptpbr322pbr322sv40 pv2-gpt是一種sv40 dna與大腸桿菌質(zhì)粒dna雜合的載體，其中g(shù)pt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表達有生物活性的兔b-珠蛋白.猴多瘤病毒d

12、na（sv40）利用sv40 dna載體表達外源基因的程序sv40 載體病毒晚期基因啟動子篩選標記ori缺陷的sv40 輔助病毒去除細菌序列插入外源基因重組分子分離病毒dna轉(zhuǎn)化篩選增殖感染猴多瘤病毒dna（sv40）f基因表達好基因表達好 外源基因能高效表達外源基因能高效表達f基因重排高基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺 失現(xiàn)象失現(xiàn)象f宿主范圍窄宿主范圍窄 只能轉(zhuǎn)染猴細胞只能轉(zhuǎn)染猴細胞f裝載量較小裝載量較小sv40 dna載體的特點人乳多瘤病毒dna（bkv） 人乳多瘤病毒（人乳多瘤病毒（bkv）屬于乳多瘤病毒科乳頭）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬

13、，其基因組為雙鏈瘤病毒屬，其基因組為雙鏈dna，感染宿主細胞后，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復制，每個基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復制，每個宿主細胞最高可達宿主細胞最高可達500個拷貝個拷貝人乳多瘤病毒的生物學特性人乳多瘤病毒dna（bkv）人乳多瘤病毒表達載體的構(gòu)建bkv - e.coli 穿梭載體bkv oribkv genedremmtpap re.coli orisv40 pneo r刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細胞。安裝細胞色素p450 dioxin介導的增強子dr

14、e，控制小鼠乳腺癌啟動子mmtp，由其帶動外源基因的表達。sv40來源的啟動子控制neor 標記基因，以g418篩選重組子。以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒b蛋白獲得成功。人牛痘病毒dna 人牛痘人牛痘病毒是一個大型病毒是一個大型dna病毒，基因組長病毒，基因組長185 kb，能在宿主細能在宿主細胞質(zhì)中自主復制。以前外源基因插在病毒基因胞質(zhì)中自主復制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建出的重組病毒具有感染力，而且一組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表

15、達。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外效表達。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外dna重組很重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進行。困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進行。人牛痘病毒的生物學特性人牛痘病毒dna 目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統(tǒng)是一種預先構(gòu)建好目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統(tǒng)是一種預先構(gòu)建好的重組病毒的重組病毒其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌t7rna聚合酶聚合酶編碼基因。在外源基因?qū)胧荏w細胞之前，編碼基因。在外源基因?qū)胧荏w細胞之前，先以上述的重組病毒感染細胞，使其大量表達先以上述的重組病毒感染細胞，使其大量表達t7rna聚合聚合酶，然后再

16、將含有外源基因和酶，然后再將含有外源基因和t7啟動子的細菌型重組質(zhì)粒啟動子的細菌型重組質(zhì)粒導入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染導入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體色體dna上，并在上，并在t7rna聚合酶的作用下表達出重組蛋白聚合酶的作用下表達出重組蛋白。 人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。人牛痘病毒dna表達載體的構(gòu)建人牛痘病毒dna利用人牛痘病毒載體表達外源基因的程序牛痘病毒啟動子t7 rna聚合酶基因t7啟動子外源基因細菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集d 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移8 哺乳動物基因工程哺乳動物細胞

17、的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細胞的主要優(yōu)利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細胞的主要優(yōu)點是外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這點是外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達產(chǎn)物的分離純化減輕了負擔。但外對外源基因表達產(chǎn)物的分離純化減輕了負擔。但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形式隨機整合在染色體式隨機整合在染色體dnadna上，導致受體細胞基因滅活上，導致受體細胞基因滅活、外源基因不表達。、外源基因不表達。哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的將待轉(zhuǎn)化的dna溶解在磷酸

18、緩沖液中，加入溶解在磷酸緩沖液中，加入cacl2溶液溶液混勻，此時混勻，此時dna被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)； 將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37保保溫溫4-16小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)，dna便進入受體細胞；便進入受體細胞； 棄去棄去dna溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩天即可篩選轉(zhuǎn)化株。選轉(zhuǎn)化株。磷酸鈣共沉淀法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法磷酸鈣共沉淀法 如果在外源如果在外源dna中摻入少量的受體細胞內(nèi)源性中

19、摻入少量的受體細胞內(nèi)源性dna可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒dna，可使正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，這是人們對腫瘤發(fā)，可使正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機制的最早理解。生機制的最早理解。哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的將待轉(zhuǎn)化的dna溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)生細小的縫隙，此時生細小的縫隙，此時dna片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進入受體細胞。入受體細胞。

20、電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細胞等。生長在懸浮液中的淋巴細胞等。電擊轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的將待轉(zhuǎn)化的dna溶解與天然或人工合成的磷脂混合，溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相dna的的脂質(zhì)體脂質(zhì)體結(jié)結(jié)構(gòu)。構(gòu)。 將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜融合，體細胞膜融合，dna隨即進入胞質(zhì)和核內(nèi)。隨即進入胞質(zhì)和核內(nèi)。 利用上述程序曾將外源基因成功地導入了小鼠的

21、淋巴利用上述程序曾將外源基因成功地導入了小鼠的淋巴細胞和細胞和hela細胞。細胞。脂質(zhì)體介導法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵； 借助于顯微借助于顯微鏡將純化的鏡將純化的dna溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性原核內(nèi)。原核內(nèi)。 上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單細胞逐一操作，所以不太適用于基因的克隆和表達。細胞逐一操作，所以不太適用于基因的克隆和

22、表達。顯微注射法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 血影細胞血影細胞是指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導是指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細胞膜包裹的細胞核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細胞膜的被細胞膜包裹的細胞核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時，外源通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時，外源dna也容易進也容易進入。當上述外界條件消失后，紅細胞膜又可恢復原來的通入。當上述外界條件消失后，紅細胞膜又可恢復原來的通透性。因此，可先將外源透性。因此，可先將外源dna轉(zhuǎn)入血影細胞，

23、然后再將血轉(zhuǎn)入血影細胞，然后再將血影細胞與受體細胞在適當條件下發(fā)生融合，從而將外源影細胞與受體細胞在適當條件下發(fā)生融合，從而將外源dna轉(zhuǎn)入受體細胞。轉(zhuǎn)入受體細胞。血影細胞介導法哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法 以病毒以病毒dna為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細胞。這種方與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、實驗重復性佳、導入效率高等優(yōu)法具有定向性好、實驗重復性佳、導入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟價值的范圍有限，

24、往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟價值的家禽和牲畜細胞等。家禽和牲畜細胞等。e 利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白8 哺乳動物基因工程哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人凝血因子viii哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理 基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊方式。氨甲喋呤（mtx）是動物細胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。這些抗性細胞正是通過增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶通過強化基因擴增高效表達外

25、源基因（dhfr）的特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多的表達水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴增的區(qū)哺乳動物細胞內(nèi)的基因擴增現(xiàn)象域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的dna區(qū)域同時被擴增。哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理通過強化基因擴增高效表達外源基因dhfr-mtx高效表達系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr -細胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05 m mm mtx培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5 m mm mtx0.25 m mm mtx培養(yǎng)單克隆外源基因擴增至100拷貝哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理通過強化基因擴增高效表達外源基因gs-msx高效表

26、達系統(tǒng) 谷氨酰胺合成酶（gs）能解除甲硫氨酸亞砜（msx）對動物細胞的毒害作用。先將帶有g(shù)s編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細中不必使用gs缺陷型的受體細胞，而且在正常的msx濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細胞，這是gs-msx系統(tǒng)比dhfr-胞中，由于只有多拷貝的gs編碼基因才能抗msx，所以在轉(zhuǎn)染過程mtx系統(tǒng)優(yōu)越之處。哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理通過強化基因轉(zhuǎn)錄高效表達外源基因 在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟ap rm13 oricole1 oricmvppolylinkergeneintronsv40 tpolya signal高效表達載體mrna前體aaaaaaaaamrna動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達的一種手段，如： 細胞巨化病毒cmv的啟動子 動物珠蛋白基因的內(nèi)含子 sv40的終止子和polya化信號序列 絕大多數(shù)哺乳動物細胞的表達型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因為mrna前