北五味子中4種木脂素類化合物的高效液相色譜法同時測定

1、北五味子中 4 種木脂素類化合物的高效液相色譜法同時測定 11-04-24 16:22:00 編輯： studa20作者：可成友，邊薔，康宏玲，于亮，吳曉芳，徐培石【摘要】目的建立高效液相色譜法同時測定北五味子中4 種木脂素類化合物的分析方法。方法考察流動相組成及配比、檢測波長、柱溫、流速和進樣量對測定的影響，確定了最佳色譜條件：流動相為乙腈- 水，梯度洗脫程序為： 025 min 乙腈水 =5050(V/V);25 35 min 線性變化到 7030(V/V) ，并保持 5 min;40 44 min 再線性變化到 8020(V/V);DAD 檢測器，檢測波長為五味子醇甲、五味子甲素和五味子

2、乙素 216 nm，五味子酯甲 222 nm; 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進樣量 10.0 l 。結(jié)果在最佳色譜條件下， 4 種化合物標準曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為 0.999 4 0.999 8 ，各組分的檢出限為 0.04 0.05 g/ml ，平均回收率為 90.23 95.24%，相對標準偏差為 3.2%4.9%。結(jié)論該方法靈敏，準確，實現(xiàn)了對 4 種木脂素類化合物的同時測定?！娟P(guān)鍵詞】高效液相色譜法; 北五味子 ; 木脂素五味子為木蘭科植物五味子的成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效。北五味子主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江，具有很高的藥用價值1 。建立一種

3、高效、快速、準確測定五味子中有效成分的方法，對五味子的質(zhì)量進行檢測跟蹤 2 ，3 ，意義將非常重大，同時也為北五味子規(guī)范化種植基地的藥材品質(zhì)評價提供依據(jù)。現(xiàn)在國內(nèi)外對于木脂素的測定方法研究的比較多47 ，但各種方法都有不同程度的缺陷。本研究采用高效液相色譜法對五味子中4 種木脂素類化合物的同時測定進行了系統(tǒng)的研究，實現(xiàn)了4 種化合物的同時測定。經(jīng)實際樣品檢測和分析性能研究表明，方法簡單、快速、準確、可靠。1 器材1.1 儀器與試劑 Agilent HP1100高效液相色譜儀 ( 配有四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器); 色譜柱：迪馬公司Diamonsil( 鉆石

4、 )C18 柱(250 mm×4.6 mm， 5 m); 超純水發(fā)生系統(tǒng)(MILLIPORE公司 );LG10-2.4A 型高速離心機 ( 北京醫(yī)用離心機廠 );C18 固相萃取小柱 (3 ml ， 100 mg， waters 公司 );TurboVap LV氮氣吹干儀 (Zymark 公司 ); 13 mm 0.22 m一次性微孔樣品過濾膜 ( 希波氏 );SHZ- D() 循環(huán)水式真空泵 ( 鞏義市英峪予華儀器廠 ) 。1.2 試劑與標準品甲醇，色譜純(Fisher Chemicals公司 ); 標準品，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素，均為化學對照品 ( 中國藥

5、品生物制品檢定所 ); 乙腈，色譜純 (Fisher Chemicals 公司 ); 丙酮，分析純 ( 國藥集團化學試劑有限公司 ); 苯，分析純 ( 沈陽市新西試劑廠 ); 正己烷，分析純 ( 國藥集團化學試劑有限公司 ); 環(huán)己烷，分析純 ( 國藥集團化學試劑有限公司 ) 。標準儲備液的配制：分別準確稱取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素標準品 0.010 0 g 于小燒杯中，加入乙腈溶解，轉(zhuǎn)移于 10 ml 容量瓶中，定容至刻度，混勻，制得各儲備液的濃度均為 1 000 g/ml 。北五味子 1 號和北五味子 2 號藥材，均由遼寧金世中藥材科技開發(fā)有限公司提供。1.3 色譜條

6、件色譜柱為迪馬公司Diamonsil(鉆石 )C18 柱(250 mm×4.6mm，5 m); 流動相為 A 乙腈， B 水;梯度洗脫程序： 0 25 min 流動相配比為乙腈水 =5050 (V/V);25 35 min 流動相比例線性變化到7030(V/V);35 40 min 保持乙腈水 =7030(V/V);40 44 min 再線性變化到 8020(V/V) 。2 方法2.1 樣品預處理化，保持水的液面為C18固相萃取柱活化：分別用2 mm左右時上樣。10 ml甲醇和10 ml水活準確稱取 0.100 0 g 樣品于比色管中，加入 10 ml 乙腈超聲 40 min 左右，

7、將所得液體和固體混合物過濾，得到澄清溶液和固體殘渣，用乙腈將固體殘渣洗滌數(shù)次，合并乙腈液和原澄清溶液，將合并液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入 10%甲醇水溶液 10.00 ml 溶解，取出 1.00 ml 慢慢加入到已活化的 C18固相萃取柱中，全程的層析過程中不應(yīng)使柱干涸，用 5 ml 水做淋洗液洗柱，棄去全部淋洗液，用 5 ml 甲醇做洗脫液洗柱，收集洗脫液，用氮氣吹干儀吹干洗脫液，然后加入 1.00 ml 乙腈溶解，經(jīng) 0.22 m微孔濾膜過濾后待測。2.2 儀器操作按分析方法中設(shè)定的流動相配比、流速、柱溫、檢測器溫度平衡整個液相色譜系統(tǒng)。待基線完全穩(wěn)定后進樣分析，同時在 Offline 下進行數(shù)據(jù)

8、處理與報告編輯。每次做完實驗后應(yīng)先用 20 倍柱體積的溶液 ( 二次蒸餾水乙腈 =955) 沖洗色譜柱 ( 注意此時應(yīng)關(guān)閉檢測器 ) ，最后用純乙腈沖洗約20 min ，封柱，待用。 3 結(jié)果與討論3.1 色譜柱的選擇由于本實驗欲分離的對象均為親脂性的物質(zhì)，又因為反相化學鍵合色譜柱具有柱效高、重現(xiàn)性好、選擇性高、色譜柱壽命長、可進行梯度洗脫等優(yōu)點，可選用反相化學鍵合色譜法進行分析，而且反相色譜使用水作為流動相的主體能大大降低實驗成本 8,9 。為此本實驗選擇反相化學鍵合色譜柱，即 C18柱為色譜分離柱。3.2 流動相體系的選擇本實驗分別考察了甲醇- 水流動相體系和乙腈 - 水流動相兩種體系下，

9、 4 種標準物質(zhì)及其樣品的色譜分離情況，實驗得出， 4 種被測物質(zhì)在相同配比的兩種體系下均能得到洗脫和分離，而應(yīng)用甲醇 - 水體系分析時間長，后出峰物質(zhì)的峰形變寬，而采用相同配比的乙腈 - 水體系可以大大縮短組分的保留時間，而且各物質(zhì)的峰形尖銳，對稱度好。實驗結(jié)果表明樣品中的干擾物質(zhì)很多，欲滿足分析要求，必須使各種物質(zhì)有良好的分離度和洗脫效果，并且減少拖尾和包峰情況，應(yīng)用乙腈- 水體系能明顯抑制峰形變寬，而且乙腈-水體系溶劑強度大、黏度小，會使各物質(zhì)的洗脫和分離效果更好。為此本實驗選擇乙腈 - 水為流動相體系。3.3 流動相配比及洗脫方式和洗脫程序的確定本實驗考察了樣品的色譜分離情況，樣品中的

10、干擾物質(zhì)很多，單純考慮標準物質(zhì)的分離來確定流動相的配比已經(jīng)不能滿足分離分析的要求，乙腈和水的配比調(diào)整為 6535，此時標準物質(zhì)已能達到很好的分離，但樣品中五味子醇甲和五味子酯甲與周圍的干擾物質(zhì)仍然無法分開，而五味子甲素和五味子乙素的分配比較大，雖然已經(jīng)彼此分離開且周圍干擾較少，但色譜峰變寬。由此可見欲使被測物質(zhì)與其他的干擾物質(zhì)達到良好的分離，就需降低流動相的洗脫強度，即減少流動相中乙腈的含量，這樣會導致五味子甲素和五味子乙素的洗脫時間延長，為此可采用梯度洗脫方式進行分離，先以低強度流動相洗脫 10 ，即開始時乙腈含量較少，待五味子醇甲和五味子酯甲以理想的分離度彼此分開后，逐漸增加乙腈的含量，即

11、增加流動相的洗脫強度，使強保留組分五味子甲素和五味子乙素能在合適的保留時間內(nèi)以滿意的分離度從色譜柱中流出，從而提高分離效果，改變峰形，縮短分析時間 11 。為獲得最佳洗脫效果，實驗設(shè)計了4 套梯度洗脫程序，考察了不同的梯度洗脫條件對各組分分離的影響。通過實驗得到，4 號梯度洗脫程序的色譜圖中 4 種待測物質(zhì)的分離效果最好，在分離效果良好的基礎(chǔ)上盡量縮短分析時間。因此，選擇4 號梯度洗脫程序為最佳的梯度洗脫程序。如表1 所示。表 1 最佳的梯度洗脫程序3.4 檢測波長的選擇進行高效液相色譜分析時經(jīng)常采用的檢測器是紫外- 可見檢測器，其優(yōu)點是靈敏度高，波長范圍寬，但只能在同一波長下檢測，對分析多種

12、物質(zhì)不能同時選擇每種物質(zhì)的最大吸收波長12 ，這樣會使某些物質(zhì)的檢測靈敏度降低。而本實驗采用 DAD檢測器，該檢測器可以動態(tài)地快速掃描被測組分的紫外 - 可見吸收光譜圖，可直接得到每個物質(zhì)的最大吸收波長，而且可在每個色譜峰出峰之前，動態(tài)調(diào)整檢測器波長，完全可以以每個組分的最大吸收波長作為檢測波長以此來提高檢測靈敏度，并能有效地減小基線漂移。實驗分別取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素標準溶液進樣分析，采用 DAD檢測器于 190900 nm 范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。結(jié)果如圖 1 所示。圖 14 種組分的紫外 - 可見吸收光譜圖由 4 種組分的紫外 - 可見吸收光譜可以看出，五味子醇

13、甲、五味子甲素和五味子乙素均在 216 nm 處有最大吸收峰，五味子酯甲在 222 nm 處有最大吸收峰。所以本實驗選擇五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的檢測波長為 216 nm，五味子酯甲的檢測波長為 222 nm。3.5 柱溫的選擇本實驗在上述確定的實驗條件下以流速0.8 ml/min，進樣量 10 l ，分別在 20，25， 30，35，40 進行柱溫選擇實驗，考察了柱溫對樣品中各物質(zhì)分離度及理論塔板數(shù)的影響。實驗結(jié)果表明各種物質(zhì)的分離度隨著柱溫的升高呈不同的變化趨勢，只有在 20和 25時各物質(zhì)的分離度才大于 1.0 ，可以滿足分析要求。實驗得出，在 20和 25時，五味子醇甲和五味

14、子甲素的柱效變化不大，但五味子酯甲和五味子乙素柱效在 25時最高，為此，本實驗選擇柱溫為 25。3.6 流速的選擇由實驗中可以看出，流動相流速對 4 種組分的保留時間有一定的影響，隨著流速的增大，各組分的保留時間提前，分析效率提高。但當流動相流速過大時，系統(tǒng)的壓力太高，容易沖塌柱。當流速為0.8 ml/min五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的柱效達到最高，為此，本實驗采用0.8 ml/min為最佳流速。時，3.7 樣品前處理方法的確定3.7.1 提取方法、提取試劑和提取條件的確定本實驗考察了 3 種提取方法，即超聲提取法、冷浸提取法和回流提取法。通過實驗發(fā)現(xiàn)回流提取法對各種物質(zhì)的提取結(jié)果較低

15、，而且費時費力，所以實驗主要對超聲提取法和冷浸提取法進行了比較，提取中又選用不同的提取溶劑和提取時間來比較各組分的提取結(jié)果，在超聲提取法中主要選擇正己烷、醋酸乙酯、乙腈和環(huán)己烷進行比較，在冷浸提取法中主要選擇正己烷、苯、醋酸乙酯、乙腈和甲醇進行比較。實驗表明，應(yīng)用超聲提取法可選擇乙腈超聲， 4 種物質(zhì)的提取量最多，而且超聲時間長提取量多，但時間太長，分析周期延長，為此實驗選擇超聲 40 min 。實驗還得出，用正己烷冷浸 1216 h 4 種物質(zhì)均獲得比較好的提取量，同超聲提取法相比較，提取量相當，但由于冷浸需要的時間比較長，為此本實驗選擇乙腈超聲 40 min 進行提取。3.7.2 固相萃取

16、柱的選擇本實驗分別考察了氧化鋁和C18兩種固相萃取柱對被測物質(zhì)的純化和富集情況，結(jié)果表明，用氧化鋁萃取，被測組分難以被洗脫，在吸附劑中的保留強，為此實驗也考察了應(yīng)用不同的淋洗液和洗脫液，以及增加洗脫液的用量來洗脫被測物質(zhì)，但被測物質(zhì)仍然無法被很好的洗脫，回收率較低。而應(yīng)用C18萃取的結(jié)果與氧化鋁不同，洗脫的效果比較好，實驗同樣也考察了不同淋洗液和洗脫液對樣品純化和被測物質(zhì)洗脫效率的影響。實驗表明采用 C18進行固相萃取，分別用10 ml 甲醇和 10 ml 水活化后上樣，然后用 5 ml 水做淋洗液， 5 ml 甲醇作為洗脫液進行凈化，可以達到良好的效果。 11-04-24 16:22:00

17、編輯： studa203.8 干擾實驗實驗中用到甲醇作洗脫溶劑，在檢測范圍內(nèi)很可能出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾 13 ，為此取少量甲醇用氮氣吹干儀吹干后，用流動相定容，在上述確定的色譜條件下進樣測定，結(jié)果表明甲醇在 3 min 時出峰，而樣品中待測物質(zhì)第一峰的出峰時間為 13 min ，說明甲醇溶劑峰對 4 種組分的分析不產(chǎn)生干擾。3.9 標準曲線分別移取濃度為1 000 g/ml 的 4 種木脂素標準儲備液0.02 ，0.08 ，0.20 ，0.40 ，1.00 ，2.00 ml 于 10 ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成濃度為 2.00 ，8.00 ，20.00 ， 40.00 ，1

18、00.00 ， 200.00 g/ml 的標準系列溶液，按最佳色譜條件進樣分析，以峰面積為縱坐標，以對應(yīng)的濃度為橫坐標做各種組分的標準曲線，如圖 2 所示。經(jīng)線性回歸計算，得到 4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。見表 2。由表 2 可以看出，該 4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9994 0.9998 之間，可以滿足日常分析的要求。3.10 檢出限和線性范圍檢出限又稱敏感度，是指產(chǎn)生一個能夠確證在試樣中存在的分析信號所需要的該組分的最小含量。亦即待測組分所產(chǎn)生的信號強度等于其噪聲強度標準偏差三倍時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度或質(zhì)量，用最小檢測濃度 g/ml( g/g) 或最小檢測質(zhì)量 g/ng

19、來表示。檢出限是衡量一個分析方法的重要指標，它能更全面地反映檢測器質(zhì)量，檢測方法的靈敏度14 。為此在最佳色譜條件下測定了 4 種化合物的檢出限及線性范圍。結(jié)果見表3。由表 3 可以看出，本實驗建立的 HPLC分析北五味子中 4 種木脂素成分的方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬。圖23 種組分的標準曲線經(jīng)線性回歸計算，得到4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2。表 2 標準曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表3各組分的檢出限及線性范圍3.11 儀器精密度實驗實驗在最佳色譜條件下，以1.00 g/ml 的標準溶液平行測定 18 次，由測定結(jié)果可以看出，4 種物質(zhì)的相對標準偏差均小于 3.0%，測定結(jié)果的

20、可靠性可以滿足分析的要求。3.12 樣品測定在最佳實驗條件下，測定北五味子樣品中4 種組分的分析結(jié)果見表 4。表 4 北五味子的分析結(jié)果3.13 回收率實驗本實驗采用標準加入法進行回收率實驗。取北五味子2 號樣品 0.100 0 g ，加入 2 ml 200 g/ml 的標準溶液，即提取液中各組分的濃度為 40 g/ml ，按前述提取方法平行實驗 7 次，由實驗得出，五味子中 4 種組分的平均回收率為 90.23% 95.24%，相對標準偏差為 3.2%4.9%。說明該方法的準確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測的要求。3.14 標準溶液的穩(wěn)定性為考察溶液的穩(wěn)定性15 ，配制濃度為 40.0

21、0 g/ml 使用液，密封避光保存。在不同的時間進樣測定，實驗結(jié)果表明，濃度為 40.00 g/ml 標準溶液在第 20 天時五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的變化率都超過了 10%，在第 10 天時 4 種物質(zhì)的變化率均小于 10%，說明標準溶液在 10 d 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。峰面積的升高，說明溶液濃度在增大，溶劑揮發(fā)，因此，標準溶液應(yīng)放置于溫度低的地方，使用時注意防止揮發(fā)。4 結(jié)論采用高效液相色譜法測定北五味子中木脂素類化合物的含量，通過實驗得到以下結(jié)論。通過條件實驗，確定了最佳實驗條件： Diamonsil( 鉆石 )C18 柱 ;DAD檢測器檢測，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢

22、測波長均為216 nm，五味子酯甲的檢測波長為 222 nm; 流動相乙腈 - 水，采用梯度洗脫，洗脫程序為 025 min 乙腈 : 水=5050(V/V) ， 25 35 min 流動相比例線性變化到 7030(VV)， 3540 min 保持乙腈 : 水=7030(V/V) ， 40 44 min 再線性變化到 8020(V/V); 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進樣量 10.0 l 。在最佳實驗條件下 4 種木脂素類化合物能與樣品中其他雜質(zhì)達到良好的分離，通過定性分析 4 種物質(zhì)的出峰順序為五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。在最佳色譜條件下繪制標準曲線，在

23、0.15 200 g/ml 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為 0.999 4 0.999 8 。經(jīng)計算各組分的最小檢測濃度為 0.04 0.05 g/ml 。本實驗對樣品進行了測定，并考察了方法的精密度和準確度。對樣品進行了加標回收實驗，平均回收率為 90.23% 95.24%，相對標準偏差為3.2%4.9%。說明該方法的準確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測的要求。本研究所建立的高效液相色譜法簡便、靈敏、準確、線性范圍寬，適用于木脂素類化合物的分析。【參考文獻】1 靳杰 . 中藥五味子的研究進展 J. 黑龍江醫(yī)藥， 2005， 18(5):335.2 高建平，王彥涵，郁韻秋，等 . 南五味子木

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28、uda203.8 干擾實驗實驗中用到甲醇作洗脫溶劑，在檢測范圍內(nèi)很可能出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾 13 ，為此取少量甲醇用氮氣吹干儀吹干后，用流動相定容，在上述確定的色譜條件下進樣測定，結(jié)果表明甲醇在 3 min 時出峰，而樣品中待測物質(zhì)第一峰的出峰時間為 13 min ，說明甲醇溶劑峰對 4 種組分的分析不產(chǎn)生干擾。3.9 標準曲線分別移取濃度為1 000 g/ml 的 4 種木脂素標準儲備液0.02 ，0.08 ，0.20 ，0.40 ，1.00 ，2.00 ml 于 10 ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成濃度為 2.00 ，8.00 ，20.00 ， 40.00 ，100.00

29、， 200.00 g/ml 的標準系列溶液，按最佳色譜條件進樣分析，以峰面積為縱坐標，以對應(yīng)的濃度為橫坐標做各種組分的標準曲線，如圖 2 所示。經(jīng)線性回歸計算，得到 4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。見表 2。由表 2 可以看出，該 4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9994 0.9998 之間，可以滿足日常分析的要求。3.10 檢出限和線性范圍檢出限又稱敏感度，是指產(chǎn)生一個能夠確證在試樣中存在的分析信號所需要的該組分的最小含量。亦即待測組分所產(chǎn)生的信號強度等于其噪聲強度標準偏差三倍時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度或質(zhì)量，用最小檢測濃度 g/ml( g/g) 或最小檢測質(zhì)量 g/ng 來表示。檢出

30、限是衡量一個分析方法的重要指標，它能更全面地反映檢測器質(zhì)量，檢測方法的靈敏度14 。為此在最佳色譜條件下測定了 4 種化合物的檢出限及線性范圍。結(jié)果見表3。由表 3 可以看出，本實驗建立的 HPLC分析北五味子中 4 種木脂素成分的方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬。圖23 種組分的標準曲線經(jīng)線性回歸計算，得到4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2。表 2 標準曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表3各組分的檢出限及線性范圍3.11 儀器精密度實驗實驗在最佳色譜條件下，以1.00 g/ml 的標準溶液平行測定 18 次，由測定結(jié)果可以看出，4 種物質(zhì)的相對標準偏差均小于 3.0%，測定結(jié)果的可靠性可以滿

31、足分析的要求。3.12 樣品測定在最佳實驗條件下，測定北五味子樣品中4 種組分的分析結(jié)果見表 4。表 4 北五味子的分析結(jié)果3.13 回收率實驗本實驗采用標準加入法進行回收率實驗。取北五味子2 號樣品 0.100 0 g ，加入 2 ml 200 g/ml 的標準溶液，即提取液中各組分的濃度為 40 g/ml ，按前述提取方法平行實驗 7 次，由實驗得出，五味子中 4 種組分的平均回收率為 90.23% 95.24%，相對標準偏差為 3.2%4.9%。說明該方法的準確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測的要求。3.14 標準溶液的穩(wěn)定性為考察溶液的穩(wěn)定性15 ，配制濃度為 40.00 g/ml

32、 使用液，密封避光保存。在不同的時間進樣測定，實驗結(jié)果表明，濃度為 40.00 g/ml 標準溶液在第 20 天時五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的變化率都超過了 10%，在第 10 天時 4 種物質(zhì)的變化率均小于 10%，說明標準溶液在 10 d 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。峰面積的升高，說明溶液濃度在增大，溶劑揮發(fā)，因此，標準溶液應(yīng)放置于溫度低的地方，使用時注意防止揮發(fā)。4 結(jié)論采用高效液相色譜法測定北五味子中木脂素類化合物的含量，通過實驗得到以下結(jié)論。通過條件實驗，確定了最佳實驗條件： Diamonsil( 鉆石 )C18 柱 ;DAD檢測器檢測，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢測波長均為2

33、16 nm，五味子酯甲的檢測波長為 222 nm; 流動相乙腈 - 水，采用梯度洗脫，洗脫程序為 025 min 乙腈 : 水=5050(V/V) ， 25 35 min 流動相比例線性變化到 7030(VV)， 3540 min 保持乙腈 : 水=7030(V/V) ， 40 44 min 再線性變化到 8020(V/V); 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進樣量 10.0 l 。在最佳實驗條件下 4 種木脂素類化合物能與樣品中其他雜質(zhì)達到良好的分離，通過定性分析 4 種物質(zhì)的出峰順序為五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。在最佳色譜條件下繪制標準曲線，在 0.15 2

34、00 g/ml 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為 0.999 4 0.999 8 。經(jīng)計算各組分的最小檢測濃度為 0.04 0.05 g/ml 。本實驗對樣品進行了測定，并考察了方法的精密度和準確度。對樣品進行了加標回收實驗，平均回收率為 90.23% 95.24%，相對標準偏差為3.2%4.9%。說明該方法的準確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測的要求。本研究所建立的高效液相色譜法簡便、靈敏、準確、線性范圍寬，適用于木脂素類化合物的分析。【參考文獻】1 靳杰 . 中藥五味子的研究進展 J. 黑龍江醫(yī)藥， 2005， 18(5):335.2 高建平，王彥涵，郁韻秋，等 . 南五味子木脂素成分的

35、HPLC含量測定及其變異規(guī)律 J. 中國天然藥物， 2003， 1(2):89.3 戴好富，周俊，彭再剛，等 . 北五味子的水溶性化學成分 J. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2001，13(1):24.4Schmidt T J, Stausberg S, Von Raison J, et al. Lignans from Arnica species J, Nat. Prod. Res., 2006, 20:443.5 王媚，吳皓 . 中藥有機酸類成分的提取分離及測定方法研究進展 J.南京中醫(yī)藥大學學報， 2004，20(3):190.6 韓正洲，李亞鳳 .南、北五味子的薄層色譜鑒定及定量分析J.時

36、珍國藥研究， 1997，8(4):24.7 楊映霞，牛志多，張桂英 . 薄層掃描法測定安神口服液中五昧子乙素的含量 J. 吉林中醫(yī)藥， 2000，1:53.8 Kvasnickova L ，Glatz Z ，Sterbova H ，et al. 用大孔聚丙烯酰胺柱毛細管電色譜法分析五味子種子中的木脂素J. J. Chromatogr. A, 2001，916(1):265.9Chen A J, Li C H, Gao W H, et al. Separation and determination of active components in Schisandra chinensis Bai

37、ll. and its medicinal preparations by non-aqueous capillary electrophoresis J, Biomed. Chromatogr., 2005,19: 481.10 袁軍，付平，王野 . 南五味子種子中木脂素類成分的高效液相色譜 - 電噴霧電離 - 質(zhì)譜分析 J. 藥物分析雜志， 2005，25(5):565.11 裴毅，聶江力 . 高效液相色譜法測定五味子乙素含量 J. 植物研究，2005，25(3):373.12 周瑩，程海燕 . 高效液相色譜法鑒別南北五味子 J. 醫(yī)藥導報，2005，24(10):951.13 付紹平，張

38、峰，張慧，等 . 反相高效液相色譜法測定五味子中木脂素的含量 J. 現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2004， 18( 增刊 ):32.14 王彥涵，高建平，陳道峰 . 高效液相色譜法測定五味子屬藥用植物木脂素的含量 J. 中國中藥雜志， 2003，28(12):1155.15Wang Y H, Gao J P, Chen D F. Determination of lignans ofSchisandra medicinal plant by HPLC J, Chinese Materia Medica, 2003, 28:1155. 11-04-24 16:22:00 編輯： studa203.8

39、干擾實驗實驗中用到甲醇作洗脫溶劑，在檢測范圍內(nèi)很可能出現(xiàn)甲醇溶劑峰的干擾 13 ，為此取少量甲醇用氮氣吹干儀吹干后，用流動相定容，在上述確定的色譜條件下進樣測定，結(jié)果表明甲醇在 3 min 時出峰，而樣品中待測物質(zhì)第一峰的出峰時間為 13 min ，說明甲醇溶劑峰對 4 種組分的分析不產(chǎn)生干擾。3.9 標準曲線分別移取濃度為1 000 g/ml 的 4 種木脂素標準儲備液0.02 ，0.08 ，0.20 ，0.40 ，1.00 ，2.00 ml 于 10 ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成濃度為2.00 ，8.00 ，20.00 ， 40.00 ，100.00 ， 200.00 g

40、/ml的標準系列溶液，按最佳色譜條件進樣分析，以峰面積為縱坐標，以對應(yīng)的濃度為橫坐標做各種組分的標準曲線，如圖 2 所示。經(jīng)線性回歸計算，得到 4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。見表 2。由表 2 可以看出，該 4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9994 0.9998 之間，可以滿足日常分析的要求。3.10 檢出限和線性范圍檢出限又稱敏感度，是指產(chǎn)生一個能夠確證在試樣中存在的分析信號所需要的該組分的最小含量。亦即待測組分所產(chǎn)生的信號強度等于其噪聲強度標準偏差三倍時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度或質(zhì)量，用最小檢測濃度 g/ml( g/g) 或最小檢測質(zhì)量 g/ng 來表示。檢出限是衡量一個分析方法的

41、重要指標，它能更全面地反映檢測器質(zhì)量，檢測方法的靈敏度14 。為此在最佳色譜條件下測定了 4 種化合物的檢出限及線性范圍。結(jié)果見表3。由表 3 可以看出，本實驗建立的 HPLC分析北五味子中 4 種木脂素成分的方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬。圖23 種組分的標準曲線經(jīng)線性回歸計算，得到4 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2。表 2 標準曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表3各組分的檢出限及線性范圍3.11 儀器精密度實驗實驗在最佳色譜條件下，以1.00 g/ml 的標準溶液平行測定 18 次，由測定結(jié)果可以看出，4 種物質(zhì)的相對標準偏差均小于 3.0%，測定結(jié)果的可靠性可以滿足分析的要求。3.12

42、 樣品測定在最佳實驗條件下，測定北五味子樣品中4 種組分的分析結(jié)果見表 4。表 4 北五味子的分析結(jié)果3.13 回收率實驗本實驗采用標準加入法進行回收率實驗。取北五味子2 號樣品 0.100 0 g ，加入 2 ml 200 g/ml 的標準溶液，即提取液中各組分的濃度為 40 g/ml ，按前述提取方法平行實驗 7 次，由實驗得出，五味子中 4 種組分的平均回收率為 90.23% 95.24%，相對標準偏差為 3.2%4.9%。說明該方法的準確度和精密度較高，可以滿足日常分析檢測的要求。3.14 標準溶液的穩(wěn)定性為考察溶液的穩(wěn)定性15 ，配制濃度為 40.00 g/ml 使用液，密封避光保存

43、。在不同的時間進樣測定，實驗結(jié)果表明，濃度為 40.00 g/ml 標準溶液在第 20 天時五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的變化率都超過了 10%，在第 10 天時 4 種物質(zhì)的變化率均小于 10%，說明標準溶液在 10 d 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。峰面積的升高，說明溶液濃度在增大，溶劑揮發(fā)，因此，標準溶液應(yīng)放置于溫度低的地方，使用時注意防止揮發(fā)。4 結(jié)論采用高效液相色譜法測定北五味子中木脂素類化合物的含量，通過實驗得到以下結(jié)論。通過條件實驗，確定了最佳實驗條件： Diamonsil( 鉆石 )C18 柱 ;DAD檢測器檢測，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢測波長均為216 nm，五味子酯甲的檢測波長為 222 nm; 流動相乙腈 - 水，采用梯度洗脫，洗脫程序為 025 min 乙腈 : 水=5050(V/V) ， 25 35 min 流動相比例線性變化到 7030(VV)， 3540 min 保持乙腈 : 水=7030(V/V) ， 40 44 min 再線性變化到 8020(V/V); 柱溫 25; 流速 0.8 ml/min; 進樣量 10.0 l 。在最佳實驗條件下 4 種木脂素類化合物能與樣品中其他雜質(zhì)達到良好的分離，通過定性分析 4 種物質(zhì)的出峰順序為五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。在最佳色譜條件下繪制標準曲線，在 0.15 200 g