基因工程實驗指導書2

1、目 錄實驗一、質(zhì)粒DNA的提取實驗二、細菌基因組的提取實驗三 DNA的限制性內(nèi)切酶解及電泳實驗四、PCR基因擴增及電泳實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗一、質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒是一種雙鏈的共價閉合環(huán)狀的DNA分子,是細胞染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子。在基因克隆的實驗中,要把一個有用的外源基因通過重組DNA技術(shù),送進生物細胞中去繁殖和表達。實現(xiàn)攜帶外源基因進入受體細胞的工具被稱為載體,細菌質(zhì)粒是基因工程中常用的載體之一。作為基因工程的載體需具備下列條件:（1）是一個復制子,載體有復制點才能使與它結(jié)合的外源基因復制繁殖;(2)載體在受體細胞中能大量增殖,只有高復制率才能使外源基因在受體細胞中

2、大量擴增；3)載體DNA鏈上有一至數(shù)個限制性內(nèi)切酶的單一識別與切割位點,便于外源基因的插入;(4)載體具有選擇的遺傳標記,如抗氨芐青霉素基因(AmpR,抗新霉素基因(NeoR)等,以此判斷載體是否進入受體細胞,并據(jù)此將受體細胞從其他細胞中分離篩選出來.細菌質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復制,一般分為兩種類型:嚴密控制型和松馳控制型。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,與染色體復制相關(guān)聯(lián),每個細胞只含有一個或幾個質(zhì)粒分子,如ColEI質(zhì)粒(含有產(chǎn)生大腸桿菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍生的質(zhì)粒。后者在整個細胞周期中隨時可以復制,具多拷貝,一般在120個以上。本實驗分離純化的質(zhì)粒為pQE30,為高拷

3、貝質(zhì)粒。通過本實驗學習了解質(zhì)粒DNA的特點,掌握堿性SDS快速法從大腸桿菌細胞中分離、提取質(zhì)粒DNA.一、實驗原理 所有分離質(zhì)粒DNA的方法都含有以下3個步驟:細菌培養(yǎng)物的生長;細菌的收獲和裂解;質(zhì)粒DNA的純化。本實驗以堿性SDS快速法小量制備pQE30質(zhì)粒。堿裂解法對于以前應用的所有的大腸桿菌均卓有成效。該方法的特點是,加溶菌酶可破壞菌體細胞壁(小量制備可省略不用溶菌酶),去污劑SDS可使細胞壁裂解,并使蛋白質(zhì)變性,在堿性條件下,破壞堿基配對,故可使宿主的線狀染色體DNA變性,但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而彼此不分開。當條件恢復正常時(加入酸性試劑中和),質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準確

4、配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。細菌染色體DNA纏繞附著在細胞壁碎片上,離心時易被沉淀下來而質(zhì)粒DNA則留在上清液中,乙醇沉淀后可得到質(zhì)粒DNA.如需進一步純化,可應用聚乙二醇沉淀法或氯化銫一溴化乙錠梯度平衡法。環(huán)狀雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型:當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時,稱之為共價閉合環(huán)狀DNA(CCCDNA),這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋SC構(gòu)型;如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu),另一條出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時,稱之為開環(huán)DNA(OCDNA),此即OC構(gòu)型;若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后,發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分子(LDNA),通稱L構(gòu)

5、型。質(zhì)粒DNAMr一般在106107之間,常以kb表示(lkb雙鏈DNA=6.6×105),如質(zhì)粒pUC19的Mr為1.8×106(2.69kb)。在瓊脂糖凝膠電泳中,不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA,盡管M相同,仍具有不同的電泳遷移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次為LDNA和ocDNA。二 儀器、材料與試劑(一)儀器1. 恒溫培養(yǎng)箱2. 恒溫搖床3. 臺式離心機4. 高壓滅菌鍋(二)材料1.葡萄糖2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氫氧化鈉5.十二烷基硫酸鈉(SDS)6.乙酸鉀7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10.RNA酶11.氨芐青霉素12.蔗

6、糖13.溴酚藍14.酚15. 8一羥基喹琳16. 一巰基乙醇17.鹽酸(HCl)18.含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌19.吸頭、小指管(三)試劑1.溶液I50 mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0)10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等體積混合3.溶液III5mol/L乙酸鉀 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL4.TE緩沖液l0 mmol/L Tris-HCI1 mmol/L EDTA(pH8.0)5 70%乙醇(放-20冰箱中,用后即放回)6.、膜

7、RNA酶將RNA酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/mL的濃度,于100加熱15min,緩慢冷卻至室溫,保存于-20。7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴酚蘭8.酚。三 實驗步驟1.將2mL含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中,接入上述的含pQE30質(zhì)粒的大腸桿菌,37振蕩培養(yǎng)過夜。2.取1.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中10000r/min離心2min.3.吸去培養(yǎng)液,使細胞沉淀盡可能干燥。4.將細菌沉淀懸浮于100L溶液I中，充分混勻室溫放置10min。5.加200L溶液II(新鮮配制)，蓋緊管口，混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5m

8、in。6.加入150L溶液III(冰上預冷)，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上15 min。7.12000r/min離心15min將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8.向上清中加人等體積酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反復混勻，12000r/min，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后室溫放置510min. 12000r/min，離心5min.倒去上清液,把離合管倒扣在吸水紙上,吸干液體。10.加入20TE緩沖液,使DNA完全溶解,-4保存。四 實驗安排本實驗一天內(nèi)可做完。實驗結(jié)果可結(jié)合下一個實驗一起觀察。五、討論1.細胞的裂解作用是分離質(zhì)粒DNA實驗操作的關(guān)鍵步驟。

9、通常是加入溶菌酶或SDS來促使大腸桿菌細胞裂解的。如果寄主細胞沒有完全裂解,就會顯著降低質(zhì)粒DNA的回收率。理想的狀況是使每一個細胞都充分破裂到能使質(zhì)粒DNA順利溢出,而又沒有污染過多的染色體分子。2.提取過程中,除規(guī)定的實驗條件外,應盡量保持低溫,避免過酸過堿,操作中手法要溫和,防止機械剪切,盡可能避免脫氧核糖核酸酶對質(zhì)粒DNA的降解和破壞。3.采用酚/氯仿去除蛋白的效果較單獨使用酚或氯仿好。一般來講,要將蛋白質(zhì)盡量除干凈,需多次抽提,本實驗雖只抽提一次,已能達到實驗要求。注意在吸取上層水相時勿吸入下層有機相混于其中。4.乙醇沉淀質(zhì)粒DNA是最常用的沉淀方法,通常采用冷乙醇(無水乙醇貯于-2

10、0),沉淀條件為-20、1h。因本實驗為微量快速,室溫下數(shù)分鐘DNA即可沉淀,雖然DNA量少,但純度相對高(因為低溫長時間雜質(zhì)也一并沉淀下來),有利于以后的酶切及電泳結(jié)果。沉淀方法也可用異丙醇,只需0.54倍體積常溫下即可將DNA完全沉淀出來,這對于大體積的質(zhì)粒DNA沉淀十分有效。但缺點是常將鹽等亦同時沉淀出來,因此需要用70%乙醇很好地洗滌。一般來講廣泛應用的沉淀試劑還是乙醇。實驗三 DNA的限制性內(nèi)切酶解及電泳（參考酶使用說明書）一、實驗原理DNA的限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)是分子克隆和基因操作中最為基本和重要的方法之一。限制性核酸內(nèi)切酶,簡稱限制性內(nèi)切酶、限制酶或內(nèi)切酶,是一類能識別雙鏈DNA

11、分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶,主要存在于原核細胞中。限制性內(nèi)切酶有I、三類, 其中第II類酶在分子克隆和基因操作中最為有用,是常用的分子生物學工具酶,其基本特性如下:專一性地識別并切割特定的核苷酸序列,例如:EcoRI酶的識別與切割序列為:5'GAATTC3'3'CTTAAG5'2.識別的核苷酸數(shù)目多為46bp長度范圍,少數(shù)酶能識別更長的堿基序列,如813bp。3.識別序列大多數(shù)為二重對稱,或稱為回文序列。少數(shù)酶酶切后產(chǎn)生帶平末端的DNA片段,如HpaII、Alu I和PvuII等,但大多數(shù)酶切割產(chǎn)生的片段具有凸出的粘性末端,如EcoRI酶切后產(chǎn)生5F-P

12、粘性末端,而PstI則產(chǎn)生3'-OH粘性末端。4.有的不同來源的限制性內(nèi)切酶可以識別相同的序列,甚至切割位點也相同,這些酶稱為同裂酶或異源同工酶,例如HpaII和MspI。有的限制性內(nèi)切酶識別位點不同,但對DNA切割后能產(chǎn)生相同的粘性末端,這些酶稱為同尾酶,如BamHI、BglII、MboI、XhoII等。5.限制性內(nèi)切酶一般都以鎂離子為唯一的輔助因子,并要求有一定的鹽離子濃度、酸堿度和溫度條件。限制性內(nèi)切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同,可采用單酶切、雙酶切和部分酶切等不同

13、的方法。根據(jù)酶切反應的體積不同,又可分為小量酶切反應和大量酶切反應等。一般情況下,小量酶切反應用于質(zhì)粒等的酶切鑒定,體積為20L,大量酶切反應用于制備目的基因片段,體積為50100L。本實驗安排的是EcoRI對質(zhì)粒DNA的小量酶切、Hind和SalI對質(zhì)粒DNA的雙酶切以及Sau3AI對真核細胞基因組DNA的部分酶切。二 儀器、材料與試劑(一) 儀器高速離心機,冷凍離心機,水浴鍋,穩(wěn)壓電泳儀,電泳槽,手提式紫外檢測儀,紫外檢測儀,EP管,吸嘴,微量進樣器,燒杯,量筒,塑料手套,懾子,剪刀,三角瓶。(二)試劑(1)EcoRI 限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(2)HindIII 限

14、制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(3)NruI 限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(4)Sau 3AI限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(5)DNA的HindIII酶切樣品,作為相對分子質(zhì)量標準。(6)無菌水:量取50mL重蒸水于100mL三角瓶中,1.034×105Pa滅菌20mino分裝于幾只滅菌過的EP管中,貯存-20備用。(7)0.2%溴酚藍、50%蔗糖上樣緩沖液。(8)1mg/mL溴化乙錠溶液。(9)電泳緩沖液。(10)瓊脂糖。(三)材料純化的PCMV-M 質(zhì)粒DNA。三 實驗步驟(參考酶使用說明書)(一) PCMV-M 質(zhì)粒DNA的Ec

15、oRI小量酶解1.在無菌Ep管中用微量進樣器依次加入下列試劑無菌水7LEcoRI10×緩沖液2LPBR322質(zhì)粒DNA10L(含0.21gDNA)EcoRI限制性內(nèi)切酶1L(5U/L)總體積20.L2.離心2s,收集并混勻反應液。3.37水浴1.52h。4.取出Ep管,吸取12L進行電泳分析,以DNA HindIII酶切標準相對分子質(zhì)量為對照，電泳鑒定DNA酶解效果。如酶解不完全,可繼續(xù)37水浴,或加入適量限制性內(nèi)切酶后繼續(xù)反應。5.經(jīng)電泳觀察酶切反應完全后,將上述反應液置65水浴中1015min,中止酶切反應,保存于一20備用。(二)HindIII和Sal I對pBR322質(zhì)粒DN

16、A的雙酶切1.在無菌Ep管中周微量進樣器依次加入下列試劑無菌水15LHindIII 10×緩沖液2L質(zhì)粒DNA2L(含12gDNA)HindIII限制性內(nèi)切酶1L(5U/L)總體積20L2.離心2s,收集并混勻反應液。37水浴1h。3.加入1L1molANaCl,稍加混勻后再加入1L&門限制性內(nèi)切酶.4.離心2s,收集并混勻反應液。37水浴1h.5.以DNA HindIII酶切標準相對分子質(zhì)量為對照,電泳分析鑒定DNA酶解效果。(三)限制性內(nèi)切酶的部分酶解1.在0.5mLEP管中,建立以下混合體系進行基因組DNA酶解:10×Sau3AI緩沖液 5L提取的基因組DNA

17、20L(2560g)無菌重蒸水75L總計100L2.將上述混合物于55水浴15min,充分分散基因組DNA片段。3.將反應混合物分裝于5支Ep管中,其中管1為30L,管2管4各為20L,管5為10L。冰浴放置。4.按310U/gDNA的量加入Su3AI于管1,輕彈管壁混勻,短暫離心2S收集反應物,冰上放置。5.從管1中吸取10L反應物轉(zhuǎn)至管2,迅速混勻后,冰上放置。6.依次從管2吸取10L反應物至管3,管3至管4,管4至管5,連續(xù)稀釋后,各管體積均為20L。7.37保溫20min,68水浴58min,使Sau 3AI內(nèi)切酶失活,置于冰上.8.從每管20L酶解產(chǎn)物中各取4L在0.5%瓊脂糖凝膠中

18、電泳,低電壓下緩慢電泳516h,判斷不同酶解產(chǎn)物的大小范圍.四 實驗安排本實驗僅需半天到一天。五、討論1.實驗安排:本實驗僅需半天到一天,安排單酶切反應和部分酶切反應時,同時進行雙酶切反應中第一種酶的消化。第一種酶反應結(jié)束后,補充適當?shù)腘aC1,再加入第二種酶進行反應,此后可進行單酶切和部分酶切反應的電泳鑒定,直至雙酶切反應完全。也可僅安排單酶切反應或雙酶切反應。部分酶切實驗放到基因組DNA文庫構(gòu)建時進行。2.對于雙酶切反應,如果兩種限制性內(nèi)切酶反應條件相同或相似,可以同時加入兩種酶進行酶切,但反應體積應稍大些,以免保存酶的甘油濃度過高,影響酶的活性;如果酶的反應條件相差較大,一般先進行第一種

19、酶的酶切反應,消化結(jié)束后采用乙醇沉淀法,回收線性化的DNA,再建立第二種酶的酶解反應體系,繼續(xù)酶切。如果兩個酶的反應條件只是溫度上的差別,可以先加一種酶進行酶解,然后加入另一種酶在相應的溫度條件下反應。如果兩個酶的緩沖液中鹽濃度相差較大,也可如本實驗一樣,先進行低離子濃度酶的酶解反應,待酶解完全后,補加氯化納及相差的化學成分或調(diào)節(jié)pH值,再加入第二種酶繼續(xù)酶解或先進行較小體積的酶切反應,然后再用第二種酶要求的緩沖液稀釋后進行第二種酶的反應。3.酶切時加樣順序一般為水、緩沖液、DNA及酶液。其中水的體積可變,由反應體系中其余各成分定量后確定。吸取酶液時,要在冰浴上操作并從溶液表明吸取,以防止吸嘴

20、沾去過多的酶液,取液后蓋緊蓋子,立即放回-20冰箱,防止限制性內(nèi)切酶的失活。4.限制性內(nèi)切酶一般保存在50%甘油的緩沖液中。當酶切反應混合物中甘油的含量超過5%,將會抑制酶的活性或產(chǎn)生酶的星號活力,因此酶的用量體積一般不超過反應總體積的10%。5.DNA的質(zhì)量是影響酶切效果的因素之一。DNA中包括DNase在內(nèi)的蛋白雜酶等會使DNA降解,并且隨著酶切時間的增長,降解越嚴重。雜質(zhì)DNA或RNA會與酶發(fā)生非專一性的結(jié)合而使酶活相對減少,甚至會導致切不動目的DNA片段。樣品中酚、氯仿、乙醇和EDTA等有機或無機溶劑則能抑制酶的活性,量大時甚至使酶失活,因此DNA樣品的質(zhì)量要有所保證。實驗四 PCR基

21、因擴增及電泳1985年,美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室Mullis等人發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR),使人們夢寐以求的體外無限擴增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制,只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。開始是使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段來擴增人基因組中的特異片段,但該酶不耐熱。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(Thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶,將此酶命名為TaqDNA多聚酶(Taq DNA polymerase)。耐熱DNA聚

22、合酶的應用使得PCR反應更易于自動化,繼而PE-Cetus公司推出了第一臺PCR熱循環(huán)儀,使該技術(shù)的自動化成為現(xiàn)實。Mullis等因此項技術(shù)于1993年獲得諾貝爾獎。而PCR技術(shù)也成為生物醫(yī)學領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。一 實驗原理多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種體外酶促擴增特定DNA片段的技術(shù)，由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等3步反應組成一個周期，多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其基本原理類似于DNA的天然復制過程：單鏈DNA模板在一小段互補聚核苷酸引物引導下，利用DNA聚合酶的酶促反應按53方向復制出互

23、補DNA。在待擴增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物,經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后,DNA擴增2n倍。1.變性:加熱使模板DNA在高溫下(94)變性,雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈,即變性階段。2.退火:使溶液溫度降至5060,模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合,即退火階段。3.延伸:溶液反應溫度升至72,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導下,利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTP),按5'3'方向復制出互補DNA,即引物的延伸階段。上述3步為一個循環(huán), 從理論上講,每經(jīng)過一個循環(huán),樣本中的DNA量應該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪

24、循環(huán)的模板,經(jīng)過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。PCR能快速靈敏特異地擴增目的基因或DNA片段，成為分子生物學和基因工程的有效手段，可用于基因的分離克隆核苷酸序列分析基因表達調(diào)控的研究遺傳病和傳染病的診斷致病機制的探索和法醫(yī)鑒定等諸多方面。典型的PCR反應體系由如下組分組成:DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgC12、兩個合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。二 儀器、材料與試劑(一)儀器1.PCR熱循環(huán)儀 2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（二)材料1.DNA模板2.4種dNTP3.引物1、引物24.Taq酶5.瓊脂糖6.DNA相對分子質(zhì)量標準物7.吸頭、80.2mlPCR管(三)試劑1.

25、10×緩沖液500mmol/LKCl100mmol/LTris-HCl(pH8.3,室溫)15mmol/LMgC120.1% 明膠2. 4×dNTP1mmol/L dATP1mmol/L dCTP1mmol/L dGTP1mmol/L dTTP3. Tag酶 1U/L4. DNA模板 lng/mL5. 引物1 引物2 （引物溶液濃度 10pmo1/L）三 實驗步驟1. 在0.5mLEppendorf管內(nèi)配制25L反應體系反應物 體積/LddH20 1110×PCR緩沖液 2.52.5mmol/LdNTP 2.025mmol/LMgC12 1.5引物1 1.0引物2

26、 1.0模板DNA 5Tag酶 1混勻,加25L石蠟油。2.按下述程序進行擴增94預變性 2 min94變性 45sec57退火 1min72延伸 45sec重復步驟30次:72延伸 3min4 保存3.瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果 配制1%瓊脂糖凝膠,取8L擴增產(chǎn)物電泳。保持電流4OmA。電泳結(jié)束后,用EB染色15min,紫外燈下觀察結(jié)果。四 實驗安排 本實驗1天內(nèi)可完成，上午做PCR反應，下午做電泳檢測五 討論1.假陰性,不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:模板核酸的制備;引物的質(zhì)量與特異性;酶的質(zhì)量;PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板:模板中含有Taq酶抑制劑;

27、在提取制備模板時丟失過多,或吸人盼;模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時,不出現(xiàn)擴增帶,有可能是模板核酸提取過程出了毛病,可使用陽性對照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有

28、條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏,導致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度: Mg2+千濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20L、30L、50L或100L,應用多大體積進行PCR擴增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20L后,再做大體積時,一定要

29、模索條件,否則容易失敗。物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率,退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。2.假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行P

30、CR擴增時,擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列O靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應高壓滅菌O所用離心管及進樣吸頭等均應一次性使用O必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性,可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產(chǎn)物,而導致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消

31、除。3.出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體;二是與Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有:必要時重新設(shè)計引物;減低酶量或調(diào)換另一來源的酶;降低引物量,適當增加模板量,減少循環(huán)次數(shù);適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性,65左右退火與延伸)。4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地

32、毯樣帶,其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高, Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶;減少dNTP的濃度;適當降低Mg2+濃度;增加模實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構(gòu)建之后,需要導人適當?shù)乃拗骷毎M行繁殖,才能夠獲得大量的單一的重組體DNA分子。將外源DNA分子導入受體細胞的途徑,包括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導、顯微注射和電擊穿孔等多種不同的方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導主要適用于細菌一類的原核細胞和酵母這樣的低等真核細胞,而顯微注射和電擊穿孔則主要應用于高等動植物的真核細胞。在基因操作中,轉(zhuǎn)化一詞嚴格

33、地說,是指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲和表達質(zhì)粒載體DNA分子的過程,而轉(zhuǎn)染一詞則是專指感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達噬菌體DNA分子的過程。但二者從本質(zhì)上講沒有什么根本的區(qū)別,無論是轉(zhuǎn)化還是轉(zhuǎn)染,其關(guān)鍵的因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細胞,以提高膜的通透性,從而使外源DNA分子能夠容易進入細胞內(nèi)部。所以習慣上,人們往往也通稱轉(zhuǎn)染為廣義的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株(常用R-、M-表示)。受體細胞經(jīng)過一些特殊的方法處理后,細胞膜的通透性發(fā)生變化,為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細胞。在一定條件下,將帶有外源DNA分子的重組體與感受態(tài)

34、細胞混合保溫,使DNA分子進入受體細胞。進入細胞的DNA分子通過復制和表達,實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,從而使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化體,即帶有異源DNA分子的受體細胞。通過本實驗的學習,加深理解轉(zhuǎn)化在分子生物學研究中的意義和應用,并掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞、外源質(zhì)粒DNA分子進入受體菌細胞并篩選轉(zhuǎn)化體等方法。一、實驗原理用物理或化學的方法誘導細胞進入感受態(tài)的操作叫致敏過程。本實驗以大腸桿菌(Escherichia)DH5菌株為受體細胞,用CaCl2試劑處理受體菌,當細菌經(jīng)過冰冷的CaCl2溶液處理后,細菌細胞在0和低滲狀態(tài)下,膨脹成球

35、形,然后與質(zhì)粒pIIC19DNA混合,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,經(jīng)42短暫熱沖擊處理后,促進細胞吸收DNA復合物。當加入適宜培養(yǎng)基恢復細胞特性并在平板上培養(yǎng)生長數(shù)小時后,細胞分裂增殖,被轉(zhuǎn)化的細菌中,重組子基因得到表達。pUC19質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因,因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉素的特性,用AmpR表示。這樣在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上,只有轉(zhuǎn)化體才能存活,而未受轉(zhuǎn)化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化體經(jīng)過擴增培養(yǎng)后,可將轉(zhuǎn)入的外源DNA分子分離提取出來,進行電泳、電鏡觀察,并制作限制性內(nèi)切酶切割圖譜、分子

36、雜交及DNA測序等分子生物學實驗。二 儀器、材料與試劑(一) 儀器1.超凈工作臺2.低溫離心機3.恒溫搖床4.恒溫箱5.-70冰箱6.恒溫水浴器(二)材料1.氯化鈣(CaCL2)2.膜蛋白胨3.酵母提取物4.氯化鈉(NaCL)5.氨芐青霉素6.大腸桿菌DH57.pQE30質(zhì)粒8.50mL離心管9.吸頭、小指管10.試管、培養(yǎng)血、錐形瓶等(三)試劑1.0.1mol/LCaCL溶液2.LB液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基,應在950mL去離子水中加入:膜蛋白胨(bactoptone) 10g酵母提取物(bacto-yeastextract) 5gNaCL l0g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解,用NaoH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至