消化性潰瘍幽門螺桿菌感染與Toll樣受體4基因多態(tài)性的相關性研究

1、消化性潰瘍幽門螺桿菌感染與Toll樣受體4基因多態(tài)性的相關性研究【關鍵詞】 消化性 潰瘍幽門螺桿菌感染 Toll樣受體HP感染是引起人類慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌等疾病的病因之一，但研究發(fā)現(xiàn)在HP感染者中僅有極少數(shù)會發(fā)生上述疾病。HP 致病機制與細菌數(shù)量、毒力以及環(huán)境因素、宿主易感性、胃腸黏膜內(nèi)環(huán)境等有關。人類TLR4通過識別病原相關分子構型(PAMPs),激活先天性免疫應答機制，同時還誘導共刺激分子CD80的表達，為獲得性免疫的啟動提供活化信號，因此在免疫系統(tǒng)中有著十分重要的作用1。TLR4作為細菌脂多糖(LPS)的受體, 將LPS傳導通路的信號迅速傳至核內(nèi), 通過激活核因子-kB(NF-k

2、B), 刺激NO分泌, 消滅病原；還可促進炎性細胞因子表達與釋放, 激活特異性免疫反應2。本研究通過探討TLR4基因突變與HP感染相關性消化性潰瘍的關系, 旨在為闡明HP 感染相關性消化性潰瘍的遺傳易感性和先天性免疫機制提供依據(jù)。1 臨床資料1.1 一般資料于2006年7月至2007年6月間，在溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，依據(jù)悉尼分類標準3收集消化性潰瘍患者120例(胃潰瘍51例、十二指腸球部潰瘍69例)。其中男72例, 女48例；平均年齡52.2歲。正常體檢者204例作為對照組, 男104例, 女100例；平均年齡39.2歲。1.2 方法(1)取外周靜脈血5ml， EDTA抗凝，蛋白酶K

3、/酚/氯仿法提取基因組DNA。(2)PCR擴增目的基因，根據(jù)文獻設計引物4如下。PCR反應體系25l，每側引物各10pmol，dNTPs(10mmol/L)0.5l，DNA聚合酶1U,DNA模板1l(約40-100ng)。反應條件：94預變性3min，接著38個循環(huán)，94變性45s，51復性45s，72延伸45s，72終末循環(huán)5min，最后于4終止反應。PCR產(chǎn)物片段長度139bp或131bp，用2%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分析儀鑒定。(3)TLR4 Asp299Gly基因多態(tài)性分析：限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物 酶切反應體系20l，含10l PCR()的產(chǎn)物，用BsaBI 內(nèi)切酶0.5l(10U/

4、l)，于55消化酶切4h；取10l PCR() 的產(chǎn)物，用BstXI內(nèi)切酶0.5l，于65消化酶切4h后 80滅活20min；酶切產(chǎn)物用8%的非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳(100V,1.5h)分離，1硝酸銀染色分析基因型；基因測序：部分PCR()及PCR() 產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程服務有限公司進行DNA測序，測序樣品作為陽性對照；消化性潰瘍患者均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定HP-IgG。同時采用胃竇黏膜組織快速尿素酶試驗(pH值指示劑法), 檢測HP感染。診斷HP感染參照安徽桐城會議通過的共識意見5, 2項均陽性診斷HP感染。正常體檢者采用14C-尿素呼氣試驗, 檢測HP感染，檢

5、測前所有研究對象均未行抗HP治療。1.3 統(tǒng)計學處理SPSS 11.5軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用2檢驗分析病例組和對照組Asp299Gly基因型頻率及等位基因分布的差異，以及分析TLR4基因Asp299Gly基因型與HP感染相關性消化性潰瘍之間的關系。P<0.05有顯著性差異。2 結果浙江漢族人群中，TLR4基因Asp299Gly等位基因位點均為野生型A, 未見突變型G; A等位基因頻率及AA基因型頻率均為100%。消化性潰瘍組及正常對照組TLR4基因Asp299Gly基因型頻率，等位基因頻率及攜帶者頻率分布無顯著性差異。TLR4基因Asp299Gly多態(tài)性與HP感染關系，消化性潰瘍患者中H

6、P感染率為94.7%, 正常對照為60.1%; 兩組中TLR4基因Asp299Gly基因型頻率, 等位基因頻率及攜帶者頻率分布無差異,所有研究個體均為AA純合子。參照文獻結果6，將漢族人群TLR4基因Asp299Gly多態(tài)性與外國人群比較，發(fā)現(xiàn)TLR4基因Asp299Gly等位基因頻率及基因型頻率存在種族差異。漢族人和日本人該等位基因均為野生型A，未發(fā)現(xiàn)突變型G；與荷蘭高加索人相比，等位基因頻率及基因型頻率具有顯著性差異。AA基因型頻率在中國浙江漢族人群(2=33.064，P=0.000，OR=1.183，95%CI:1.0801.296)及日本人群(2=42.682，P=0.0001，OR=

7、1.183，95%CI:1.1091.262)中顯著高于荷蘭人群；而荷蘭人群等位基因A的頻率明顯高于中國人群(2=37.403，P=0.000，OR=1.098，95%CI:1.0471.151)及日本人群(2=42.597，P=0.000，OR=1.125，95%CI:1.0771.175)。由此可見中國及日本人群與荷蘭高加索人TLR4基因Asp299Gly位點多態(tài)性分布存在顯著性差異。3 討論TLR是人類在進化過程中所保留的參與先天性抗感染的受體蛋白家族，具有高度保守性。TLR不僅通過識別病原微生物的PAMP, 激活先天性免疫反應, 還誘導共刺激分子CD80的表達，為獲得性免疫的啟動提供必

8、要的活化信號，因此在免疫系統(tǒng)中有著十分重要的作用。TLR超家族已發(fā)現(xiàn)有10個家族成員，其中TLR4、TLR2與宿主的免疫功能有著密切聯(lián)系，可識別不同的病原分子。TLR4主要作為革蘭陰性菌LPS的特異性受體，在LPS誘導的信號傳導中起著重要作用，TLR2則主要作為革蘭陽性菌的肽聚糖、酵母菌的甘露聚糖及某些特定的LPS的受體。TLR4接觸不同的抗原分子后，通過協(xié)同分子CD14、LPS結合蛋白、MD2的共同作用，經(jīng)由MyD88、TIRAP/MAL等信號傳導途徑，將LPS傳導通路的信號迅速傳至核內(nèi)，激活NF-B通道，刺激NO分泌，消滅病原菌；此外，激活相關細胞因子的表達，釋放炎癥細胞因子，激活特異性免

9、疫反應，因而在機體的先天性免疫中起到十分重要的作用。Arbour等用單鏈構象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)和基因測序的方法發(fā)現(xiàn)了TLR4基因的非同義的單核甘酸多態(tài)性Asp299Gly和Thr399Ile，除體外轉染研究證實Asp299Gly多態(tài)性與LPS的反應減低有關外，Asp299Gly和Thr399Ile等位基因雜合子和純合子個體與野生型基因型的個體相比，吸入性LPS的氣道反應明顯減低。小鼠C3H/HeJ和C57BL/10ScCr株對LPS高度抵抗，缺乏先天性免疫的生物作用，易受感染,是由于小鼠TLR4基因突變導致對LPS無反應，或LPS信號傳導異常所致。野生型TLR4的表達增強可使LP

10、S的信號增強。研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因的突變可改變腸黏膜先天性免疫細胞和腸上皮TLR4分子結構，使機體的免疫系統(tǒng)失去正常處理腸腔內(nèi)的大量細菌和LPS等病原分子的能力，進而使腸黏膜在長期的刺激下產(chǎn)生感染、炎癥、過敏、易激乃至癌變。流行病學調(diào)查結果顯示：人群中HP感染率與其社會經(jīng)濟地位關系密切， 發(fā)達國家成人HP感染率<40%,而我國人群感染率為20%80%，明顯高于經(jīng)濟發(fā)達國家。本研究中, 正常浙江漢族人群HP感染率是60.1%, 與以上的研究結果一致。同時已有大量研究資料顯示: HP感染率高的地區(qū)和國家人群的胃炎和消化性潰瘍的發(fā)病率也較高，如經(jīng)濟落后國家同發(fā)達的歐美國家比較, HP感染相關性

11、胃炎和消化性潰瘍的發(fā)病率也高。 通過對浙江漢族人群HP感染的檢測, 發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍患者組HP感染率顯著高于對照組(P0.000, OR=12.512,95%CI:5.25529.792)。本研究采用PCR限制性片段長度多態(tài)性分析的方法, 對120例消化性潰瘍患者及204例正常對照者TLR4基因sp299Gly基因型及等位基因分布進行檢測, 發(fā)現(xiàn)所有樣本均為野生型基因型, 提示在中國浙江漢族人群中罕見TLR4基因Asp299Gly突變基因型。樹突狀細胞(DC)是重要的抗原提呈細胞，在機體免疫應答過程中起著至關重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)胃黏膜上皮DC能穿過胃上皮細胞間的緊密連接, 到達胃黏液層與HP

12、接觸7, HP能夠特異性地定植于胃黏膜的黏液層下的上皮細胞表面；另發(fā)現(xiàn)在活體內(nèi)胃上皮細胞可以表達TLR8。國外Bauditz 等對HP感染相關性胃炎進行研究, 發(fā)現(xiàn)LPS引起胃黏膜單核細胞分泌大量IL-12, 在胃粘膜上皮細胞表達的TLRs與HP的LPS相互作用后, 通過TLR4/CD14途徑激活單核巨噬細胞分泌細胞因子, 如TNF-, IL-1, IL-6, IL-8等, 引起胃黏膜的炎癥。Su 等10發(fā)現(xiàn)與臨床相關的型HP和型HP感染能激活TLR4基因的表達, Kawahara 等11發(fā)現(xiàn)型HP的脂質(zhì)A可以激活TLR4途徑。本研究將漢族消化性潰瘍患者按HP感染分類后, 未發(fā)現(xiàn)TLR4基因A

13、sp299Gly突變基因型, 與正常對照組相比無顯著性差異，提示TLR4基因Asp299Gly多態(tài)性與漢族HP感染相關性消化性潰瘍的發(fā)生無相關性。本研究將中國浙江漢族人群與其他人種的TLR4基因的Asp299Gly多態(tài)性分布進行分析比較，發(fā)現(xiàn)不同人群中TLR4基因Asp299Gly等位基因頻率及基因型頻率的分布存在顯著性差異。其中中國漢族人與日本人的Asp299Gly等位基因頻率及基因型頻率分布無明顯差異性, 即在所檢測的樣本中均未發(fā)現(xiàn)TLR4基因Asp299Gly的突變基因型, 與荷蘭高加索人群突變頻率存在明顯差異，提示由于歐亞人種在TLR4基因Asp299Gly等位基因及基因型頻率分布的不

14、同,導致種族差異和遺傳背景的不同, 從而影響TLR4基因多態(tài)性在消化性潰瘍等疾病的遺傳機制中的作用。另外由于CD14是TLR4信號傳導途徑中重要的協(xié)同分子，CD14基因多態(tài)性在不同人種之間的分布差異也可能影響TLR4在HP的 LPS抗原呈遞和胞內(nèi)信號傳導過程中所發(fā)揮的作用。【參考文獻】 1 Akira S,Takeda K,Kaisho T.Toll-like receptors:critical proteins linking innate and acquired immunity.Nat.Immunol，2001，2:675680. 2 Chow JC, Young DW, Golen

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