現(xiàn)代基因工程_02從活細(xì)胞中純化DNA

1、 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 基因工程第二講：從活細(xì)胞中純化DNAPurification of DNA from Living Cells Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 概述 制備

2、不同種類的DNA2.1 全細(xì)胞DNA的制備2.2 質(zhì)粒DNA的制備2.3 噬菌體DNA的制備講課提綱講課提綱 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 很多時(shí)候，基因工程學(xué)家有必要準(zhǔn)備至少3種不同種類的DNA。首先-全細(xì)胞DNA： 作為提取所需克隆基因的材料來源，是必須得到的。 全細(xì)胞DNA可以從細(xì)菌培養(yǎng)物、植物、動(dòng)物細(xì)胞或其他任何用作研究的生物中獲取。 Lecture of Biotechnolog

3、y； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 第二種-純凈的質(zhì)粒DNA：從細(xì)菌中制備質(zhì)粒DNA與純化細(xì)胞總DNA遵循基本相同的步驟，只是在某個(gè)階段有著一些明顯的差別。在這個(gè)階段內(nèi)，質(zhì)粒DNA必須從細(xì)胞中的主要染色體DNA中分離出來，同時(shí)主要染色體DNA仍然要保留在細(xì)胞中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environ

4、ment engineering, University 最后，如果用噬菌體克隆載體，需要制備噬菌體DNA。噬菌體DNA一般都是從噬菌體顆粒中制得，不從被侵染細(xì)胞中制得，因此不存在被細(xì)菌DNA污染的問題。但在除去噬菌體衣殼過程中需要用到專門技術(shù)。一個(gè)例外：M13噬菌體的雙鏈復(fù)制模式， 像細(xì)菌質(zhì)粒一樣，M13噬菌體DNA也能夠從被侵染的大腸桿菌中獲得。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.1

5、全細(xì)胞DNA的制備制備細(xì)菌細(xì)胞的全部DNADNA時(shí)，用的是最簡單的DNA純化步驟。步驟分為4個(gè)階段：(1)培養(yǎng)細(xì)胞的生長和收集。(2)細(xì)胞被破碎并釋放出內(nèi)含物。(3) 細(xì)胞抽提物被除去DNA外的所有成分。(4)得到的DNA溶液被濃縮。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartme

6、nt of chemistry and environment engineering, University 2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長和收集讓絕大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基中生長起來并不困難。培養(yǎng)基必須能夠提供一個(gè)基本營養(yǎng)物的混合平衡體系，而每種基本營養(yǎng)成分的濃度應(yīng)該能夠保證細(xì)菌有效的生長和繁殖。在M9和LB是兩種典型的培養(yǎng)基。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University M9培養(yǎng)基M9是一種

7、典型的確定成分培養(yǎng)基，其中所有成分都是可知的。無機(jī)營養(yǎng)成分的混合物：提供基本元素，如氮、鎂和鈣葡萄糖：提供碳源和能量。實(shí)際上，額外的生長因子如微量元素和維生素也必須加入M9中以維持細(xì)菌生長。需準(zhǔn)確添加何種補(bǔ)充成分要視具體情況而定。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University LB培養(yǎng)基一種更加復(fù)雜的不確定成分培養(yǎng)基， 即LB包含的成分及成分含量都是未知的。因?yàn)閮煞N主要成分：胰蛋白胨和酵母提取物，本身就是

8、不確定化學(xué)成分的復(fù)雜混合物。胰蛋白胨：提供氨基酸以及小的肽段；酵母提取物(酵母細(xì)胞部分消化后的干粉)：提供氮源、糖類以及其他有機(jī)和無機(jī)營養(yǎng)。類似LB的混合培養(yǎng)基并不需要另外再補(bǔ)充成分，并能夠維持種類范圍很廣的細(xì)菌生長。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)物需要在嚴(yán)格準(zhǔn)確的條件控制下生長時(shí)，必須應(yīng)用確定成分培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)物僅僅作為一種DNA的來源時(shí)，更適用混合培養(yǎng)基。在37、LB培養(yǎng)基

9、、150-250r/min旋轉(zhuǎn)條件下大腸桿菌細(xì)胞大約每20min分裂一次，直到達(dá)到了約2109 - 3109個(gè)ml的最大密度。培養(yǎng)物的生長狀況能夠通過讀取600nm可見光分光光度值(OD值)來進(jìn)行監(jiān)測(cè)(圖3-2)，在該波長下每個(gè)單位的OD值相當(dāng)于0.8109個(gè)ml。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S

10、. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 為了便于獲得細(xì)胞的提取物，細(xì)菌必須盡在可能小的體積中被獲得，因此需要在離心機(jī)中對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心以收集細(xì)胞(圖3-3)。較低的離心轉(zhuǎn)速就能夠使細(xì)菌在離心管底部聚集，上層的培養(yǎng)基能夠很容易倒出。1000ml培養(yǎng)基中獲得的最大密度的細(xì)菌能夠通過離心后再次懸浮在不到10ml的液體中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and enviro

11、nment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.1.2 細(xì)胞提取物的制備釋放細(xì)胞內(nèi)含物之前必須去除: 細(xì)胞膜； 堅(jiān)固的細(xì)胞壁； 特殊細(xì)菌(含E.coli)細(xì)胞壁外第二層外膜。裂解細(xì)菌細(xì)胞的技術(shù)大體分為兩種： 物理方法和化學(xué)方法。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDep

12、artment of chemistry and environment engineering, University 物理方法： 以機(jī)械力的方法打破細(xì)胞外的屏障；化學(xué)方法： 將細(xì)胞暴露在能夠?qū)?xì)胞整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的化學(xué)藥物中。以制備DNA為目的進(jìn)行細(xì)胞破碎時(shí)，化學(xué)方法的使用更加廣泛。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 化學(xué)方法包括： 一種能夠攻擊細(xì)胞壁的成分 一種能夠除去細(xì)胞膜的成分圖3-

13、4(a)。所用的化學(xué)物質(zhì)通常視細(xì)菌的種類而定。削弱細(xì)胞壁：溶菌酶； 乙二胺四乙酸鹽(EDTA)； 或兩者相結(jié)合。 常用于：大腸桿菌和相關(guān)的菌 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 溶菌酶： 存在于雞蛋清、一些分泌物如眼淚和唾液。 能夠消化賦予細(xì)胞壁堅(jiān)固性的多聚混合物。EDTA： 通過螯合除去鈣離子（保持整個(gè)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)必不可少）； 抑制細(xì)胞質(zhì)中降解DNA的酶。 Lecture of Biotechn

14、ology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 某些條件下，用溶菌酶或EDTA來削弱細(xì)胞壁足以導(dǎo)致細(xì)胞破裂，但通常還要加入一些去垢劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)。去垢劑： 通過移除液體分子并導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，協(xié)助了整個(gè)細(xì)胞外壁的溶解過程。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering

15、, University 溶解細(xì)胞、制備細(xì)胞提取物的最后一步： 細(xì)胞內(nèi)不溶性殘?jiān)娜コ７椒ǎ弘x心底部：部分消化的細(xì)胞壁碎片等成分上清：細(xì)胞提取物 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering,

16、 University 2.1.3 從細(xì)胞提取物中純化DNA細(xì)菌提取物包含： DNA; 大量的蛋白質(zhì)和RNA（屬于多余成分）。去蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法： 加入苯酚; 或1:1的苯酚與氯仿的混合物。原理：能沉淀出蛋白質(zhì)但仍保留核酸(DNA和RNA)在水溶液中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 結(jié)果：如果細(xì)胞提取物和有機(jī)溶劑逐漸混合并離心后，沉淀出的蛋白質(zhì)分子會(huì)聚集在水溶液和有機(jī)溶劑分層的兩相界面處形

17、成白色的凝集物(圖3-5)。所以：水溶液中的核酸分子就能夠用吸管分離出來。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 有時(shí)單獨(dú)使用苯酚不足以徹底去掉蛋白、純化核酸。解

18、決方法：通過連續(xù)多次苯酚提取但不理想。 因?yàn)椋好窟M(jìn)行一次混合和離心都會(huì)導(dǎo)致一定數(shù)量的DNA分子斷裂。正確的處理辦法：苯酚提取前，先用蛋白酶對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行處理，比如鏈霉蛋白酶或蛋白酶K。 這些酶將肽段降解成更小單元，便于苯酚提取。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 一些RNA分子，特別是mRNA，會(huì)在苯酚處理過程中被除去，但是絕大多數(shù)的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的除去RNA的方

19、法： 使用核糖核酸酶，它能夠迅速降解RNA分子，把它們變成核苷酸單元。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.1.4 DNA樣品的濃縮最常用：乙醇沉淀。在鹽(嚴(yán)格來說是單價(jià)陽離子如鈉離子)存在下，無水乙醇在-20或以下能夠有效地使多聚核苷酸沉淀。乙醇沉淀法的額外優(yōu)點(diǎn)是將短鏈和單體核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶處理產(chǎn)生的核苷酸因此在這一步得到了去除。 Lecture of Biotechnol

20、ogy； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 對(duì)于濃的DNA溶液，乙醇能夠在樣品的上方形成一個(gè)分層，使得核酸分子在兩相界面處沉淀出來。一個(gè)技巧：將一根玻璃棒穿過乙醇層伸入核酸溶液中。當(dāng)棒子被取出的時(shí)候，DNA分子就會(huì)呈纖維狀黏附在棒上面而從溶液中取出。當(dāng)乙醇和DNA溶液混合時(shí)，DNA沉淀能夠通過離心得到，并隨后能溶解在合適量的水中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDe

21、partment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.1.5 DNA濃度的測(cè)量在實(shí)施基因克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，確切知道溶液中的DNA含量是十分關(guān)鍵的。DNA濃度能夠通過紫外吸收分光光度測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。被DNA溶液吸收的紫外線的量能夠直接正比于樣品溶液中的DNA含量。通常吸收量在260nm被測(cè)定，1

22、.0的吸收值對(duì)應(yīng)于每毫升中50g雙鏈DNA。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 紫外吸收還被用來檢測(cè)DNA的純度。純凈的DNA樣品，在波長260nm和280nm的吸收量之比(A260A280 )應(yīng)為1.8。如果實(shí)際測(cè)量時(shí)比例小于1.8，表示樣品被蛋白質(zhì)或苯酚污染。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment

23、 of chemistry and environment engineering, University 2.1.6 從細(xì)菌外的生物體制備全細(xì)胞DNA盡管各種來源細(xì)胞DNA的純化基本步驟不變，但要考慮所用細(xì)胞的一些特性，并對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟加以調(diào)整。 主要的調(diào)整發(fā)生在細(xì)胞破碎階段。破碎細(xì)菌時(shí)所使用的化學(xué)藥物對(duì)其他生物細(xì)胞并不總是適用。 比如，溶菌酶對(duì)植物細(xì)胞就毫無作用。專一性的降解酶對(duì)絕大多數(shù)的細(xì)胞壁都適用，通常一些物理方法，如用研缽對(duì)冷凍材料研磨更有效。絕大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞僅用去垢劑處理就能夠去掉外被。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S.

24、Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 需要著重考慮：需要提取DNA的細(xì)胞的生化成分。細(xì)菌：主要的細(xì)胞提取物是蛋白質(zhì)、DNA和RNA。 苯酚提取或蛋白酶降解，核糖核酸酶分解RNA，就能得到純凈的DNA樣品。如果細(xì)胞中還包含大量的其他生化成分，這些處理就顯得不足以制得純凈的DNA。植物組織的處理尤其困難，因?yàn)樗鼈兘?jīng)常含有大量的碳水化合物，這些碳水化合物不能夠通過苯酚提取而除去，所以需要使用一些不同的方法（見示例）。 Lecture of Biotechnology； All Right Reser

25、ved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.2 質(zhì)粒DNA的制備從細(xì)菌中純化質(zhì)粒和全細(xì)胞DNA的制備一樣，具有相同的一般方法：含質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)物，在液體培養(yǎng)基中生長；細(xì)菌被收集，制成細(xì)胞提取物。細(xì)胞提取物被除掉蛋白質(zhì)和RNA，DNA則利用乙醇沉淀法盡可能進(jìn)行濃縮。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, U

26、niversity 在質(zhì)粒制備過程中，通常需要從同處于細(xì)胞中、大量的細(xì)菌染色體DNA中分離出含量相對(duì)較少的質(zhì)粒DNA。分離這兩種不同類型的DNA是十分困難的。在基因克隆實(shí)驗(yàn)過程中，即使存在極小量的雜質(zhì)細(xì)菌DNA，也很容易導(dǎo)致結(jié)果不理想。分離方法的原理：質(zhì)粒DNA與細(xì)菌DNA物理性質(zhì)上的一些差異，其中最明顯的是分子大小。最大的質(zhì)粒是大腸桿菌染色體的8，絕大多數(shù)質(zhì)粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于它。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, Uni

27、versity 質(zhì)粒DNA與細(xì)菌DNA在構(gòu)造上也有不同。質(zhì)粒和細(xì)菌染色體是環(huán)狀分子，但在細(xì)胞提取物的制備過程中染色體通常斷裂形成線狀的片段。因此可以用從線狀DNA分子中分離出環(huán)狀DNA分子的方法用來純化質(zhì)粒。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.2.1 基于分子大小的分離通常出現(xiàn)在細(xì)胞提取物的制備過程這一階段。如果細(xì)胞在非常仔細(xì)控制的條件下溶解，就能夠保證只有很少量的染色體DNA碎片出現(xiàn)。這

28、樣得到的DNA片段仍然很大-遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒-能夠通過離心與細(xì)胞殘存物一同被清除。這一過程因?yàn)榧?xì)菌染色體通常都貼附在細(xì)胞外壁上而變得容易，如果這種貼附不斷裂，染色體片段就會(huì)與細(xì)胞殘存物一同沉淀出來。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 細(xì)胞裂解必須進(jìn)行得非常小心謹(jǐn)慎，以防止細(xì)菌DNA的大規(guī)模斷裂。在蔗糖存在時(shí)用EDTA和溶菌酶進(jìn)行處理，可以防止細(xì)胞的立刻破裂。接下來，細(xì)胞壁被部分瓦解后形成原生質(zhì)球粒

29、體，但是細(xì)胞質(zhì)膜仍然完好無損。現(xiàn)在細(xì)胞溶解將受到非離子去垢劑如Triton-100(這是因?yàn)殡x子去垢劑如SDS，會(huì)引起染色體斷裂)的誘導(dǎo)，因此離心后的裂解上清中，包含有幾乎全部的質(zhì)粒DNA。澄清溶菌液也不可避免殘存一些染色體DNA。而且，如果質(zhì)粒本身就是大分子，它們本身也有可能與細(xì)胞殘留物一起沉淀出來。因此利用分子大小分離DNA本身并不十分有效。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lectur

30、e of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.2.2 基于構(gòu)造的分離把質(zhì)粒DNA描述成環(huán)狀分子構(gòu)象不準(zhǔn)確.因?yàn)樗^的雙鏈DNA環(huán)實(shí)際上能分為兩種截然不同的構(gòu)象。絕大多數(shù)質(zhì)粒都是以超螺旋分子的形式存在于細(xì)胞中。超螺旋的發(fā)生是因?yàn)樵谫|(zhì)粒復(fù)制過程中在被稱作拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下，質(zhì)粒DNA雙螺旋的部分松散造成的。超螺旋構(gòu)象只有在兩條多聚核苷酸鏈都完好無缺的條件下才能夠保持，從而也被命名為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA。 Lecture

31、 of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 如果其中一條多聚核苷酸鏈斷裂，雙螺旋就會(huì)回復(fù)其正常的松弛狀態(tài)，質(zhì)粒就會(huì)因此轉(zhuǎn)變成另外一種構(gòu)象，稱作開環(huán)結(jié)構(gòu)。因?yàn)槌菪肿雍苋菀淄渌浅菪鼶NA分子相分離，故超螺旋構(gòu)象在質(zhì)粒制備中非常重要。有兩種不同的方法被用于從細(xì)胞粗提物中純化質(zhì)粒DNA.如果一開始能夠制得澄清溶菌液，會(huì)獲得更好的結(jié)果。 Lecture of Biotechnology； All Right Rese

32、rved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 如果其中一條多聚核苷酸鏈斷裂，雙螺旋就會(huì)回復(fù)其正常的松弛狀態(tài)，質(zhì)粒就會(huì)因此轉(zhuǎn)變成另外一種構(gòu)象，稱作開環(huán)結(jié)構(gòu)。因?yàn)槌菪肿雍苋菀淄渌浅菪鼶NA分子相分離，故超螺旋構(gòu)象在質(zhì)粒制備中非常重要。在這里，有兩種不同的方法常常被用到，它們都能夠用于從細(xì)胞粗提物中純化質(zhì)粒DNA，當(dāng)然如果一開始能夠制得澄清溶菌液，會(huì)獲得更好的結(jié)果。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDe

33、partment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 堿變性原理： 在一個(gè)窄的pH范圍內(nèi)非超螺旋DNA被變性，而超螺旋質(zhì)粒DNA不發(fā)生變性。 如果氫氧化鈉被加入細(xì)胞提取液或澄清溶菌液中，pH被調(diào)整到12.0-12.5的范圍內(nèi)，連接非超螺旋DNA分子的氫鍵被打破，導(dǎo)致雙螺旋松解，兩條核酸鏈相互

34、分離(圖3-11)。 如果此時(shí)加入酸，變性細(xì)菌DNA鏈會(huì)雜亂地聚集成一堆。這些不溶的交聯(lián)網(wǎng)狀物質(zhì)會(huì)被離心除去，只剩下純凈的質(zhì)粒DNA在懸液中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 這一處理方法的額外優(yōu)點(diǎn): 在某些環(huán)境下(尤其是利用SDS溶解細(xì)胞以及醋酸鹽中和溶液時(shí))，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和RNA也變成不溶物并在離心的步驟中被除去。 因此如果使用堿變性的方法，苯酚提取和核糖核酸酶的處理就沒有必要了。 L

35、ecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 溴乙錠-氯化銫密度梯度離心這是平衡與密度梯度離心中一個(gè)專門的分支。密度梯度是通過在非常高的轉(zhuǎn)速下對(duì)氯化銫溶液進(jìn)行離心而得到的圖

36、3-12(a)。梯度的產(chǎn)生是因?yàn)樵趶?qiáng)的離心力的作用下，銫離子和氯離子被推到了離心管的底部。這些離子在向下遷移過程中通過擴(kuò)散達(dá)到了平衡態(tài)，這樣自上而下氯化銫密度不斷升高的濃度梯度就建立起來了。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 氯化銫溶液中的大分子在離心過程中會(huì)在不同的梯度位置形成條帶圖3-12(a)。一個(gè)特定分子形成條帶的確切位置取決于它的浮力密度：DNA的浮力密度約為1.7g/cm3 ，因此

37、在離心過程中，DNA分子會(huì)遷移到氯化銫密度為1.7g/cm3的梯度位置。相反，蛋白質(zhì)分子的浮力密度要低得多，因此離心后會(huì)浮在離心管中靠上的位置.RNA因?yàn)楦×γ芏茸畲蟪猎陔x心管的最底部圖3-12(b)。因此密度梯度離心能夠分離DNA，RNA、蛋白質(zhì)，并且能夠代替苯酚提取和核糖核酸酶處理來對(duì)DNA進(jìn)行純化。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； A

38、ll Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 更重要的是，密度梯度離心在溴乙錠(EtBr)存在下能夠用來從非超螺旋分子中分離超螺旋DNA。溴乙錠通過插入兩個(gè)相鄰的堿基對(duì)而結(jié)合在DNA分子上，導(dǎo)致雙螺旋的部分松解圖3-13。這種松解又會(huì)導(dǎo)致浮力密度的降低，對(duì)于線形DNA分子來說大約會(huì)降低0.125g/cm3 。而超螺旋DNA不存在游離端，幾乎不可能發(fā)生松解，因此只能夠結(jié)合有限量的EtBr。所以超螺旋分子的浮力密度降低會(huì)小一些，大約會(huì)降低0.085g/cm3。

39、Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 所以， 超螺旋分子在溴乙錠-氯化銫密度梯度中形成的條帶，與線形和開鏈DNA所形成的不在同一位置圖3-14(a)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lectu

40、re of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 溴乙錠-氯化銫密度梯度離心處理澄清溶菌液時(shí)： 質(zhì)粒DNA會(huì)在不同于線形細(xì)菌DNA的位置形成條帶； 蛋白質(zhì)帶懸浮在離心管的頂部； RNA

41、沉降在離心管的底部。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 因?yàn)镋tBr上連接有熒光示蹤劑，DNA條帶的位置能夠通過將紫外光照射在離心管上而被看見。純凈質(zhì)粒DNA可以通過穿透離心管的一側(cè)并利用注射器吸出樣品的方法被分離出來。附著在質(zhì)粒DNA上的EtBr可以用正丁醇萃取出來，而氯化銫則可以用透析的方法除去。最終得到的質(zhì)粒制備物純度實(shí)際上達(dá)到了100，從而可以用作克隆載體。 Lecture of Bi

42、otechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增質(zhì)粒DNA的制備會(huì)受到一個(gè)無法回避的事實(shí)的影響，那就是質(zhì)粒僅僅占細(xì)菌細(xì)胞全部DNA的很小一部分。因此從細(xì)菌培養(yǎng)物中獲得的質(zhì)粒DNA令人失望地少。質(zhì)粒擴(kuò)增能夠提供一種增加DNA產(chǎn)量的方法。擴(kuò)增的目的就是增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)量。某些多拷貝質(zhì)粒 (那些拷貝數(shù)超過20個(gè)的質(zhì)粒)具有能夠在不進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的情況下進(jìn)行復(fù)制的能力。這和細(xì)菌的主要染色體復(fù)制形成了鮮明的對(duì)照，因?yàn)榧?xì)菌染

43、色體在不同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成情況下是無法進(jìn)行復(fù)制的。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 培養(yǎng)含目的質(zhì)粒DNA的細(xì)菌的過程中，可以利用這一特點(diǎn)。在細(xì)胞的密度達(dá)到了令人滿意的程度后，一種蛋白質(zhì)合成抑制物(例如氯霉素)被加入培養(yǎng)物中，并繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)超過12h。這一期間，質(zhì)粒分子持續(xù)復(fù)制，而與此同時(shí)染色體的復(fù)制和細(xì)胞分裂卻被阻斷。得到的質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加到了上千個(gè)。由此可見，擴(kuò)增是一種增加多拷貝質(zhì)粒產(chǎn)量的

44、非常有效的方法。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.3 噬菌體DNA的制備噬菌體DNA的純化，與前面的關(guān)鍵區(qū)別在于： 對(duì)噬菌體DNA來說，初始材料不是細(xì)胞

45、提取物。因?yàn)槭删w顆粒能夠從被侵染細(xì)菌的細(xì)胞外培養(yǎng)基中大量獲得。當(dāng)這樣的培養(yǎng)物被離心時(shí)，細(xì)菌聚集成小球沉淀在離心管的底部，把噬菌體顆粒留在了懸液中(圖3-16)。噬菌體顆粒接著被從懸液中收集起來。噬菌體DNA需要經(jīng)過一個(gè)去除蛋白的步驟以除去蛋白衣殼后才能夠得到。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S.

46、Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 成功純化大量的噬菌體DNA卻要受到一些缺陷的影響。對(duì)于噬菌體來說，雖然細(xì)胞外的噬菌體濃度(每毫升培養(yǎng)物含有噬菌體顆粒的數(shù)量)已經(jīng)足夠高（噬菌體合理的噬菌體濃度為11010個(gè)/ml），但只能產(chǎn)生500ng的DNA。因此如果要獲得足夠量DNA，需要500-1 000 mL的大體積培養(yǎng)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and envir

47、onment engineering, University 2.3.1 培育培養(yǎng)物以獲得高的密度大體積培養(yǎng)物的生長不存在任何問題(50L和50L以上體積的細(xì)菌培養(yǎng)在生化技術(shù)上是很常見的)，但是獲得最大噬菌體濃度需要一定的技巧。天然的噬菌體是溶源性的，被侵染培養(yǎng)物主要是由含有已經(jīng)整合到細(xì)菌染色體的前噬菌體的細(xì)胞所組成(圖2-7)。在這種環(huán)境下，細(xì)胞外的噬菌體濃度非常低。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, Unive

48、rsity Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 為了得到高產(chǎn)量的細(xì)胞外噬菌體，培養(yǎng)物必須被誘導(dǎo)，以使所有細(xì)菌進(jìn)入侵染循環(huán)中的溶解階段，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并將噬菌體顆粒釋放到培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)過程通常是很難控制的，但是絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)用噬菌體的cI基因含有溫度敏感突變.。cI是將噬菌體DNA保持在整合狀態(tài)所需要依賴的基因。如果該基因突變失活，則cI基因就不能夠再正常發(fā)揮作用并引起細(xì)胞溶解的發(fā)生。 Lecture

49、 of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 在cI溫度敏感突變中，cI基因在30時(shí)發(fā)揮作用，正常的溶源性能夠發(fā)生。在42時(shí)，cI溫度敏感突變基因就不能夠再正常工作，溶源性也就不能夠繼續(xù)保持。因此，被攜帶cI溫度敏感突變的噬菌體侵染的大腸桿菌培養(yǎng)物，在從培養(yǎng)溫度30提高到42時(shí)，就能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞外噬菌體。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIU

50、Department of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.3.2 非溶源性噬菌體的制備絕大多數(shù)的噬菌體都是溶源性噬菌體，但很多源自噬菌體的克隆載體都經(jīng)過了改造，切除了cI以及其他一些基因，以消除細(xì)菌的溶源性。因此這些噬菌體就不能夠整合到細(xì)菌基因組中，并且只能夠通過細(xì)菌溶解循環(huán)來侵染細(xì)胞。

51、 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 對(duì)于溶解性噬菌體來說，獲得高濃度的關(guān)鍵在于培養(yǎng)物的生長方式，尤其是在細(xì)胞被外源噬菌體顆粒侵染的階段。如果噬菌體在細(xì)胞分裂達(dá)到其最大分裂速度之前加入，所有細(xì)胞都會(huì)立刻溶解，這樣得到的噬菌體濃度非常低。另一方面，如果細(xì)胞密度太高的情況下加入噬菌體，培養(yǎng)物不能夠徹底溶解，所得的噬菌體濃度也比較低。 Lecture of Biotechnology； All Rig

52、ht Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 理想的情況是，在培養(yǎng)物的生長時(shí)間，和噬菌體接種體的大小處于一種平衡狀態(tài)。即，培養(yǎng)物仍在繼續(xù)生長，但最終所有的細(xì)胞都被侵染和溶解。但，判斷這種完美的生長狀態(tài)需要一定的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lectur

53、e of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 2.3.3 從被侵染培養(yǎng)物中收集噬菌體通過離心可以將已溶解細(xì)菌細(xì)胞的殘留物，和一些不經(jīng)意留下的未被侵染的細(xì)胞分離出來，而把噬菌體顆粒留在上清中。但需要將懸液的體積減少到5mL或更少，以便更有利于進(jìn)行DNA抽提。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 噬菌體顆粒非常小，以至于必須用很高的離心轉(zhuǎn)速才能夠聚集，因此噬菌體的收集通常要在聚乙二醇(PEG)存在情況下沉淀得到。聚乙二醇是一種長鏈多聚化合物，在鹽存在下，能夠吸收水分，使像噬菌體顆粒這樣的大分子聚集沉淀。這些沉淀能夠通過離心被收集并在一個(gè)適當(dāng)?shù)男◇w積中重新溶解(圖3-19)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and env