血管組織工程PPT課件

1、 目錄 1 緒論 2 支架材料 3 種子細胞 4 生長因子的引入 5 生物反應(yīng)器 6 展望第1頁/共47頁 1、緒論u 組織工程學(xué)（tissue engineering）是一門工程學(xué)與生命科學(xué)相結(jié)合的邊緣科學(xué)，是在體外構(gòu)建具有生物活性的生物替代物，用于替代、修復(fù)或改善人體各種組織器官形態(tài)和功能。u 基本原理： 種子細胞 生物反應(yīng)器 細胞-生物材料復(fù)合物 植入人體 支架材料 第2頁/共47頁 u 組織工程化血管是利用組織工程學(xué)方法，用血管種子細胞(內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞)與相關(guān)細胞外基質(zhì)(支架材料)復(fù)合，以構(gòu)建從形態(tài)到功能都接近活體血管的組織工程化血管。 第3頁/共47頁 組織工程血管應(yīng)具備以下條

2、件：u 具有或模擬體內(nèi)血管壁三層結(jié)構(gòu)u 具有生物相容性，不易產(chǎn)生血栓，不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)u 具有生物學(xué)特性，如對藥物刺激有收縮性u 具有血管的力學(xué)特性，即有粘彈性并能承受一定的壓力第4頁/共47頁u 1986年，Weinberg CBWeinberg CB等最早應(yīng)用自體來源的平滑肌細胞、成纖維細胞、等最早應(yīng)用自體來源的平滑肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞構(gòu)建了復(fù)合的組織工程化血管，但血管強度無法滿足回植要求內(nèi)皮細胞構(gòu)建了復(fù)合的組織工程化血管，但血管強度無法滿足回植要求uL heureux等人在 vitamin C存在條件下, 通過培養(yǎng)間充質(zhì)細胞(平滑肌細胞和成纖維細胞)提高了移植物的機械強度,

3、構(gòu)建了一個具有類似生理血管的脫細胞基質(zhì)(脫細胞基質(zhì)是成人皮膚的脫水產(chǎn)物)。第5頁/共47頁uNikalson等在血流條件下在聚合物管道上構(gòu)建血管uNiklason 等注意到在類似活體內(nèi)或者能夠經(jīng)歷自然形成階段等外環(huán)境條件下能夠更好的形成血管移植物第6頁/共47頁 Hemothes膨體聚四氟乙烯人工血管 第7頁/共47頁第8頁/共47頁 2、支架材料 天然材料 支架材料 人工合成材料 復(fù)合材料第9頁/共47頁 2.1 天然材料u 天然生物降解材料是指來源于動植物或人體內(nèi)天然存在的可生物降解的大分子。u 應(yīng)用于組織工程血管研究的天然生物材料包括甲殼素、葡聚糖明膠、膠原蛋白、彈性蛋白、多聚氨基酸、多

4、肽、透明質(zhì)酸及其復(fù)合物、某些組織的脫細胞基質(zhì)等。第10頁/共47頁 優(yōu)點 u本身包含許多生物信息，能夠提供細胞所需的信號u與細胞親和性強，能為細胞提供近似體內(nèi)的發(fā)生發(fā)育的細胞外基質(zhì)支架條件，能使細胞聚集成組織，控制組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細胞表型u極低的免疫排斥反應(yīng)，良好的順應(yīng)性 第11頁/共47頁u現(xiàn)在應(yīng)用較多的脫細胞血管基質(zhì)材料均富含膠原，保持著膠原纖維、彈性蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白的構(gòu)象和原有的排列分布，力學(xué)性能及強度與脫細胞前相似。u膠原支架用碳膠原支架用碳- -二酰亞氨交聯(lián)后，抗降解能力增強。種植成纖維細胞時細胞黏附、二酰亞氨交聯(lián)后，抗降解能力增強。種植成纖維細胞時細胞黏附、增殖能力強。增殖能力強。第1

5、2頁/共47頁 脫細胞基質(zhì)支架材料脫細胞基質(zhì)支架材料 u 動物體內(nèi)多種纖維組織（心包膜、筋膜等）動物體內(nèi)多種纖維組織（心包膜、筋膜等）u 內(nèi)臟平滑肌器官內(nèi)臟平滑肌器官 u 小腸黏膜下層小腸黏膜下層( (small intestinal small intestinal submucosa,SISsubmucosa,SIS) )第13頁/共47頁第14頁/共47頁 2.2 人工合成高分子生物材料 優(yōu)點 u可預(yù)先設(shè)計和調(diào)控，降解完全，可避免異物刺激所引起的不良反應(yīng)可預(yù)先設(shè)計和調(diào)控，降解完全，可避免異物刺激所引起的不良反應(yīng)u生產(chǎn)重復(fù)性好，可大批量生產(chǎn)生產(chǎn)重復(fù)性好，可大批量生產(chǎn) 第15頁/共47頁 缺

6、點u缺乏生物信號和功能基團，與種子細胞的黏附性較差缺乏生物信號和功能基團，與種子細胞的黏附性較差 u在材料降解過程中，會產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)，對局部會產(chǎn)生一定的影響在材料降解過程中，會產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)，對局部會產(chǎn)生一定的影響第16頁/共47頁 u血管組織工程應(yīng)用的人工合成可降解材料有聚羥基乙酸血管組織工程應(yīng)用的人工合成可降解材料有聚羥基乙酸(PGA),(PGA),聚乳酸聚乳酸(PLA),(PLA),聚聚L-L-乳酸乳酸(PLLA)(PLLA)及上述材料的共聚物及上述材料的共聚物(PLGA),(PLGA),聚羥基烷酸酯聚羥基烷酸酯(PHA)(PHA)、聚、聚-4-4-羥基丁羥基丁酸酸(P4HB) (

7、P4HB) 等。其中作為血管支架材料應(yīng)用最多的是等。其中作為血管支架材料應(yīng)用最多的是PGAPGA和和PLGAPLGA。第17頁/共47頁 uPGAPGA的吸收和代謝機制已經(jīng)明確并具有可靠的生物安全性，但的吸收和代謝機制已經(jīng)明確并具有可靠的生物安全性，但PGAPGA降解速度過降解速度過快快 u最典型的共聚物是羥基乙酸最典型的共聚物是羥基乙酸(GA)(GA)和乳酸和乳酸(LA)(LA)形成的無規(guī)則共聚物形成的無規(guī)則共聚物- -聚乳酸聚聚乳酸聚羥基乙酸羥基乙酸(PLGA)(PLGA)。PLGAPLGA共聚物的降解速度可根據(jù)需要通過調(diào)整兩種單體的比共聚物的降解速度可根據(jù)需要通過調(diào)整兩種單體的比例來加以

8、控制。例來加以控制。第18頁/共47頁PGA血管支架（膠原包埋）第19頁/共47頁u 聚乳酸聚乳酸(PLA)(PLA) 優(yōu)點：無毒害作用優(yōu)點：無毒害作用 缺點：缺乏良好細胞親和性能缺點：缺乏良好細胞親和性能u 聚聚 - -己內(nèi)酯己內(nèi)酯(PCL)(PCL) 具有良好的親水性具有良好的親水性第20頁/共47頁 2.3 復(fù)合材料u人工合成材料的優(yōu)點是它們的強度、降解速人工合成材料的優(yōu)點是它們的強度、降解速度、微結(jié)構(gòu)和滲透性均可在生產(chǎn)過程中進行控度、微結(jié)構(gòu)和滲透性均可在生產(chǎn)過程中進行控制制u天然材料的優(yōu)點則在于包含有生物信息天然材料的優(yōu)點則在于包含有生物信息( (如特如特殊的氨基酸序列殊的氨基酸序列)

9、 )，可促進細胞吸附或使細胞，可促進細胞吸附或使細胞保留分化功能保留分化功能u通過合成材料與天然可降解高分子材料復(fù)合，通過合成材料與天然可降解高分子材料復(fù)合，可以在保持支架材料的力學(xué)強度及降解行為不可以在保持支架材料的力學(xué)強度及降解行為不變的前提下，獲得具有生物活性的表面變的前提下，獲得具有生物活性的表面第21頁/共47頁 3 種子細胞 正常的血管壁有內(nèi)膜、中膜、外膜構(gòu)成。 內(nèi)皮細胞（單層） 內(nèi)膜 內(nèi)皮下層 平滑肌細胞（多層環(huán)形排列） 中膜 細胞外基質(zhì) 外層 疏松結(jié)締組織 第22頁/共47頁 u 內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞是血管的重要組成成分，因此是組織工程化血管種子細胞的主要研究內(nèi)容u目前用于構(gòu)建

10、組織工程血管的種子細胞主要分自體血管壁細胞和干細胞兩大類目前用于構(gòu)建組織工程血管的種子細胞主要分自體血管壁細胞和干細胞兩大類第23頁/共47頁3.1 自體血管壁細胞 3.1.1 靜脈內(nèi)皮細胞u從體內(nèi)非必須血管或者人臍靜脈內(nèi)皮，一般采用從體內(nèi)非必須血管或者人臍靜脈內(nèi)皮，一般采用酶消化法酶消化法u靜脈內(nèi)皮獲取的方法已經(jīng)成熟，但是在體外培養(yǎng)中容易老化，表型和功能容易靜脈內(nèi)皮獲取的方法已經(jīng)成熟，但是在體外培養(yǎng)中容易老化，表型和功能容易丟失，細胞增殖能力和活性等因人而異，而且，體外培養(yǎng)擴增的時間較長，難丟失，細胞增殖能力和活性等因人而異，而且，體外培養(yǎng)擴增的時間較長，難以達到血管構(gòu)建種子細胞的要求以達到

11、血管構(gòu)建種子細胞的要求第24頁/共47頁 3.1.2 血管平滑肌細胞 u 取材時損傷較大取材時損傷較大u 傷口容易感染傷口容易感染u 獲得的細胞在體外培養(yǎng)下容易喪失平滑肌獲得的細胞在體外培養(yǎng)下容易喪失平滑肌 細胞表型細胞表型u容易衰老容易衰老第25頁/共47頁3.2 干細胞（Stem cells）u 干細胞具有能自我復(fù)制、多向分化的潛能，且增殖能力強，具有穩(wěn)定傳代的功干細胞具有能自我復(fù)制、多向分化的潛能，且增殖能力強，具有穩(wěn)定傳代的功能。因此成為理想的組織工程種子細胞。能。因此成為理想的組織工程種子細胞。 胚胎干細胞胚胎干細胞u干細胞干細胞 內(nèi)皮祖細胞內(nèi)皮祖細胞 成體干細胞成體干細胞 骨髓間充

12、質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞第26頁/共47頁第27頁/共47頁3.2.1 胚胎干細胞（Embryo stem cells,ESCs）u 胚胎干細胞存在于哺乳動物發(fā)育的早期，是指由胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖細胞胚胎干細胞存在于哺乳動物發(fā)育的早期，是指由胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖細胞經(jīng)體外抑制培養(yǎng)而篩選出的細胞經(jīng)體外抑制培養(yǎng)而篩選出的細胞u具有具有“發(fā)育全能性發(fā)育全能性”，還具有持續(xù)增殖而不分化的能力，還具有持續(xù)增殖而不分化的能力 第28頁/共47頁3.2.2 成體干細胞u成體干細胞按照其來源和分化方向的不同可以分為造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干成體干細胞按照其來源和分化方向的不同可以分為造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干

13、細胞、內(nèi)皮祖細胞、神經(jīng)干細胞、表皮干細胞、脂肪干細胞等，適用于組織工細胞、內(nèi)皮祖細胞、神經(jīng)干細胞、表皮干細胞、脂肪干細胞等，適用于組織工程血管構(gòu)建的有程血管構(gòu)建的有內(nèi)皮祖細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)皮祖細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞 u自體移植的成體干細胞可以避免免疫排斥的問題，分離使用成體干細胞不存在自體移植的成體干細胞可以避免免疫排斥的問題，分離使用成體干細胞不存在倫理社會問題倫理社會問題第29頁/共47頁3.2.2.1 內(nèi)皮祖細胞內(nèi)皮祖細胞( (EPCsEPCs，endothelial progenitor cellsendothelial progenitor cells）uEPCs是一群是一群C

14、D34+的細胞，最早由的細胞，最早由Asahara等從人外周血中分離得到，在體等從人外周血中分離得到，在體外可以誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞，參與了新生血管的形成。外可以誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞，參與了新生血管的形成。EPCs具有和造血干細胞具有和造血干細胞一些共表達的標志，如一些共表達的標志，如:flk-1，Tie-2等，認為二者都源自成血管祖細胞。等，認為二者都源自成血管祖細胞。第30頁/共47頁u優(yōu)點：優(yōu)點：EPCs具有容易獲得和很強的增殖能力具有容易獲得和很強的增殖能力u缺點：缺點： 1.體外擴增培養(yǎng)時間較長體外擴增培養(yǎng)時間較長 2.關(guān)于關(guān)于EPCs本身的特殊標志，來源較少本身的特殊標志，來源較少“不

15、穩(wěn)定不穩(wěn)定”，有效的分離聚集，有效的分離聚集辦法等都還在摸索階段，而且在一些特定的病理條件下辦法等都還在摸索階段，而且在一些特定的病理條件下“其表型會發(fā)生改變其表型會發(fā)生改變”， 3.生物學(xué)活性下降生物學(xué)活性下降第31頁/共47頁光鏡下的細胞學(xué)形態(tài)A :剛分離的單個核細胞,細胞呈小圓( 40) ;B :培養(yǎng)4 d后的內(nèi)皮祖細胞細胞變大、 透亮度增強、 出現(xiàn)梭形細胞( 40) ;C:培養(yǎng)7 d后的內(nèi)皮祖細胞細胞數(shù)量增多,有較多的小桿形細胞和梭形細胞( 40) ;D :培養(yǎng) 7 d 后的細胞團呈集落樣生長( 10) -方葉青.外周血內(nèi)皮祖細胞分離和培養(yǎng)的試驗研究 第32頁/共47頁 3.2.2.2

16、 骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs,bone marrow mesenchymal stem cells）u間充質(zhì)細胞間充質(zhì)細胞(MSC)(MSC)最初是由最初是由Friedenstein發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的一類易貼附于塑料培養(yǎng)板表面的細胞。在機體的一類易貼附于塑料培養(yǎng)板表面的細胞。在機體內(nèi)內(nèi)MSCMSC存在于許多組織中，尤以骨髓中最多，簡存在于許多組織中，尤以骨髓中最多，簡單的骨髓穿刺即可獲得，不存在組織配型及免疫單的骨髓穿刺即可獲得，不存在組織配型及免疫排斥問題，理論上能分化為所有的間充質(zhì)組織類排斥問題，理論上能分化為所有的間充質(zhì)組織類型，如型，如: :軟骨、脂肪、肌肉及肌健等。軟骨、脂肪、肌肉及肌健等

17、。 第33頁/共47頁u 有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能夠分化為血管平滑肌細胞。有文有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能夠分化為血管平滑肌細胞。有文獻報道，在血管損傷修復(fù)的過程中，骨髓間充質(zhì)干細胞參與了血管平滑肌獻報道，在血管損傷修復(fù)的過程中，骨髓間充質(zhì)干細胞參與了血管平滑肌層的重建過程。這些為層的重建過程。這些為BMSCsBMSCs誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細胞提供了依據(jù)，為組誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細胞提供了依據(jù)，為組織工程血管平滑肌種子細胞提供了選擇的可能?？椆こ萄芷交》N子細胞提供了選擇的可能。第34頁/共47頁4 生長因子的引入u 動物體中存在著大量對于細胞生長、分化、代謝、凋亡進行調(diào)

18、控的生長因子動物體中存在著大量對于細胞生長、分化、代謝、凋亡進行調(diào)控的生長因子( (growth factor) )，這些因子對于組織器官正常功能的維持起著至關(guān)重要的作，這些因子對于組織器官正常功能的維持起著至關(guān)重要的作用用u常用的生長因子有成纖維細胞生長因子常用的生長因子有成纖維細胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)、胰島素、胰島素樣生長因子樣生長因子(IGF)、血小板衍化生長因子、血小板衍化生長因子(PDGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。等。第35頁/共47頁第36頁/共47頁 在人工合成的高分子和大部分天然高分子材料中，缺乏這些生長因子或者在人工

19、合成的高分子和大部分天然高分子材料中，缺乏這些生長因子或者這些生長因子大部分在材料制備過程中遭到了破壞。因此，將生長因子負載到這些生長因子大部分在材料制備過程中遭到了破壞。因此，將生長因子負載到組織工程支架上，也是越來越被關(guān)注的問題。組織工程支架上，也是越來越被關(guān)注的問題。第37頁/共47頁 u在材料中引人生長因子、黏附因子等，可以對細胞生長、分化、增殖起到促進在材料中引人生長因子、黏附因子等，可以對細胞生長、分化、增殖起到促進作用作用 u在此基礎(chǔ)上，可以將表達生長因子的基因片斷負載到支架上進行基因治療在此基礎(chǔ)上，可以將表達生長因子的基因片斷負載到支架上進行基因治療 第38頁/共47頁5 生物反應(yīng)器u 生物反應(yīng)器是指對微生物/動物細胞培養(yǎng)環(huán)境和運行參數(shù)（如：PH值、溫度、壓力、營養(yǎng)的供給和廢物的移出）進行監(jiān)測和調(diào)控的一種裝置。 第39頁/共47頁 類型u攪拌式生物反應(yīng)器 u旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器u中空纖維生物反應(yīng)器 u灌流式生物反應(yīng)器第40頁/共47頁 血管生物