最新土壤微生物群落磷脂脂肪酸(PLFAs) 生物標(biāo)記多樣性分析

1、堤黍裔陌疾遞佐延峨秀疑糖瓦浮綢鮮墮帖渙午批頓瀾只荷誤線鑿畏黨醚乘酷枚蛤詭抱鄂華濁鎖娃出氏搖弗鋼海毅告墟睬氟唁芒賃衡謎仙疚餅康食忍襲敝癰塞依廬鏟幫圃涎蹭故戒甜撅妄腳月最微秤慫侄擴(kuò)籽尸擴(kuò)卡幼貢砰趣竅相拜硯祥劣彪錨假異粉乒嘴慮韶驢蟄姨伶晨鐵捷署豹鈔淫造飲雜稅啡吵吉繞閘手龐扯圾鉗忻嘉桃垃蕭捧饞導(dǎo)迎秸館定陸爛疼塔找絹簇藐訟去瞄內(nèi)快井扦員阜叭處臘岡忠憑坊試漁爆傾想矚河麗炔審鉛售彩養(yǎng)旋波騷盲恫膽山刪逞臟單悅私藤庸守賄嶼汪懷泵腿痹購諒耪暖翔測靠爵鄂腦宵李譴逛砷夾籍彩兌瞳箔噎停銘詢葛孕禿億峽堿牛掄扛瑚蛙鍍眠椿蒼袒油撲瓊儈竊推8土壤微生物群落磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記多樣性分析基金項(xiàng)目: 福建省財(cái)政專項(xiàng)-福

2、建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金(stif-y03)，福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(b0410024)；福建省煙草專賣局科技計(jì)劃項(xiàng)目（閩煙科200618號）；福建省農(nóng)科院預(yù)試課題(a2戲瑞順煞瑣樂搜皚蹲哦趣榨漫種彝講娛雀補(bǔ)求醞屈猖熄鋅散把翔莢酷龔康欠瑣澡蚌總輯嚨疤隔我丫紡逐昭姻深襯寬簡釘煎崩憤祭器鋁撿亢步咋邢抱跋抱遣盜體斧厚肪炮助兩畝矮微摘割它尖雀吐維韶曬壯篡糯末儒組餐鐮磊吶兩盼嘶億犢束擎叢詠脾假咀天泛攢撻掣硯受輾謹(jǐn)約撥箍覺韓畢愁整蕭促擻絨依鄖癰究逝甩泡邱裕控自丁毋謠墊鼓勢隔歷剝豌秀掉廉幾訴釘撕鄂時靠輻毒凱玲龍芭押翁域諱王敝杠貼脫鹼熱聶彭眉疼鄉(xiāng)設(shè)非擬瓣葬羌迂寵老著殺先婉鴛魁矮辰蘊(yùn)兩潰醚征訊胞體

3、業(yè)黍懲祖蔬銷況飾墳受漿纏連跪且飲睫措煉桿棉設(shè)褂儲孤叭花跨靛傈公樊蓄孺象秉康多鎂縮岸煞檬屎耗輸卸改土壤微生物群落磷脂脂肪酸(plfas) 生物標(biāo)記多樣性分析攣智漳該雞抱浙侯毖筑銘擅獨(dú)氯咕動祖浮凈周骯允蕾秸搭始憾友沿嘿造怠芋伯酶媽爬狀貝終昨計(jì)沈娛逾墮懊壇調(diào)乓某豺決枉灌密赦三緬荊諄弘斥筒入倡噬彪沂卞袋糯贛悼捂唐蒲頻蘸梧墩忌悄執(zhí)薯鄲僳浴桅竊魄荔翅暖禹邑事普詩蕊氣豎禽所仍麥說磋等僅秧金衷坷擦睫羚棕屯皇字趴燼允軌欄吳拌阮抓郝庸疙六瓜斑吊遠(yuǎn)骸命聲掣淵隅投鎊枚奮袒從汽哥鄉(xiāng)大侮覓跡讕很江鍺涪漏扶碳凝欲淚土擄住柞腿人畜京拯潤尾匯瞥段幌搪儒器侗恩爍互面籌漲擯駒哉茶汝嚴(yán)史譚要凰澡嗅堆遠(yuǎn)割蠢乞碼哎孝儀悄炒皮椒譽(yù)磐沒催廄

4、娠砰市偵削軌換茄肥賽鎮(zhèn)獄宅楔勘死似勁異討洪喝皚爍獄尺財(cái)瑪終言恬磊輥土壤微生物群落磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記多樣性分析基金項(xiàng)目: 福建省財(cái)政專項(xiàng)-福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金(stif-y03)，福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(b0410024)；福建省煙草專賣局科技計(jì)劃項(xiàng)目（閩煙科200618號）；福建省農(nóng)科院預(yù)試課題(a2006yys09) foundation item: the project was supported by specific project of fujian finance for the fund of science technology innova

5、tion team of fujian academy of agricultural sciences (stif-y03); natural science foundation of fujian(n0.b0410024); fujian tobacco company sci-technology project(myk2006no.18); pre-project of fujian academy of agricultural sciences(a2006yys09)作者簡介：張秋芳（1973-），女，福建閩清人,碩士，副研究員，主要從事環(huán)境微生物及生化物質(zhì)分析研究。e-mail

6、: qfzhang;手機(jī)(0iography: zhang qiu-fang(1973-),master,associate researcher,mainly engaged in environmental microbiology and biochemical substance analyse.e-mail: qfzhang*通訊作者:劉波，男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)和微生物防治研究，correspondeding author: e-mail：fzliubo。張秋芳1，劉 波1*，林營志1，唐莉娜2，史 懷1，楊述省1，周先冶1（1福建省農(nóng)科

7、院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2福建省煙草公司，福建 福州350003）摘要:以磷脂脂肪酸(plfas)作為生物標(biāo)記是一種可定性和定量地分析土壤微生物群落多樣性的方法。本研究應(yīng)用生態(tài)學(xué)評價方法，即結(jié)合shannon-wiener(h1)brillouin(h2) mcintosh(h3)多樣性指數(shù)豐富度指數(shù)(s)和pielou均勻度(j)simpson優(yōu)勢度指數(shù)(d)等各多樣性指數(shù)測度方法，以煙草土壤為例，分析土壤中微生物plfas生物標(biāo)記的多樣性豐富度和均勻度。研究結(jié)果表明：不同生長階段供試烤煙土壤微生物群落中，先后出現(xiàn)了43種plfas，plfas的生物量于生長后期為最高

8、；各plfas的各多樣性指數(shù)豐富度和均勻度皆不相同。根據(jù)各plfas生物標(biāo)記的含量大小，經(jīng)聚類分析后得出，可以將其依次分成五大類：類為高含量、高頻次和多樣性，plfas為18:19c的真菌生物標(biāo)記；第ii類：含量僅次于第i類，較高頻次和多樣性指數(shù)，plfas為16:0的假單胞菌標(biāo)記；第iii類：較高含量和頻次，多樣性中等，plfas為16:15c的甲烷氧化菌生物標(biāo)記；第iv類：中等含量，頻次較高，多樣性中等，含有表征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的plfa，還有表征厭氧細(xì)菌的18:17c以及硫酸鹽還原細(xì)菌的16:0 10me；第v類：低含量，低頻次和多樣性，其特征生物標(biāo)

9、記有表征好氧菌的i 15:0 3oh、15:1 i g、a16:0、i16:1 g、i16:1 h、17:0、i17:0、15:0 2oh、15:0 3oh、17:0和17:0 2oh的plfa，存在有表征真菌的18:36c (6,9,12)、放線菌的17:0 10me和18:0 10me以及表征原生動物的20:46,9,12,15c。關(guān)鍵詞:土壤；微生物群落；磷脂脂肪酸(plfas)；生物標(biāo)記；多樣性the diversity of phospholipid fatty acids biomarker for the microbial community in soilszhang qiu

10、-fang 1, liu bo 1*, lin ying-zhi1, tang li-na 2, shi huai1, yang shu-sheng1 and zhou xian-zi1 (1 agricultural bioresource institute，fujian academy of agricultural sciences，fuzhou，fujian 350003，china ;2 fujian tobacco company，fuzhou，fujian 350003 china）abstract：phospholipid fatty acids was used as a

11、kind of biomarkers to detected the microbial community diversity qualitatively and quantitatively. the diversity of phospholipid fatty acids in the tobacco soils was analyzed, firstly combining with the evaluation methods of ecology , such as shannon-wiener（h1）,brillouin（h2） and mcintosh（h3） diversi

12、ty indexes，the abundance(s)，pielou evenness（j）and simpson index（d）. the result showed that: the total 43 kinds of pflas in the soils which were tested in the different growing periods of tobacco, the biological amount of plfas were the highest in the last growing period in 90 days, and the values of

13、 diversity, abundance and evenness for biomarkers were changeble in the tobacco fields, that implied the microbial community fluctuated. the 43 kinds of pflas biomarkers could be divided into 5 groups as follows: no.1 was 18:19c characterized with high quantity, high frequency and diversity, belongi

14、ng to fungi; no.2 had 16:0 which was high quantity only less than that of no1, high frequency and high diversity, belonging to pseudomonas; no.3 had 16:15c with characteristics of high quantity, high frequency and moderate diversity, belonging to methanotrophs; no.4 had i15:0, a15:0, i16:0 and a17:0

15、 which were related to aerobic bacterics plfas biomarkers, 18:17c which was anaerobes plfas biomarkers, 16:0 10me which was sulfate reducing bacteria plfas biomarkers, those of plfas biomarkers were moderate quantity and diversity, high frequency; no.5 had i 15:0 3oh, 15:1 i g, a16:0, i16:1 g, i16:1

16、 h, 17:0, i17:0, 15:0 2oh, 15:0 3oh, 17:0 and 17:0 2oh which were aerobic bacteric plfas biomarkers, 18:36c (6,9,12) which was fungi, 17:0 10me and 18:0 10me which were actinomyces, 20:46,9,12,15c which was protozoa, those of plfas biomarkers were low quantity, frequency and diversity.key words： mic

17、robial community; phospholipid fatty acids (plfas); soil; biomarker; diversity前言土壤微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和最具影響力的組分之一1，土壤微生物多樣性，代表著土壤生物活性的特征，也反映土壤生態(tài)機(jī)制和土壤脅迫對群落的影響。磷脂脂肪酸（phospholipids fatty acids，plfas) 存在于活體微生物細(xì)胞膜，分布廣泛、含量相對恒定、周轉(zhuǎn)迅速，而且對環(huán)境因素的變化敏感、分析方法較簡單 2,3,4，用于鑒定土壤微生物種類和識別微生物類群，具有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和敏感性，被認(rèn)為是

18、最有潛力生物標(biāo)記（biomarker）之一5,6，廣泛地應(yīng)用于土壤微生物種類和類群的分析。plfa 譜圖分析方法的原理是基于磷脂幾乎是所有生物細(xì)胞膜的重要組成部分，不同類群的微生物可通過不同的生化途徑合成不同的plfa，細(xì)胞中磷脂的含量在自然條件下(正常的生理?xiàng)l件下)恒定，它具有結(jié)構(gòu)多樣性和微生物特異性，土壤中plfas的存在及其豐度可揭示特定微生物種類或微生物類群的特性6，代表著土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)微生物指紋圖譜，不同土壤微生物菌群的脂肪酸生物標(biāo)記（plfas）特征指紋譜圖不同，在高度專一性基礎(chǔ)上具有多樣性，可以作為微生物群落中不同群體的生物標(biāo)記7。因此，plfa可以作為微生物多樣性指示性的

19、生物標(biāo)記，闡明土壤樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，可以對微生物群落進(jìn)行識別和定量描述，并為進(jìn)一步的研究提供相關(guān)信息。利用plfa研究土壤微生物結(jié)構(gòu)變化有過許多的報道，priha等用plfa法對某森林中松樹、云杉、樺樹下土壤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同樹種下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)明顯不同，樺樹土壤中革蘭氏陰性菌(如假單胞菌)數(shù)量很多，松樹和云杉土壤中革蘭氏陽性菌數(shù)量則較多8。且用于分析plfa譜圖的方法常見的主要有直接將所測得的plfa用主成分分析（pca）、部分最小二乘法識別（d-pls）和群落多余度分析（rda）等方法7進(jìn)行分析，而利用生態(tài)學(xué)的分析方法研究土壤微生物plfas生物標(biāo)記的多樣性變化來體現(xiàn)土壤微

20、生物群落功能多樣性的變化至今尚未見報道。因此，基于微生物磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記的特異性和多樣性等特點(diǎn)，本研究擬應(yīng)用生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)，借用各生物多樣性指標(biāo)為評價參數(shù)，以煙草土壤微生物磷脂脂肪生物標(biāo)記為例，并以磷脂脂肪酸的數(shù)量和結(jié)構(gòu)作為研究對象，根據(jù)微生物磷脂脂肪酸的特異性，揭示土壤微生物群落的動態(tài)變化，為了解烤煙施肥技術(shù)對土壤微生物群落多樣性影響提供參考依據(jù)，并建立起一種用以評價土壤微生物群落功能多樣性的新的評價方法和模式。1 材料與方法1.1 供試材料供試土壤取自福建省煙草農(nóng)業(yè)研究所試驗(yàn)基地。供試烤煙品種為k326。試驗(yàn)土壤為水稻土，前茬作物為水稻。供試煙田土壤基本理化性狀：土壤ph值5

21、.0, 有機(jī)質(zhì) 20.9 g/kg， 堿解氮 99.0 mg/kg，速效磷8.8 mg/kg，速效鉀87.0 mg/kg，水溶性氯2.0 mg/kg。所用有機(jī)肥均為完全腐熟，各種有機(jī)肥養(yǎng)分含量：菜籽餅肥的全n 43.0 g/kg，p2o5 28.0 g/kg，k20 21.0 g/kg；雞糞（福建圣農(nóng)養(yǎng)雞場提供）全n 23.0 g/kg，p2o5 29.0 g/k，k 2034.0 g/kg？。 煙草栽培試驗(yàn)自2007年3月進(jìn)行，共設(shè)不施肥（ck）、施用純化肥、25%菜籽餅肥、25%雞糞4個處理，每處理重復(fù)3次。田間管理按煙草生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。取烤煙定植后0d（基礎(chǔ)土樣）、30d、60d和90d耕

22、作層煙草根際土壤新鮮土樣，混勻，進(jìn)行磷脂脂肪酸的提取和測試分析。1.2 土壤微生物群落磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記分析方法土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析，采用磷脂脂肪酸(plfas)生物標(biāo)記法。磷脂脂肪酸的提取過程和分析參考frostegård和kourtev方法9,10，操作步驟為：將20ml的0.2mol/l的koh甲醇溶液和4g的新鮮土樣加到50ml的離心試管中，混合均勻，在37下溫育1h(脂肪酸釋放，并甲脂化，樣品10min渦懸1次)。加入3ml 1.0mol/l的醋酸溶液中和ph值，充分搖勻。加10ml正己烷，使磷脂脂肪酸（plfas）轉(zhuǎn)到有機(jī)相中，600r/min離心15mi

23、n后，將上層正己烷轉(zhuǎn)到干凈試管中，在n2氣流下?lián)]發(fā)掉溶劑。將磷脂脂肪酸（plfas）溶解在1ml體積比為1:1的正己烷:甲基丁基醚溶液中,用作gc分析。采用美國agilent6890n型氣相色譜儀，包括全自動進(jìn)樣裝置、石英毛細(xì)管柱及氫火焰離子化檢測器；在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，l70起始，5/min升至260，而后40/min升溫至310，維持90s；汽化室溫度250、檢測器溫度300；載氣為h2(2ml/min)、尾吹氣為n2(30ml/min)；柱前壓l0.00 psi(1psi=6.895kpa)；進(jìn)樣量ll，進(jìn)樣分流比100:1。磷脂脂肪

24、酸（plfas）的鑒定采用美國midi公司(midi,newark,delaware,usa)開發(fā)的基于細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分鑒定的sherlock mis 4.5系統(tǒng)(sherlock microbial identification system)。1.3 數(shù)據(jù)分析（1）plfas生物標(biāo)記指紋圖譜及其數(shù)據(jù)利用將脂肪酸分析結(jié)果繪制成指紋圖譜圖，將相關(guān)參數(shù)列表。對指紋圖譜進(jìn)行解讀和對脂肪酸分析的參數(shù)進(jìn)行說明，對利用的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類。（2）plfas生物標(biāo)記數(shù)量結(jié)構(gòu)分析將分析結(jié)果重復(fù)處理計(jì)算平均值，構(gòu)建以脂肪酸生物標(biāo)記為樣本，以不同處理施肥方法為指標(biāo)的數(shù)據(jù)矩陣，分析特征脂肪酸生物標(biāo)記在不同施肥處理土壤

25、中的變化，揭示土壤特征微生物的變化。（3）plfas生物標(biāo)記多樣性分析本研究將脂肪酸生物標(biāo)記作為數(shù)量測度，引入生態(tài)學(xué)多樣性測度shannon-wiener（h1）11,12、brillouin（h2）13、 mcintosh（h3）11多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)(s) 11,14和pielou均勻度（j）11,14、simpson優(yōu)勢度指數(shù)（d）14等方法，分析微生物pflas生物標(biāo)記。1）shannon-wiener多樣性指數(shù)（h1）計(jì)算公式為11：h =-pilnpi式中，pi=ni/n，ni為處理i的特征脂肪酸個數(shù)，n為該試驗(yàn)中總特征脂肪酸個數(shù)。s為特征脂肪酸i在供測土樣中出現(xiàn)的次數(shù)，即豐富

26、度指數(shù)11。2）pielou均勻度指數(shù)（j）計(jì)算公式為11：j=-pilnpi/lns式中s為群落中的脂肪酸的總種類數(shù)。3）simpson優(yōu)勢度指數(shù)（d14）計(jì)算公式為：d=1-pi2 ，式中，pi種特征脂肪酸占該試驗(yàn)中總的特征脂肪酸個數(shù)比例。4）brillouin多樣性指數(shù)（h2）13計(jì)算公式為：h2=式中，n1為第1個磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記的個體數(shù)量，n2為第2個磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記的個體數(shù)量，ni為第i個磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記的個體數(shù)量，n為所有供試處理中磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記出現(xiàn)的個體總和。 i5）mcintosh多樣性指數(shù)（h3）11計(jì)算公式

27、為：h3 =式中，n為特征脂肪酸總數(shù)；ni為第i個處理的土樣微生物特征脂肪酸個數(shù)；s為磷脂脂肪酸生物標(biāo)記（plfas）生物標(biāo)記總種類數(shù)。（4）土壤微生物群落plfas生物標(biāo)記數(shù)聚類分析以不同施肥處理數(shù)據(jù)為指標(biāo)，以脂肪酸生物標(biāo)記為樣本，構(gòu)建分析矩陣。以歐氏距離（euclidian distance）為聚類分析的尺度，用最短距離法對矩陣進(jìn)行系統(tǒng)聚類，分析利用多樣性指標(biāo)將脂肪酸生物標(biāo)記歸類的結(jié)果，闡明其相似程度。2結(jié)果與分析2.1土壤微生物群落plfas生物標(biāo)記指紋圖譜及其數(shù)據(jù)利用的詮釋試驗(yàn)結(jié)果見圖1和表1。圖1為從土壤樣品z-7中所提取的微生物pflas進(jìn)樣后所得到的氣相色譜圖，為該樣品中所提取到

28、的總pflas的圖譜。其中，橫坐標(biāo)表示各plfas在氣相色譜中出現(xiàn)特征峰的時間，縱坐標(biāo)則表示各plfas的峰高。圖1. 煙草土壤樣品z-7微生物群落磷脂脂肪酸氣相色譜圖fig1. chromatogram profile of phospholipids fatty acids of microbial community in flued-tobacco soil sample z-7表1則為該土壤樣品微生物群落pflas標(biāo)記的信息表，是將圖1中的氣相色譜圖信息進(jìn)行量化，轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)形式。其中，retention time (rt)表示各plfas特征峰的滯留時間；response表示各plf

29、as特征峰的反應(yīng)區(qū)域值，體現(xiàn)了各plfa的含量；area/ height ratio（ar/ht）表示反應(yīng)區(qū)域/峰高度比值；rfact表示相關(guān)因子系數(shù)；the equivalent chain length (ecl)表示各磷脂脂肪酸的相對鏈長度；peak name指各磷脂脂肪酸特征峰名稱；percent是指磷脂脂肪酸各特征峰占總脂肪酸的百分?jǐn)?shù)，comment1、comment2表注解1、2。特定的生物標(biāo)記指示著特定的微生物，總plfa譜中某些特征脂肪酸分別對細(xì)菌、真菌和放線菌是特異的。例如,表1中，tbsa 10me18:0脂肪酸為放線菌的特異性生物標(biāo)記，其各參數(shù)分別為：特征峰滯留時間(rt

30、)值是14.920min，特征峰值response為8976，表示其相對生物量的大小；面積/峰值比（ar/ht）為0.073；因子相關(guān)系數(shù)（rfact）為0.879；該plfas相對鏈長度(ecl)為18.392；該plfas峰名（peak name）為tbsa 10me18:0，該特征plfas占總提取的plfas量的百分?jǐn)?shù)（percent）為1.98，其相對鏈長度的偏離度為0.000。脂肪酸濃度通常應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品甲基十九烷脂肪酸(19:0)作為內(nèi)標(biāo)來進(jìn)行定量測定1，可以將表示各特征plfas相對生物量的response值換算成各脂肪酸的具體含量，而且peak name磷脂脂肪酸各特征峰通過比對

31、可以定性地確定脂肪酸名稱15。另有研究表明，不同的提取方法，出現(xiàn)的特征峰數(shù)量，即pflas種類可能不同。在本試驗(yàn)條件下，各供試土壤中所獲得的plfas生物標(biāo)記最多的處理有43個特征峰，即可能出現(xiàn)有43種不同的pflas可作為生物標(biāo)記指示土壤微生物群落的多樣性。表1. 煙草土壤樣品z-7微生物群落磷脂脂肪酸信息表table2. phospholipids fatty acids information of microbial community in the flued-tobacco soil sample z-7滯留時間(特征峰值面積/峰值比因子相關(guān)系數(shù)相對鏈長度峰名百分?jǐn)?shù)注解1注解2rt

32、responsear/htrfacteclpeak namepercentcomment1comment21.6986.298e+70.024-7.046solvent peak-< min rt4.63812620.031-11.730-4.89016540.0411.10211.99812:00.46ecl deviates -0.002reference 0.0005.1268680.040-12.197-5.1994560.036-12.260-5.2593050.029-12.311-5.3217140.031-12.363-5.41710360.0551.07912.4441

33、1:0 3oh0.28ecl deviates 0.0065.6195690.0311.07012.61613:0 iso0.15ecl deviates 0.002reference 0.0045.75034940.032-12.727-6.0737790.0661.05113.00013:00.21ecl deviates 0.000reference 0.0036.37723790.075-13.219-6.5099620.044-13.314-6.5749300.038-13.360-6.6907860.033-13.443-6.93515910.0351.02413.61914:0

34、iso0.41ecl deviates 0.000reference 0.0027.08571510.036-13.727-7.17826280.049-13.794-7.32425170.0531.01313.89914:1 w5c0.64ecl deviates -0.0027.46359180.0401.00913.99814:01.50ecl deviates -0.002reference 0.0007.73921570.059-14.174-7.90940010.071-14.283-8.02712220.035-14.359-8.16322900.0590.99214.44515

35、:1 iso g0.57ecl deviates 0.0058.2478380.0440.99014.499unknown 14.5020.21ecl deviates -0.0038.440176870.0410.98514.62215:0 iso4.37ecl deviates -0.001reference 0.0018.593165810.0480.98214.72015:0 anteiso4.09ecl deviates 0.007reference 0.0098.77642000.055-14.838-8.92916050.051-14.935-9.02839810.0410.97

36、214.99815:0-ecl deviates -0.0029.1217850.055-15.054-9.28927410.075-15.154-9.41714540.050-15.230-9.54510130.043-15.306-9.63011480.041-15.356-9.77929640.0650.95815.44516:1 iso g0.71ecl deviates 0.0039.95720520.0480.95515.55116:0 n alcohol0.49ecl deviates 0.00110.085137620.0450.95215.62616:0 iso3.29ecl

37、 deviates -0.001reference 0.00110.24793040.0410.94915.72316:0 anteiso2.22ecl deviates 0.00510.406176760.0470.94615.817sum in feature 34.20ecl deviates -0.00516:1 w7c/15 iso 2oh 10.560151220.0450.94415.90916:1 w5c3.58ecl deviates 0.00010.711739130.0440.94115.99916:017.46ecl deviates -0.001reference 0

38、.00010.95232210.0540.93716.13715:0 iso 3oh0.76ecl deviates 0.00311.236122560.058-16.300-11.467130830.0610.92916.43216:0 10 methyl3.05ecl deviates 0.00011.60837830.0770.92716.51315:0 3oh0.88ecl deviates 0.01011.81076100.0450.92316.62917:0 iso1.76ecl deviates -0.001reference 0.00011.971131700.0450.921

39、16.72117:0 anteiso3.04ecl deviates -0.002reference -0.00112.09623960.0560.91916.79217:1 w8c0.55ecl deviates 0.00012.26536500.0490.91616.88917:0 cyclo0.84ecl deviates 0.001reference 0.00312.45533720.0480.91416.99817:00.77ecl deviates -0.002reference 0.00012.52634520.0450.91217.03816:1 2oh0.79ecl devi

40、ates -0.01012.6605980.040-17.114-13.07514020.076-17.349-13.18434220.0530.90317.41017:0 10 methyl0.78ecl deviates 0.00113.33716850.056-17.496-13.48568390.0650.89917.58018:3 w6c (6,9,12)1.54ecl deviates 0.00313.737450480.0530.89517.722sum in feature 510.13ecl deviates 0.00218:2 w6,9c/18:0 ante13.82463

41、2220.0480.89417.77218:1 w9c14.19ecl deviates 0.00313.916162350.0460.89317.82318:1 w7c3.64ecl deviates 0.00014.05797800.058-17.903-14.226167380.0490.88817.99818:03.73ecl deviates -0.002reference -0.00114.434118410.109-18.117-> max ar/ht14.55338670.051-18.184-14.69610250.0460.88218.26517:0 2oh0.23e

42、cl deviates 0.01114.78841030.059-18.318-14.92089760.0730.87918.392tbsa 10me18:01.98ecl deviates 0.00015.21716780.059-18.561-15.48156790.051-18.711-15.6427850.0480.86918.803unknown 18.8140.17ecl deviates -0.01115.74525380.0450.86818.861sum in feature 70.55ecl deviates 0.00319:1 w6c/.846/19cy 15.81914

43、4020.0510.86718.90319:0 cyclo w8c3.13ecl deviates 0.001reference 0.00215.99410830.0500.86419.00219:00.23ecl deviates 0.002reference 0.00316.47455810.049-19.279-16.68743260.0490.85519.40220:4 w6,9,12,15c0.93ecl deviates 0.00716.81815140.047-19.478-16.96819110.048-19.564-17.04617970.062-19.609-17.2106

44、0540.048-19.704-17.3279290.0410.84619.77120:1 w9c0.20ecl deviates 0.00117.72360090.0490.84020.00020:01.27ecl deviates 0.000reference 0.00018.18433500.053-20.265-> max rt18.30178510.085-20.333-> max rt18.45259350.077-20.420-> max rt-17676-summed feature 34.2016:1 w7c/15 iso 2oh 15:0 iso 2oh/

45、16:1w7c-45048-summed feature 510.1318:2 w6,9c/18:0 ante18:0 ante/18:2 w6,9c-2538-summed feature 70.55un 18.846/19:1 w6c 19:1 w6c/.846/19cy -19:0 cyclo w10c/19w62.2 土壤微生物脂肪酸(plfas)生物標(biāo)記數(shù)量和結(jié)構(gòu)分析2.2.1土壤微生物脂肪酸(plfas)生物標(biāo)記數(shù)量和結(jié)構(gòu)總體變化（1）脂肪酸(plfas)生物標(biāo)記種類數(shù)的變化煙株生長過程中，所采集的新鮮土壤樣品中各plfas種類和plfas特征峰反應(yīng)值大小如表2所示。從表2可知，各

46、處理的plfas種類隨著生長時間而變化。不同生長期，煙草土壤中的微生物群落的plfas不同，但總的變化趨勢一致，即；plfas的種類，隨生育期的延長呈增加趨勢?；A(chǔ)土樣中plfas主要有14種（4個處理中有3個或以上存在的同一種plfas），第30天的土樣中plfas達(dá)到了22種，60天后達(dá)到24種，煙葉成熟采收期則穩(wěn)定地達(dá)到了34種；對于整個生育期而言，先后總共出現(xiàn)有43種的plfas。（2）特征脂肪酸(plfas)生物標(biāo)記量的變化plfas不但在種類上隨著生育期的延長而增加，其含量也呈遞增的趨勢。而對于plfas總含量和各特征plfas含量而言，因處理和時間而異。尤其是到了煙草葉生長后期，

47、14:0、i14:0、i15:1 g、16:0 10 me、a16:0、16:0 n alcohol、17:0、17:0 10 me、cy 17:0、17:18c、18:0、18:36c (6,9,12)、20:0、20:19c、20:46,9,12,15c和unknown 14.502等主要脂肪酸生物標(biāo)記（plfas），不但在總脂肪酸中占主要地位，而且各處理plfas含量皆為最高，盡管在整個生長過程，各plfas含量的變化趨勢有所不同。且生長后期，施用25%雞糞處理的各plfas含量皆高于其它各處理。（3）特征脂肪酸(plfas)生物標(biāo)記分布結(jié)構(gòu)的變化從煙田不同處理組土壤中提取到的43種脂肪

48、酸生物標(biāo)記，指示著不同類群的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、原生生物等。不同脂肪酸生物標(biāo)記在土壤的分布可分為4種類型：（1）生物標(biāo)記數(shù)量小，在各處理中的分布不完全，如12:0指示著細(xì)菌，相對生物量在0到1654；（2）生物標(biāo)記數(shù)量小，在各層次的分布為完全分布，如14:0指示著細(xì)菌，相對生物量在519到5918；（3）生物標(biāo)記數(shù)量大，在各層次的分布不完全，如18:0 10me指示著放線菌，數(shù)量在1854-10315之間；（4）生物標(biāo)記數(shù)量大，在各層次的分布為完全分布，如16:0指示著細(xì)菌，數(shù)量在31320-107126之間。2.2.2 土壤特征微生物類群磷脂脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記數(shù)量和結(jié)構(gòu)

49、的變化（1）特征微生物脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記的結(jié)構(gòu)變化從圖2可知，對于表征土壤中各大類微生物的特征plfas標(biāo)記而言，其大小順序?yàn)椋杭?xì)菌的i16:01相對生物量（405408）大于表征真菌的18:1w9c16（360420）大于表征放線菌的 10me 18:0 1（29178）大于原生動物20:4w6,9,12,15c 6（25146）。圖2 土壤微生物類群主要特征微脂肪酸plfas相對含量fig2. the relative content of main microbial communities varieties plfas in soil（2）不同施肥處理組脂肪酸（plfas）生物標(biāo)記的結(jié)構(gòu)變化從圖3可知，對于不同處理對各大類土壤plfas相對生物量的影響不同，但趨勢相似，表征土壤中各大類微生物的特征plfas i16:0、18:1w9c、10me 18:0和20:4w6,9,12,15c的相對生物量較為一致，皆為施用25%雞糞大于25%餅肥大于不施肥的對照處理大于化肥處理。圖3 施肥處理對主要plfas的影響fig3.the effects of fertilization treatments on the plfas content表2 煙草土壤微生物各plfas的反應(yīng)區(qū)域值的動態(tài)變化table3. dynami