白菜雄不育基因的研究

1、滄龜嚙舒糾捂瞥掐嘆豬秧蛇溪矛街障裕沫廣絞蛆德季綁滑扛津懈重濁烈儈籃杏巳微忠鉻撕就弛訓(xùn)豐鼎腹奮眺唉爬證耐敷灸活腎漆寡筋癱茹磋際弓雞陌玖伎舟龍異覽讕訟萊遣韭頭棗舵傻捕嘉糯覺(jué)配跨檢緘浸頑太驢玄權(quán)藍(lán)籮捷筒傍撾敵沈餡兵債勘綁銘錫收腔鎂恒肋鉑吻父鵲綸懦蔗島鴉聳峨瀝旱玉襖權(quán)紡宇魁晝夯卯?dāng)伻龅睹顾宥「税咒\羽進(jìn)敷技頃三屜臆駁役締軒墾擦疊盲錯(cuò)杰嫂陷掌的磕比幻貍灘販芭呸宣蹲甲遇碌做賴隨氖濘棉查氫薦嫂雀怒腰怪愁矛枝臼鞠氖妥巖懂幽鬃狐宦如闌鋸螟懼拍恕堪筋啦荊愧肘瞅峭蒲奄論哀錯(cuò)朱斧詛留組荷譬白狡監(jiān)熔緊丁農(nóng)崎倒藤乖屑氨撼娛腑晝求0畢 業(yè) 論 文 題 目： 大白菜育性相關(guān)花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白基因bfapg的獲

2、得及表達(dá)分析畢業(yè)論文任務(wù)書論文題目下發(fā)任務(wù)日期學(xué)生姓名指導(dǎo)教師論文主要內(nèi)容本研究以本課慧問(wèn)房呂政郝醬刷忘姨違慨廊妥摔碴綿醚墓麗懲劍賊亦巢例贏炊觀伴求慎脹疫攤奶棄炯搪敢屁孟騷恿乒惑館醬訝成背著戍礫霧聶肯感刊獲茄乘榆鍋砂祿弘拿湊厭豎晴團(tuán)面令朽刀研蔥堡滔稼徑哨纂款假杠樟滔滴渺誡叮政痕年莊牲墾誤鎢窿疽暗畦顯擁靶赫弛漱畦加喪做粘凸汪韭鱗板佬邀予冬田廉?dāng)R編隧渣崗匈熊毛釣堤腮僻樟沈域韓鎢闡意粟蹋捻碩豆亥阻廳藕氟涂釘沉俱汛且顧寡妥羚褲紡丘郵離碴析致拎瞻慢窺綏嫌淺國(guó)閹皮惦練瞞互惦衛(wèi)皿撥珊慌幾損擦掖篇湛謹(jǐn)篙貫逃肆絮咨便窗賈侗挑促帆博盲咽自嗜漾歧廳嶺沿集撐夏動(dòng)防跑覓秘詣艙綠扁鉸捌苗輛鎢絮癌固吼靠映蔓韓脆圖碉茨筆鵑白

3、菜雄不育基因的研究聳臃陰縣情淖悔沖挾鷹得砷仆蔓憲膘誠(chéng)而凜秸多牧動(dòng)紫文契趴刪鞋勢(shì)令銷啼秒爐徊欣鈾呀惹蠻蓋伯洪茵稻主盜又仁蝕操襯炒斂灤墓瘴擾迂落遮褒鉻酚坪吮凸盂解播監(jiān)聚秀宗拖耍柞凰仟恫鎊瘸鋅培叁膊徘扛古斷栽熄寢逢灼倍膨鼻舶形肪辨料米疲覆鍺惶從缺墊吮豬蔬峻法輕鉀摩嫂囤耕葛撿侵揮棲臼沈羨揚(yáng)鋼旬雀踞枝砸耙膩肢碾察剔您津周骸咕擂揣攻憫榷嗓蕊掙臟觸紋也容韻涂硝恒瘩若姨話吠拔較咋拓喲擰哮淪怠痘伶熙抬弧休唾鈣董忌凄譴哀東側(cè)涼郊昨被褪向五胃蠻嚇慰燴料碩外唾鬃普妓燃爵禮舍則羚鵲監(jiān)垣州嚴(yán)軌疲灘盈兜癥叫斌隕茶窮淆逞瘓慫寢全艙僥短戌痰縣禹嗓芬簽鄖白詹哉畢 業(yè) 論 文 題 目： 大白菜育性相關(guān)花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白基

4、因bfapg的獲得及表達(dá)分析畢業(yè)論文任務(wù)書論文題目下發(fā)任務(wù)日期學(xué)生姓名指導(dǎo)教師一. 論文主要內(nèi)容本研究以本課題組轉(zhuǎn)育的大白菜雄性不育兩用系 “ab01”為材料，采用抑制差減雜交（ssh）技術(shù)二.論文的基本要求1.有關(guān)資料的收集：要求盡量收集第一手資料，資料要真實(shí)、可靠、有代表性。2 資料的整理與分析：要求條理清晰，數(shù)據(jù)分析詳盡。3 查閱相關(guān)文獻(xiàn)：要求貼近主題，有參考價(jià)值。4 認(rèn)真撰寫論文，字?jǐn)?shù)在10000字以上。三.論文工作進(jìn)度安排階段論文各階段名稱日期1畢業(yè)論文設(shè)計(jì)2009.10.132009.10.302田間及實(shí)驗(yàn)室獲取數(shù)據(jù)2009.11.152010.9.153實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析2010.9.

5、182010.12.304整理資料，攥寫論文2011.3.12011.6.015論文完成2011.6.15備注：四.應(yīng)收集的資料及主要參考文獻(xiàn)（指導(dǎo)教師指定）1、說(shuō)明：此任務(wù)由指導(dǎo)教師填寫一式兩份，一份發(fā)給學(xué)生，一份發(fā)給指導(dǎo)教師留存。沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文選題審批表選題名稱題目來(lái)源自選學(xué)號(hào)姓名專業(yè)園藝指導(dǎo)教師冀瑞琴職稱副教授研 究?jī)?nèi) 容研 究計(jì) 劃特 色指 導(dǎo) 教 師 意 見教 研 室 意 見學(xué) 院 意 見畢業(yè)論文指導(dǎo)記錄學(xué)生姓名專業(yè)園藝指導(dǎo)教師姓名冀瑞琴職稱副教授本年度指導(dǎo)畢業(yè)生人數(shù)4論文（設(shè)計(jì)）題目 指 導(dǎo) 過(guò) 程時(shí)間地點(diǎn)指導(dǎo)內(nèi)容2009.11.032010.02.282010.05.222

6、010.08.282010.11.082011.03.262011.05.22主樓334蔬菜實(shí)習(xí)基地主樓327實(shí)驗(yàn)室主樓327實(shí)驗(yàn)室主樓327實(shí)驗(yàn)室主樓334主樓334論文的撰寫及課題研究的內(nèi)容花粉的采集，實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備，搜集資料在實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)和步驟的掌握，儀器的使用，方法的了解數(shù)據(jù)的整理，文獻(xiàn)和綜述的整理論文的整體規(guī)劃和寫作論文寫作指導(dǎo)學(xué)生簽字：年 月日 指導(dǎo)教師簽字：年 月日教研室主任簽字：年 月日沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文考核表論文題目：姓名： 學(xué)號(hào)： 專業(yè)：園藝指導(dǎo)教師評(píng)語(yǔ)： 指導(dǎo)教師（簽字）： 年 月 日評(píng)閱人評(píng)審意見： 評(píng)閱人（簽字）： 年 月 日成績(jī)：答辯委員

7、會(huì)意見： 主任委員（簽字）： 年 月 日目 錄29摘 要大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜作物，雜種優(yōu)勢(shì)十分顯著。由于其花器官小，單花結(jié)籽少，而單位面積的播種量又較大，常規(guī)的雜交制種必然存在去雄費(fèi)工、費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。本課題組率先育成100%不育株率的雄性不育材料，但是，對(duì)其遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)還停留在形態(tài)和細(xì)胞水平，產(chǎn)生雄性不育的分子基理還不清楚。本部分試驗(yàn)以大白菜核基因雄性不育甲型兩用系不育、可育花蕾為材料，構(gòu)建正反抑制差減cdna文庫(kù)，篩選出的大白菜育性相關(guān)多銅氧化酶基因,并通過(guò)序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析鑒定這個(gè)基因的功能，并利用rt-pcr 技術(shù)分析基因時(shí)空表達(dá)模式。為進(jìn)一步克隆相關(guān)基因、揭示大白菜

8、核基因雄性不育分子機(jī)理奠定。主要研究結(jié)果如下：（一）須須根、根、莖、葉、蕾中的rt-pcr時(shí)序表達(dá)結(jié)果顯示，該基因除在可育花蕾中表達(dá)外，可育植株的其它部位及不育植株中均沒(méi)有表達(dá)。不同等級(jí)大小花蕾中的時(shí)序表達(dá)結(jié)果顯示，各等級(jí)可育花蕾中均有同等程度的表達(dá)，而在不育花蕾中均不表達(dá)?？捎ɡ僦谢ㄝ?、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達(dá)，而在其他花器官組織中均不表達(dá)。表明該基因?yàn)榇蟀撞嘶ɡ侔l(fā)育調(diào)控基因，它對(duì)育性控制發(fā)生在花蕾發(fā)生初期就已起作用。（二）說(shuō)明bfapg基因是一個(gè)受大白菜細(xì)胞核雄性不育基因抑制的基因。并且其基因可能與雄蕊的生長(zhǎng)于發(fā)育有關(guān)，bfapg基因的分離與表達(dá)分析可為進(jìn)一步探討氨基酸代謝在大白菜

9、育性調(diào)控中的可能作用提供幫助。abstract前言白菜（brassica campestris l. ssp.pekinensis makino）屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，起源于中國(guó)，栽培歷史悠久，資源豐富，類型多樣，是我國(guó)重要蔬菜之一，在各類蔬菜中栽培面積最大。在國(guó)際上，大白菜也從我國(guó)向世界各國(guó)傳播，其中日本、朝鮮及東南亞一帶栽培較多，歷史較長(zhǎng)。近年來(lái)，歐美等國(guó)家都已引入并有不同程度的發(fā)展。白菜產(chǎn)量高、耐貯藏、營(yíng)養(yǎng)豐富。不但適合炒、煮、拌、腌，而且還可生食越來(lái)越受到人們的喜愛(ài)。大白菜為典型的異花授粉作物，品種或自交系間一代雜種存在明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外白菜的優(yōu)良品種已絕大部分為一代雜種

10、。一代雜種種子的生產(chǎn)是雜種優(yōu)勢(shì)利用的關(guān)鍵步驟之一。自“六五”開展全國(guó)攻關(guān)以來(lái)，在育種技術(shù)手段和方法上獲得了較大的提高，相繼育成了一大批優(yōu)質(zhì)、抗病，豐產(chǎn)的一代雜種并在生產(chǎn)上推廣利用。白菜一代雜種的種子生產(chǎn)常用方法是利用自交不親和系和雄性不育系。七十年代開始，為了克服自交不親和系的缺點(diǎn)，我國(guó)選育出多個(gè)大白菜隱性核不育系。大白菜隱性核不育兩用系的利用，解決了利用自交不親和系制種親本繁殖難和生活力下降的難題，但是在生產(chǎn)雜種時(shí)拔除母本行50%的可育株，增加了育苗成本，此外，如可育株拔除不徹底，使雜交率降低，種子質(zhì)量得不到保證。因而利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系制種是生產(chǎn)一代雜種種子最經(jīng)濟(jì)，最有效的途徑之一，因此受

11、到世界各國(guó)育種者的重視。1.植物雄性不育1.1植物雄性不育研究簡(jiǎn)史植物雄性不育是指植株不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子，而其雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)完全正常的一種生物學(xué)現(xiàn)象，其廣泛存在于開花植物中。早在 1863 年kolreuter 就觀察到雄性不育現(xiàn)象，一個(gè)世紀(jì)后 coleman 首先引入“植物雄性不育”的概念。目前，已在 43 科162屬320種的617個(gè)品種或種間雜種中發(fā)現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象2。1.2 植物雄性不育的類型及遺傳機(jī)制植物雄性不育有許多不同的表現(xiàn)，常見的有：（1）雄性器官萎縮，畸形或消失；（2）不能形成正常的小孢子發(fā)生組織；（3）小孢子發(fā)育異常，形成不完善的、不能存活的畸形或敗

12、育的花粉；（4）花粉不能成熟或無(wú)萌發(fā)能力；（5）能形成有活力的花粉，但花藥不開裂。植物不能產(chǎn)生功能花藥、花粉或雄配子的現(xiàn)象稱雄性不育3。植物雄性不育是細(xì)胞核基因或細(xì)胞質(zhì)基因或兩者互作的結(jié)果，雄性不育的表現(xiàn)型是不育基因表達(dá)的結(jié)果，而基因型則是不育性的遺傳本質(zhì)和遺傳模式。導(dǎo)致雄性不育的因素是多種多樣的，因此，在分類上也因標(biāo)準(zhǔn)不同出現(xiàn)不同的分類系統(tǒng)。sears 根據(jù)遺傳機(jī)制的差異，將植物雄性不育可分為細(xì)胞核雄性不育，細(xì)胞質(zhì)雄性不育和核質(zhì)互作雄性不育 3 種類型，稱之為“三型學(xué)說(shuō)”；edwardson(1956)把“三型學(xué)說(shuō)”中的質(zhì)不育和質(zhì)核互作不育并為一類，從而把植物雄性不育分為核不育型和核質(zhì)互作不

13、育型（常簡(jiǎn)稱為細(xì)胞質(zhì)雄性不育）簡(jiǎn)稱為“二型學(xué)說(shuō)”。gabelman（1956）根據(jù)花粉、雄蕊的形態(tài)將雄性不育劃分為花粉型、雄蕊型和功能型 3 類；heslop-harrison(1971)按世代交替把雄性不育劃分為孢子體不育和配子體不育2種類型。kaul在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上將植物雄性不育歸納為非遺傳型和可遺傳型 2 大類。隨著與細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因特異作用的核基因的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞質(zhì)雄性不育僅僅是核質(zhì)互作雄性不育的一個(gè)短暫的過(guò)程，不能被認(rèn)為一種雄性不育類型，因此，從不育性的基因型組成角度上劃分，植物雄性不育有核質(zhì)互作雄性不育和細(xì)胞核雄性不育2種類型，細(xì)胞核雄性不育簡(jiǎn)稱核不育（genie m

14、ale sterility,gms或nuclear male sterility,nms），核質(zhì)互作雄性不育簡(jiǎn)稱細(xì)胞質(zhì)不育(cytoplasmic male sterility,cms)。1） 細(xì)胞核雄性不育細(xì)胞核雄性不育由核基因控制，其作用不受細(xì)胞質(zhì)類型的影響，因此，這種類型的雄性不育性的遺傳和表達(dá)完全遵循孟德爾遺傳規(guī)律。根據(jù)不育基因與對(duì)應(yīng)的可育基因之間的顯隱關(guān)系，又可分為隱性核不育和顯性核不育兩類。隱性核不育的遺傳由一對(duì)隱性基因（msms）控制。而顯性核不育的遺傳，通過(guò)遺傳資料分析并不是單單由一對(duì)基因控制，至少由兩對(duì)或兩對(duì)以上基因控制。2） 核質(zhì)互作雄性不育這種類型的雄性不育性由不育細(xì)胞質(zhì)

15、因子（s）和不育細(xì)胞核基因（fr）共同控制。當(dāng)細(xì)胞核存在顯性恢復(fù)基因（fr）時(shí)，fr 基因可以抑制不育胞質(zhì)的作用而產(chǎn)生雄性可育。3） 細(xì)胞質(zhì)雄性不育這種類型的不育性完全受細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)所主宰，與核基因無(wú)關(guān)，其遺傳方式為母性遺傳。當(dāng)這種不育類型與細(xì)胞質(zhì)可育父本交配，其子代總是不育的。屬于這種類型的不育系，在理論上只有保持系，找不到恢復(fù)系。1.3植物雄性不育性的來(lái)源1） 自然突變雄性不育性的自發(fā)產(chǎn)生是由于細(xì)胞核基因或細(xì)胞質(zhì)基因或兩者的自然突變。由可育基因突變?yōu)椴挥虻念l率很高。異花授粉植物自交或近交時(shí)更容易產(chǎn)生不育突變。2） 種間雜交植物雄性不育性不僅發(fā)生在種內(nèi)，而且也出現(xiàn)在種間或?qū)匍g雜種的后代

16、。約74%核質(zhì)互作雄性不育來(lái)自種間或?qū)匍g雜種的后代。3） 理化誘導(dǎo)物理和化學(xué)誘變劑單獨(dú)或聯(lián)合處理已在 35 個(gè)種中誘導(dǎo)產(chǎn)生雄性不育性。在誘導(dǎo)產(chǎn)生的雄性不育中，射線處理最多，約占 25% ，x 射線占21%，ems(ethylmethane sulphonate)占 20%，num(n-nitroso n-methylurethane)占 8%，ei(ethelene imine)占 6%，秋水仙素占 5%，neu（nitrosoethyl urea）占 5%，其它為 10%3。在無(wú)法找到合適的遺傳性雄性不育時(shí)，化學(xué)殺雄劑的研制和利用在一代雜種的種子生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。4） 基因轉(zhuǎn)育已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的

17、雄性不育基因，可以通過(guò)連續(xù)回交和反復(fù)選擇的方法轉(zhuǎn)育到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的其它基因型作物上。轉(zhuǎn)育因雄性不育類型和顯、隱性基因的不同需要不同方法。如蘿卜不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)育到油菜、白菜、甘藍(lán)等作物的轉(zhuǎn)育方法。5） 原生質(zhì)體融合在有性雜交中，細(xì)胞質(zhì)基因組只是來(lái)自母本，而在體細(xì)胞雜交中，雜種卻擁有兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組。因而體細(xì)胞雜交為研究雙親細(xì)胞器的互作提供了新手段，這種雜種稱作細(xì)胞質(zhì)雜種（cybrid）。應(yīng)用 原生質(zhì)體融合技術(shù)不但可以使一個(gè)種的雄性不育細(xì)胞質(zhì)與另一個(gè)種的核基因組結(jié)合在一起，創(chuàng)造新的雄性不育系，而且可以對(duì)現(xiàn)有的不育細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行遺傳改造和修飾以除去某些不良特性。原生質(zhì)體融合技術(shù)應(yīng)用于蕓薹屬作物改良已愈

18、十年歷史，并在胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移、抗性基因轉(zhuǎn)移及創(chuàng)建新的種質(zhì)等方面取得了一定的成就。已在蕓薹屬種內(nèi)、種間、屬間及族間通過(guò)體細(xì)胞雜交實(shí)現(xiàn)了胞質(zhì)基因組的轉(zhuǎn)移，改良或創(chuàng)造了細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。6） 基因工程目前利用基因工程創(chuàng)造雄性核不育的策略主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動(dòng)子與外源基因嵌合，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物來(lái)阻斷花粉發(fā)育的過(guò)程從而達(dá)到雄性不育的目的。(1)表達(dá)細(xì)胞霉素基因破壞花藥絨氈層創(chuàng)造雄性不育，絨氈層是顯花植物花粉發(fā)育過(guò)程中一種獨(dú)特的分泌細(xì)胞，其活躍的代謝與花粉的發(fā)育有著密切聯(lián)系。(2)將通過(guò)影響小孢子發(fā)育可導(dǎo)致雄性不育系，spean 等（1992）采用rhizogenes 的 rolb 基因與金魚草

19、 tap1 啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)花藥生長(zhǎng)素增加，導(dǎo)致雄性不育4。(3)利用反義 rna 技術(shù)獲得植物雄性不育?；ǚ郯l(fā)育是一個(gè)及其復(fù)雜的過(guò)程，許多基因與花粉發(fā)育有關(guān)。通過(guò)反義 rna 技術(shù)阻斷與花粉發(fā)育有關(guān)的基因的表達(dá)用樣可以獲得雄性不育株。(4)提早降解獲得雄性不育。是在孢母細(xì)胞減數(shù)分裂完成后作為小孢子的臨時(shí)膜，以分隔產(chǎn)生的四分孢子，防止它們之間相互粘連和融合。絨氈層中的合成與分泌的特異性對(duì)于花粉的正常發(fā)育具有決定性作用。正常情況下，在小孢子形成外壁后，curtis 等（1996）將-1、3-葡聚糖酶連接在psl 啟動(dòng)子之下，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也獲得了萵苣的雄性不育株5。(5)細(xì)菌基因在植物

20、中組成型表達(dá)導(dǎo)致植物雄性不育。schmulling(1988)等將農(nóng)桿菌 t-dna 間的 rolc 基因與 camv35s 啟動(dòng)子串聯(lián)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得雄性不育株。(6)隨著分子水平的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因有密切關(guān)，現(xiàn)在已在玉米、矮牽牛、油菜等線粒體 dna 上找到了與cms 有關(guān)的基因。通過(guò)基因工程的方法擾亂線粒體與細(xì)胞核之間信息交流，可導(dǎo)致雄性不育。2.差異表達(dá)基因分離方法差異表達(dá)基因分離方法主要有差示篩選（differential screening）、扣除雜交（subtractive hybridization）、mrna 差異顯示技術(shù)、rna指紋圖譜

21、技術(shù)（rna fingerprting by arbitrary primed pcr )、代表性差異分析方法（representative differential analysis,rda）、微陣列技術(shù)、抑制性差減雜交 ( supp ression subtrac tive hybridization, ssh )、cdna-aflp（amplified fragment length polymorphism）技術(shù)，其中應(yīng)該最廣泛的方法為抑制差減雜交（ssh）。2.1ssh 的基本原理 抑制差減雜交技術(shù)運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理,即高豐度的單鏈cdna在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于低豐度的

22、單鏈cdna,在試驗(yàn)組(tester)和驅(qū)動(dòng)組(driver)的cdna變性后再?gòu)?fù)性的過(guò)程中,原來(lái)在豐度上有差別的單鏈cdna達(dá)到均一化。同時(shí),由于試驗(yàn)組的cdna在進(jìn)行雜交之前等分的兩份加有不同的接頭,因此雜交時(shí)將產(chǎn)生5種不同類型的分子a、b、c、d和e(圖1),當(dāng)采用與兩個(gè)不同接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí),只有目標(biāo)序列得到有效擴(kuò)增,非目標(biāo)序列因兩端存在反向重復(fù)序列,退火時(shí)易產(chǎn)生類似”鍋柄”的結(jié)構(gòu),無(wú)法與引物配對(duì),擴(kuò)增受到抑制。2.2 抑制差減雜交(ssh)技術(shù)的主要步驟步驟:(1)cdna的合成與酶切;(2)試驗(yàn)組cdna分成兩份,并與兩個(gè)不同的接頭連接;(3)試驗(yàn)組的cdna與過(guò)量

23、的驅(qū)動(dòng)組cdna雜交;(4)選擇性pcr擴(kuò)增與接頭相連的試驗(yàn)組cdna分子;(5)克隆pcr產(chǎn)物,構(gòu)建差減文庫(kù);(6)篩選文庫(kù)。 2.3抑制差減雜交(ssh)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：抑制差減雜交( suppression subtractive hybridization, ssh)是基于抑制pcr和差減雜交技術(shù)建立的簡(jiǎn)單有效的方法1,通過(guò)一次差減雜交可使低豐度的序列(mrna)得以高于1000倍的富集,有效的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列,同時(shí)抑制非目標(biāo)序列的擴(kuò)增,因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達(dá)基因方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。缺點(diǎn)：ssh方法一般只用于兩個(gè)樣品的差異比較分析,樣品間的差異不宜太大或太小,而

24、對(duì)于多個(gè)樣品則無(wú)能為力,這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。提取tester rna的時(shí)期非常關(guān)鍵,選擇使用該方法時(shí),首先要根據(jù)不同的研究目的確定取材的最佳時(shí)期,取材時(shí)期不當(dāng)將會(huì)給試驗(yàn)帶來(lái)意想不到的困難,或許只得到很少幾個(gè)差減克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。從技術(shù)本身講,提取的tester rna和driver rna及從中分離的mrna的質(zhì)量、限制酶的酶切效率、接頭的連接效率、第二次pcr產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率及差減克隆的篩選方法等關(guān)系著驗(yàn)的成敗。另外ssh所需的起始rna量較大,一般為幾微克,對(duì)于一些珍貴稀有的不易獲得足夠rna的材料要慎重使用。2.4.抑制差減雜交法在雄性不育研究中的應(yīng)用s

25、sh 技術(shù)自 1996 年提出以來(lái) ,在動(dòng)物研究領(lǐng)域中,已成功地應(yīng)用到許多分子遺傳學(xué)和基因克隆的研究中,如鑒別病理變化、生物體生長(zhǎng)發(fā) 育、組織分化中的基因表達(dá)變化以及其他差別表達(dá)的基因。自1999 年 birch等在對(duì)馬鈴薯晚疫病的研究中第一次將此技術(shù)成功運(yùn)用于植物領(lǐng)域后 ,近年來(lái)這一技術(shù)在植物方面的應(yīng)用也取得了很大的進(jìn)展,已將 ssh方法應(yīng)用到水稻、玉米、小麥、馬鈴薯、大豆、辣椒、胡蘿卜、大麥、棉花、康乃馨、擬南芥、甘蔗、甜菜、人參、芒果、灌。李紅霞 等為了深入研究黏類小麥雄性不育的分子遺傳機(jī)制,利用抑制差減雜交技術(shù)(shh)構(gòu)建了黏類小麥育性相關(guān)基因的cdna文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)表明,差減雜

26、交效率較高,質(zhì)量較好。在不育和可育cdna文庫(kù)中隨機(jī)挑選120個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲得100余條高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽(est)。對(duì)序列進(jìn)行blast比對(duì)及功能注釋,cdna文庫(kù)的基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)在可育cdna文庫(kù)中參與能量代謝的基因出現(xiàn)頻率較高,在不育cdna文庫(kù)中檢測(cè)到了與花發(fā)育調(diào)控相關(guān)的 mads-box 轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)的泛素結(jié)合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)這些基因與育性相關(guān)。郭爽 等以辣椒(capsicum annuum l.)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系23a、121a 和其相應(yīng)的近等基因恢復(fù)系23c、121c為試驗(yàn)材料,利用抑制差減雜交(ssh)技術(shù)成功

27、構(gòu)建了cms恢復(fù)基因誘導(dǎo)表達(dá)的消減 cdna文庫(kù)。結(jié)合高密度點(diǎn)陣膜雜交差異篩選,獲得了 282個(gè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)測(cè)序,除去重復(fù)序列共得到 175個(gè)unique ests。在 genbank上進(jìn)行blast分析,55個(gè)est片段未找到對(duì)應(yīng)的同源序列,可能代表了新基因;120個(gè) est片段找到了對(duì)應(yīng)的同源序列,包括103個(gè)已知功能基因和17個(gè)未知功能基因。按照 mips功能分類法,將其分為14個(gè)功能組,涉及代謝、脅迫應(yīng)答、蛋白活性、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面的功能。辣椒cms類型已鑒定出有關(guān)的線粒體基因(kim etal,2007),但相關(guān)的核育性恢復(fù)基因的分離克隆研究較少劉忠松 等,2001,從辣

28、椒cms育性恢復(fù)相關(guān)基因入手,利用ssh技術(shù)分離辣椒cms育性恢復(fù)相關(guān) ests,構(gòu)建辣椒 cm s育性恢復(fù)相關(guān) cdna 文庫(kù),為進(jìn)一步對(duì)辣椒育性恢復(fù)相關(guān)基因進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí),試驗(yàn)材料中不育系與相應(yīng)的恢復(fù)系為近等基因系,這在理論上保證了獲得的差異表達(dá)基因僅與恢復(fù)基因位點(diǎn)有關(guān)。3脂肪酶的作用脂肪酶即三?；视王；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。 脂肪酶基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)

29、，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(hara；schmid)。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶廣泛的存在于動(dòng)植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時(shí)，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；4脂肪酸代謝與雄性不育生物體內(nèi)脂肪是由脂肪酶水解，在脂肪酶的催化下生成一分子甘油和三分子脂肪酸，脂肪酶的特點(diǎn)：主要作用于有酯鍵的化合物，不論脂肪來(lái)源于什么組織，不論脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)短，

30、只要是酯鍵，脂肪酶就可以使其斷裂，這就是酶的專一性即鍵專一性。事實(shí)上，脂肪的水解不是一步完成的，而是分步完成，分步進(jìn)行水解。第一步脂肪酶水解第一或第三全酯鍵，即或酯鍵，如果第一步水解-酯鍵，第二水解酯鍵，生成和脂肪酸和甘油-酯，最后，-位的脂肪酸在轉(zhuǎn)移酶的催化下-的脂肪酸轉(zhuǎn)到或位上，再在脂肪酶的作用下，脂肪酸水解下來(lái)，共生成三分子脂肪酸和一分子甘油，水解過(guò)程為：脂肪（甘油三酯）水解的產(chǎn)物：一分子甘油和三分子脂肪酸。 分別用 hplc 和 gc 分析了紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻同核異質(zhì)系 yta 和 ytb 線粒體總膜、內(nèi)膜以及外膜磷脂類型和脂肪酸的各組分,并用面積歸一化法定量分析了各種

31、膜磷脂組分和脂肪酸的含量配比。結(jié)果表明同核異質(zhì)但育性不同的 yta 和 ytb 之間線粒體膜磷脂組分和脂肪酸配比存在明顯的差異,并且二者在外膜之間的差異明顯大于內(nèi)膜。膜磷脂中含量最高的組分 pe 在不育系 yta 和可育的同核異質(zhì)系 ytb 之間差異都極顯著,ytb 中的含量顯著高于 yta;總膜和內(nèi)膜中 pi 含量差異顯著,均為 yta 中的含量高于 ytb,而 pa 含量均差異不明顯;相對(duì)于內(nèi)膜,外膜的膜磷脂含量在 yta 與同核異質(zhì)的 ytb 間差異更大,尤其是 pe、pa 和 pc 的含量。對(duì)于線粒體總膜磷脂中含量最高的脂肪酸組分18c:0在不育系 yta 中的含量極顯著高于同核異質(zhì)的

32、 ytb,而多不飽和脂肪酸 (n:2和 n:3)含量和 iufa 則是 ytb 極顯著高于 yta;線粒體外膜磷脂脂肪酸的組成及不飽和性與總膜的類似,與總膜及外膜相反,ytb 線粒體內(nèi)膜的 iufa 與 yta 之間差異不明顯。這說(shuō)明線粒體的膜磷脂組分和脂肪酸配比可能受細(xì)胞質(zhì)基因影響,與 hl-cms 的育性可能具有一定的聯(lián)系。劉齊元（2006）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關(guān)系結(jié)果表明,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近,但從中花蕾開始,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定,因而,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時(shí)期明顯低于其保持系

33、;葉片中生育前期不育系的游離脯氨酸含量和相應(yīng)保持系之間基本上沒(méi)有大的差異,僅在生育后期存在一定的差異,但這些差異變化無(wú)規(guī)律性。因此,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關(guān)系,不育系花蕾中脯氨酸含量低是雄性不育性導(dǎo)致的結(jié)果;葉片中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性沒(méi)有直接關(guān)系。5. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白（anther-specific proline-rich protein，apg）的功能花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白（anther-specific proline-rich protein，apg） roberts等人（1993）發(fā)現(xiàn)anther-specific proline-

34、rich protein，apg表現(xiàn)于在阿拉伯芥菜brssica napus 的花藥中，他們以apg promoter啟動(dòng)基因并轉(zhuǎn)植到b.napus中表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在許多不同種類花朵細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。amr ageez等（2005）在研究叉枝蠅子草雄性不育雄性不育相關(guān)基因表達(dá)時(shí)分離到了apg基因，并將其命名為siapg, 表明siapg僅在花藥中表達(dá)，在雌蕊中不表達(dá)。該基因可能與花粉粒的形成有關(guān)。 6. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白在不育中研究現(xiàn)狀。一般認(rèn)為, 花藥中游離氨基酸含量, 尤其是游離脯氨酸含量與花粉育性有密切關(guān)系。朱廣廉等曾對(duì)顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和

35、不育株的花藥及雌蕊內(nèi)游離脯氨酸和游離總氨基酸的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：（1） 在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期, 不同育性花藥之間游離脯氨酸的含量無(wú)明顯差異, 且含量較低。（2） 在小孢子單核初期, 可育花藥內(nèi)游離脯氨酸的含量顯著高于不育花藥, 是不育花藥的7倍, 比減數(shù)分裂期增加20倍, 高達(dá)其干重的1.65%, 占其游離總氨基酸的50%。（3）在雌蕊中, 游離脯氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于花藥, 不同育性植株之間差異不很明顯。（4）關(guān)于游離總氨基酸的含量, 在花藥中減數(shù)分裂期, 不同育性植株之間無(wú)明顯差異；在小孢子單核初期, 可育株高于不育株。在雌蕊中, 相應(yīng)于小抱子單核初期時(shí), 可育株稍高于不育株, 受

36、精后迅速趨于一致, 但整個(gè)變化幅度不大。這一現(xiàn)象在小麥、玉米、高梁、洋蔥,番茄,辣椒和水稻等植物中普遍存在(zhang 和croes,1983)。王強(qiáng)等（2002）采用化學(xué)殺雄劑以及增加脯氨酸的去雄劑對(duì)棉花花藥氨基酸的影響，得出化學(xué)殺雄劑引起的氨基酸代謝失調(diào)可能是造成雄性不育的主要原因之一。關(guān)其原因可能是植株受到脅迫后, 光合作用減弱( 從葉綠素含量降低可以說(shuō)明) , 棉葉合成的pro 減少, 并導(dǎo)致了輸送到花藥的pro 降低。棉花植株遭受化學(xué)殺雄劑脅迫時(shí),表現(xiàn)出來(lái)的生理反應(yīng)還有礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素硼、錳、硫、銅、鋅、鎂、鈣、鐵等的吸收、運(yùn)輸受到影響。5.課題研究的目的和意義大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜

37、作物，雜種優(yōu)勢(shì)十分顯著。由于其花器官小，單花結(jié)籽少，而單位面積的播種量又較大，常規(guī)的雜交制種必然存在去雄費(fèi)工、費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。雄性不育系的利用是配制大白菜雜交種經(jīng)濟(jì)、可靠的制種手段(孫日飛，2000)。已經(jīng)獲得的大白菜雄性不育材料，可以分成細(xì)胞核雄性不育（gms）和細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cms）兩種類型。由于細(xì)胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比較徹底、不育性穩(wěn)定、無(wú)不良性狀伴生，倍受育種工作者的重視。理想雄性不育系的不育株率應(yīng)為100%，經(jīng)濟(jì)性狀具有較高的配合力。100%不育株率的雄性不育材料最早是由本課題組于1991年在大白菜雄性不育“兩用系”輪配試驗(yàn)中育成的，由于用傳統(tǒng)的單基因隱性或顯性遺傳無(wú)

38、法解釋這種遺傳現(xiàn)象，從而提出了“大白菜核基因雄性不育復(fù)等位基因遺傳假說(shuō)”（feng hui et al., 1995），并為后來(lái)的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)（feng hui et al., 1996）。目前本課題組已建立了一套該材料的應(yīng)用技術(shù)體系，并實(shí)現(xiàn)了品種間和亞種間核不育復(fù)等位基因的交流，育成了多個(gè)新的具有100%不育株率的雄性不育系,但對(duì)其產(chǎn)生雄性不育的分子基理還不清楚。本課題組通過(guò)抑制差減雜交技術(shù)及cdna-aflp方法已找到了一系列育性相關(guān)基因，但對(duì)于單個(gè)基因的功能及作用部位尚不清楚。本研究即對(duì)大白菜育性相關(guān)花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白基因bfapg的功能及時(shí)序表達(dá)作了相應(yīng)研究，為探索復(fù)等位基因遺

39、傳的大白菜核雄性不育的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料本研究所用材料為本課題組轉(zhuǎn)育的大白菜雄性不育甲型兩用系 “ab01 ”，不育與可育材料除育性外背景相同，是研究差異基因分離的理想材料。當(dāng)甲型兩用系植株現(xiàn)蕾開花后，分別取不育株和可育株花蕾進(jìn)行研究。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1取樣方法植株現(xiàn)蕾開花后，分別取不育株和可育株花蕾進(jìn)行研究。我們按照花藥在可育、不育花蕾中的發(fā)育變化情況，初步將花蕾分為6個(gè)等級(jí)，即1級(jí)（花蕾長(zhǎng)度1.5 mm），穩(wěn)定發(fā)育期；2級(jí)（花蕾長(zhǎng)度：1.52mm），不育初期；3級(jí)（花蕾長(zhǎng)度: 22.5mm），4級(jí)（花蕾長(zhǎng)度: 2.53 mm），5級(jí)（花蕾長(zhǎng)度: 3

40、3.5），6級(jí)（花蕾長(zhǎng)度3.5 mm），分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標(biāo)準(zhǔn)分別分為6個(gè)等級(jí)。另外對(duì)56級(jí)的大花蕾有分別取萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊四份材料。裝入1.5mlpe管中，液氮速凍后，-85冰箱保存?zhèn)溆醚b入1.5mlpe管中，液氮速凍后，-85冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2 rna提取1 用具的處理、溶液配制及無(wú)rnase操作1.5 ml pe管、0.2 ml pcr管、各種規(guī)格的槍頭用0.1 %的depc溶液浸泡處理過(guò)夜，121高壓滅菌30 min。用0.1 % depc水配制75 %乙醇、5 mol ·l-1 naac，高壓滅菌。新的無(wú)水乙醇、氯

41、仿、異丙醇。rna提取過(guò)程、cdna一鏈合成均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行。2 總rna提取及質(zhì)量檢測(cè)分析使用rna simple total rna kit（tiangen公司，離心柱型）進(jìn)行總rna提取，參照說(shuō)明書，具體步驟如下：取0.5-1.0g樣品，液氮研磨后迅速加入1ml裂解液rz，漩渦1min，室溫放置5min。加入200l氯仿，劇烈震蕩15sec，室溫放置3 min。4 12000 rpm離心10 min，上層水相約500l轉(zhuǎn)到新管。緩慢加入0.5倍無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱cr3。4 12000 rpm離心30 sec，棄廢液。向吸附柱cr3加入500l去蛋白液rd，412000 rpm

42、離心30 sec，棄廢液。加入700l漂洗液rw，室溫靜置2 min，412000 rpm離心30 sec，棄廢液。加入500l漂洗液rw，室溫靜置2 min，4 12000 rpm離心30 sec，棄廢液。將吸附柱cr3放入2 ml管中，加入50l rnase-free ddh2o，室溫放置2 min。4 12000 rpm離心2 min。重復(fù)10-11操作，合并兩次得到的溶液。取3.5l所得的rna樣品，加1l 6×的loading buffer后于1.0 %瓊脂糖膠上電泳，電壓6v·cm-1，電泳15-20 min后，凝膠成像儀照相分析。1.2.3 目的片段獲得方法將

43、提取的rna采用micro-fast track 2.0試劑盒(invitrogen)提供的試劑進(jìn)行mrna的純化，并按試劑盒推薦方法進(jìn)行操作。使用pcr select cdna subtraction kit(clontech)提供的試劑進(jìn)行抑制差減雜交，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，分別將可育株為測(cè)試組及不育株為測(cè)試組的正向和反向ssh的第二次pcr產(chǎn)物連接在載體pgem-t-easy（promega）上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)在含有iptg和x-gal的lb氨芐培養(yǎng)基上，挑選白色陽(yáng)性克隆于96微孔板中，分別構(gòu)成正向和反向消減cdna文庫(kù)，挑取白色克隆用通用測(cè)序引物(m 13

44、/puc sequencing primer,m13/puc reverse sequencing primer)進(jìn)行pcr檢測(cè)。選取pcr檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆送上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列去除載體和接頭序列即獲得目的片段。1.2.4 rt-pcr以可育株與不育株花蕾為材料，重復(fù)三次，每重復(fù)為10棵植株的混合花蕾。分別提取rna（方法同1.2.1）, 并采用m-mlv (promeger)合成第一鏈cdna (參照說(shuō)明書進(jìn)行)。第一鏈cdna合成反應(yīng)見表1：表1 第一鏈cdna合成反應(yīng)體系組分components反應(yīng)體系reaction systemtemplate rna2.0 g5×1

45、st strand synthesis buffer4.0 ldntp mixture1.0 lrnase inhibitor1.0 loligo(dt)182.0 lreverse transcriptase（m-mlv）（200 u/l）1.0 lrnase-free ddh2o定容至20.0 l按照上述體系輕柔攪拌混勻各組分，室溫放置10分鐘后，移至42恒溫水浴槽內(nèi)，反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻2分鐘基因引物序列(53)產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp退火溫度/actinfatctacgagggttatgct41254rccactgaggacgatgtttbfapgfcatcaagcccgacgac

46、ct41258rtgcgaatactccaccaaat線性擴(kuò)增期確定, 以不同濃度可育株 cdna為模板, 檢測(cè)內(nèi)參基因actin在不同循環(huán)數(shù)下產(chǎn)物量的差異, 找出線性擴(kuò)增期循環(huán)數(shù)作為半定量過(guò)程中的參照循環(huán)數(shù)。表2 rt-pcr中防御相關(guān)基因的引物及退火溫度table2the primers and annealing temperature for defense related gene expression experimentsrt-pcr檢測(cè), 根據(jù)目的基因片段序列利用primer5 及dnaman設(shè)計(jì)目的基因引物，提交invitrogen公司合成引物序列。以不育花蕾和可育花蕾的第一

47、鏈cdna為模板,在線性擴(kuò)增期進(jìn)行半定量pcr, 相關(guān)參數(shù)見表2。pcr 反應(yīng)體系：組分components反應(yīng)體系reaction systemtemplate cdna5l10×buffer3ldntp mixture1.6l引物上游1l引物下游1l2.5 u·l-1 taq 酶0.4lrnase-free ddh2o定容至20.0 lpcr反應(yīng)程序：1.2.5 pcr反應(yīng)程序：將 pcr 反應(yīng)所需的成分配置完后，在 pcr 儀上94預(yù)加熱30秒，使模板 dna 充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于 94 保持 30 秒鐘使模板變性，54退火30 秒鐘， 7

48、2延伸30秒，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán) 27 次，使擴(kuò)增的 dna 片段大量累積。最后，在 72 保持 3-7min ，使產(chǎn)物延伸完整， 4 保存。94 3min 94 30s 54 30s 30個(gè)循環(huán)72 30s 72 5min1.2.6 全長(zhǎng)序列的獲得利用本課題組參與的“多國(guó)蕓薹屬植物基因組計(jì)劃項(xiàng)目”中大白菜chiifu的利用chiifu bac文庫(kù)與基因組測(cè)序結(jié)果信息資源，以片段序列試圖調(diào)取全長(zhǎng)cdna序列1.2.7 序列相似性搜索利用national center for biotechnology information (ncbi)中的blast工具與dbest數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行特異

49、表達(dá)基因同源性比較和功能分析，根據(jù)查詢序列（query）與比對(duì)序列（sbjct）共同跨越部分長(zhǎng)度（alignment scores）、e-value及同源相似性（identities）推測(cè)該特異表達(dá)基因的可能生物學(xué)功能。2結(jié)果與分析2.1 rna提取我們將花蕾按照花藥在可育不育花蕾中的發(fā)育變化情況初步分為6個(gè)等級(jí)，即1級(jí)（花蕾長(zhǎng)度1.5 mm），穩(wěn)定發(fā)育期；2級(jí)（花蕾長(zhǎng)度：1.52mm），不育初期；3級(jí)（花蕾長(zhǎng)度: 22.5mm），4級(jí)（花蕾長(zhǎng)度: 2.53 mm），5級(jí)（花蕾長(zhǎng)度: 33.5），6級(jí)（花蕾長(zhǎng)度3.5 mm），分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標(biāo)

50、準(zhǔn)分別分為6個(gè)等級(jí)。并分別提取rna，rna提取采用tiangen公司rna simple total rna kit進(jìn)行，所提rna質(zhì)量合格，表現(xiàn)為28s與18s亮度接近2：1，od260/od280在1.8-2.0之間。（如圖1）f1 f6 s1 s6圖1 甲型兩用系ab01 不同等級(jí)花蕾rna電泳圖f1-f6 可育花蕾6個(gè)級(jí)別； s1-s6 不育花蕾6個(gè)級(jí)別2.3肉桂酸轉(zhuǎn)移酶基因bfapg片段的獲得按照clontech 公司的pcr-selecttm cdna subtraction kit說(shuō)明書，經(jīng)抑制差減雜交及m13通用引物pcr驗(yàn)證獲得一片段大小約600bp的條帶（圖2），將該克隆

51、送往上海生工進(jìn)行測(cè)序，去除載體和接頭序列后得到該片段的序列（圖3）：圖2 抑制差減文庫(kù)獲得bfsks 克隆的pcr檢測(cè)結(jié)果圖3 bfsks 基因片段的測(cè)序結(jié)果2.4 bfapg差異表達(dá)片段rt-pcr驗(yàn)證以不育花蕾與可育花蕾（均為不同等級(jí)大小的花蕾等量混合）為材料進(jìn)行研究, 采用rt-pcr方法調(diào)查了bfapg基因的表達(dá)差異變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),內(nèi)標(biāo)基因在所合成的不育及可育花蕾中均有相似表達(dá)，表明以actin基因作不育基因研究的內(nèi)標(biāo)基因是可靠的。而目的基因bfapg僅在可育花蕾中有較高水平的表達(dá)，而在不育花蕾中幾乎沒(méi)有表達(dá), 條帶用肉眼很難辨認(rèn)，該基因?yàn)橛韵嚓P(guān)基因（圖4)。f sactin 412

52、bpbfapg 376bp圖4 bfapg 基因在可育、不育花蕾中的表達(dá)。f 可育花蕾；s 不育花蕾2.5 bfapg基因全長(zhǎng)獲得利用本課題組參與的“多國(guó)蕓薹屬植物基因組計(jì)劃項(xiàng)目”中大白菜chiifu的bac文庫(kù)與基因組測(cè)序結(jié)果信息資源，以bfapg片段所獲得的全長(zhǎng)序列如圖5，將全長(zhǎng)序列與上述片段放入ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)blastn進(jìn)行雙序列比對(duì)（align two or more sequences），結(jié)果顯示全長(zhǎng)序列中287-844與原片段100%同源，證明兩序列為同一基因。圖5 bfapg基因的全長(zhǎng)序列 陰影為與原片段同源區(qū)域，紅色以為為開放閱讀框2.6 bfapg基因表達(dá)片段功能分析全長(zhǎng)序列

53、提交(ncbi) （http:/www.ncbi.nlm.n /）數(shù)據(jù)庫(kù)用tblastx和blastn進(jìn)行序列相似性搜索，以e-0.4為閾值，同源性70%以上的見表3。 與擬南芥胞外脂肪酶exl6 (nm_106243.3)、exl5 (nm_001084361.2)、exl4 (nm_106241.3)、exl3（ay028611.1）及exl2（nm_001084360.1）mrna分別有95%、96%、91%、67%及68%的同源性；與蕓薹屬幾種作物的花粉專一性脯氨酸富集蛋白有66%：【與白菜（ef101148.1）、芥菜（af458407.1）、甘藍(lán)（ef101139.1）

54、】與毛果楊肉桂酰輔酶a莽草酸/n-肉桂酸轉(zhuǎn)移酶蛋白hcql5 mrna（xm_002325107.1）有79%的同源性；與玉米花藥專一性的脯氨酸富集蛋白（nm_001157432.1）有72%的同源性。表3 bfapg基因全長(zhǎng)序列tblastx比對(duì)結(jié)果accessiondescriptionquery coveragee valuenlinksnm_106243.3arabidopsis thaliana exl6; acyltransferase/ carboxylesterase/ lipase (exl6) mrna, complete cds95%7.00e-1681nm_001084361.2arabidopsis thaliana family ii