質(zhì)粒酶切PPT課件

1、第1頁/共18頁 關(guān)于限制性內(nèi)切酶1. 定義：識別雙鏈DNA分子核苷酸序列 并加以切開2. 來源：細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)3. 特性：識別4 6個核苷酸序列 產(chǎn)生平端和粘端4. 應(yīng)用：定點切割第2頁/共18頁 酶切產(chǎn)生的末端（1 1） G A TG A TA T CA T C C T AC T AT A GT A G EcoR EcoR酶切產(chǎn)生平端酶切產(chǎn)生平端 G A T G A T P PA T CA T C C T AC T AP P T A G T A G（2 2） G GA A T T CA A T T C C T T A AC T T A AG G EcoR EcoR酶切產(chǎn)生酶切產(chǎn)生5 5

2、突出粘突出粘端端 G G P PA A T T CA A T T C C T T A AC T T A AP P G G (3 (3） C T G C AC T G C AG G G GA C G T CA C G T C Pst Pst酶切產(chǎn)生酶切產(chǎn)生3 3突出粘突出粘端端 C T G C A C T G C A P PG G G GP P A C G T C A C G T C第3頁/共18頁第4頁/共18頁 酶切反應(yīng)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml0.5ml離心管中進(jìn)行。20l20l體積反應(yīng)體系如下： A: A: 質(zhì)粒（pGEM-1808 pGEM-1808 或pET21apET2

3、1a） 0.5g 0.5g B: 10 B: 10酶切buffer 2.0lbuffer 2.0l C: Hind 0.5l C: Hind 0.5l D: EcoR 0.5l D: EcoR 0.5l E: E: 加ddHddH2 2O O 至20l20l3737水浴消化1 1小時。第5頁/共18頁EcoR EcoR EcoR EcoR pGEM-NGFNGFNGF酶切pGEM載體EcoR EcoR 第6頁/共18頁 質(zhì)粒的酶切電泳第7頁/共18頁瓊脂糖凍融法回收、純化DNADNA片段1. 1. 在紫外燈下仔細(xì)切下含所需在紫外燈下仔細(xì)切下含所需DNADNA片段的膠條（小于片段的膠條（小于0.

4、6g0.6g） 搗碎，置于搗碎，置于1.5ml1.5ml離心管中。離心管中。2. 2. 加入等體積的加入等體積的Tris-ClTris-Cl飽和酚（飽和酚（pH 7.6pH 7.6），振蕩混勻；），振蕩混勻； -20-20放置放置5-10min5-10min待結(jié)凍；待結(jié)凍；3. 10000rpm3. 10000rpm5min5min，上層液轉(zhuǎn)移置另一離心管中；，上層液轉(zhuǎn)移置另一離心管中；4. 4. 原管加入原管加入1/41/4體積體積H H2 2O O于含膠的離心管中，振蕩混勻；于含膠的離心管中，振蕩混勻； -20-20放置放置5-10min5-10min待結(jié)凍；待結(jié)凍；5. 10000rpm

5、5. 10000rpm5min5min，合并上清液；，合并上清液；6. 6. 用等體積酚用等體積酚/ /氯仿抽提氯仿抽提2 2次、氯仿抽提次、氯仿抽提1 1次，次， 取上清于新微量離心管；取上清于新微量離心管；7. 7. 加入加入1/101/10體積體積3M NaAc3M NaAc（pH 5.2pH 5.2），），2.52.5倍體積預(yù)冷的倍體積預(yù)冷的 無水乙醇，無水乙醇，-20-20，放置，放置30min30min（或過夜）；（或過夜）；8. 13000rpm8. 13000rpm10min10min，棄上清；，棄上清；75%75%乙醇洗沉淀乙醇洗沉淀1-21-2次，晾干；次，晾干；9. 9.

6、 適量適量H H2 2O O或或TETE溶解；電泳檢測。溶解；電泳檢測。第8頁/共18頁第9頁/共18頁關(guān)于連接酶定義：ATP存在下，在3OH和5 P之 間形成磷酸二酯鍵。特性：連接粘端的效率遠(yuǎn)高于平端。策略： 1.首選不匹配粘端 2.次選匹配粘端，載體脫磷 3.平端連接，提高酶量第10頁/共18頁 不匹配粘端連接圖示第11頁/共18頁 匹配粘端連接圖示第12頁/共18頁 平端連接圖示第13頁/共18頁 DNA片段的連接反應(yīng)連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行1. 10l體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一 定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為11-15），補ddH2O 至8l。2. 輕輕混勻，稍加離心，置56 5min， 迅速轉(zhuǎn)入冰浴。4. 加入含ATP的10Buffer 1l。5. T4 DNA連接酶1l。6. 稍加離心,14-16連接8-14h