蛋白質(zhì)的電化學(xué)化學(xué)研究

1、 蛋白質(zhì)的電分析化學(xué)研究 王惠凱摘要：生命現(xiàn)象的許多過(guò)程皆伴隨著電子傳遞反應(yīng)，應(yīng)用電化學(xué)方法研究生物體系的電子傳遞及其相關(guān)過(guò)程是揭示生命本質(zhì)的較好途徑。本文從酶生物傳感器、蛋白質(zhì)修飾電極和免疫傳感器3 個(gè)方面評(píng)述了近年來(lái)蛋白質(zhì)的電分析化學(xué)研究的現(xiàn)狀和進(jìn)展，并提出了今后可能的研究方向。關(guān)鍵詞：生物傳感器；酶生物傳感器；免疫傳感器；蛋白質(zhì)；電分析化學(xué)中圖分類號(hào)：0657.l 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：l000-0720（2006）0l-0ll4-09 蛋白質(zhì)屬于生物有機(jī)大分子，是決定生命存在和運(yùn)動(dòng)的最重要的一類物質(zhì)。從極其復(fù)雜的具有多細(xì)胞和組織、器官分化的高等動(dòng)、植物，到簡(jiǎn)單的單細(xì)胞原核生物甚至無(wú)

2、細(xì)胞的分子生命形式病毒，一切生命體的繁衍、代謝、生存、發(fā)展都離不開蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在構(gòu)成有機(jī)體和完成體內(nèi)精確的生化代謝和機(jī)體多樣的生理功能中發(fā)揮著重要作用。從整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)來(lái)看，蛋白質(zhì)的代謝和利用是維持物種關(guān)系和生態(tài)平衡的重要因素。對(duì)于整個(gè)自然界來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)作為一種主要的有機(jī)氮存在方式，它在物質(zhì)循環(huán)中起著重要作用，它的出現(xiàn)和演變對(duì)生命的起源和物種的形成、進(jìn)化具有重要的意義。對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)作為基本營(yíng)養(yǎng)成份是人類生存所需的基本物質(zhì)，所以對(duì)蛋白質(zhì)的研究、開發(fā)和利用都是非常重要的課題。 用電化學(xué)手段研究蛋白質(zhì)和酶的電子傳遞過(guò)程，引起國(guó)內(nèi)外化學(xué)家和生物化學(xué)家的廣泛關(guān)注，因?yàn)檠趸€原和電極之間的電子傳遞

3、過(guò)程更接近生物氧化還原系統(tǒng)的原始模型l。l . 電化學(xué)和氧化還原的電子傳遞過(guò)程或氧化還原反應(yīng)均包含異相的電子傳遞過(guò)程；電化學(xué)過(guò)程發(fā)生在電極-溶液界面，而生物氧化還原過(guò)程則發(fā)生在蛋白質(zhì)（酶）-體液之間；2 . 電化學(xué)反應(yīng)能模擬生物氧化還原反應(yīng)的條件（即形成仿生界面）：如可將pH、離子強(qiáng)度、溫度、反應(yīng)進(jìn)行的非水環(huán)境等調(diào)節(jié)至生理狀態(tài)；3 . 進(jìn)行電子傳遞之前，蛋白質(zhì)的亞基分子以特殊構(gòu)象定位于電極表面，而在生物體內(nèi)定位于酶的活性位點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)生物大分子與電極之間電子轉(zhuǎn)移必須將生物大分子的電化學(xué)活性中心與電極距離縮短到l nm2，或使生物的分子與電極表面活性基團(tuán)鍵合，以形成電子傳輸通道3。多年來(lái)科學(xué)工作者不

4、斷地探索各種途徑，探討蛋白質(zhì)快速電子傳遞反應(yīng)過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)蛋白質(zhì)生理反應(yīng)過(guò)程的電化學(xué)模擬，為揭示生物氧化還原系統(tǒng)中電子轉(zhuǎn)移機(jī)理奠定基礎(chǔ)。要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)關(guān)鍵是提高氧化還原蛋白質(zhì)和酶與電極之間電子傳遞的速度和可逆程度。本文將對(duì)酶生物傳感器、蛋白質(zhì)修飾電極和免疫傳感器的電化學(xué)研究現(xiàn)狀和進(jìn)展及相關(guān)技術(shù)進(jìn)行評(píng)述。l、酶生物傳感器酶作為一類典型的生物大分子和特殊的催化劑，在生命過(guò)程中扮演著極其重要的角色。尤其是在呼吸鏈中生物氧化和新陳代謝是靠多種酶的共同作用才完成的，研究酶的直接電化學(xué)無(wú)論在理論上還是在實(shí)用上都具有重要意義。在理論上，酶與電極之間直接電子傳遞過(guò)程更接近生物氧化還原系統(tǒng)的原始模型，這就為揭

5、示生物氧化還原過(guò)程的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。另外，酶的直接電化學(xué)的研究可望為推斷生物氧化還原系統(tǒng)中電子傳遞反應(yīng)的特異性提供一定的依據(jù)。l .l 酶生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)及工作原理酶生物傳感器是由一個(gè)固定化的生物敏感膜和與之密切結(jié)合的換能系統(tǒng)組成，它把固定酶和電化學(xué)傳感器結(jié)合在一起，因而具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)4：（l）它既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；（2）由于酶的專屬反應(yīng)性，使其具有高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定。因此，酶電極在生物傳感器領(lǐng)域中占有重要地位。 當(dāng)酶電極浸入被測(cè)溶液，待測(cè)底物浸入酶層內(nèi)部并參與反應(yīng)。大部分酶的反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生或消耗一種可被電極測(cè)定的物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，

6、電活性物質(zhì)的濃度可以通過(guò)電位或電流模式進(jìn)行測(cè)定。因此，酶生物傳感器可分為電位型和電流型兩類傳感器。電位型傳感器是指酶電極與參比電極間輸出的電位信號(hào)，它與被測(cè)物質(zhì)之間服從能斯特關(guān)系。而電流型傳感器是以酶促反應(yīng)所引起的物質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變成電流信號(hào)輸出，輸出電流大小直接與底物濃度有關(guān)。電流型傳感器與電位型相比具有更簡(jiǎn)單、直觀的效果，且靈敏度也較高。 l .2 酶生物傳感器的發(fā)展階段酶電催化研究經(jīng)歷了3 個(gè)發(fā)展階段即以氧為中繼體的電催化，基于人造媒介體的電催化和直接電催化，以葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖（giucOse）為例可說(shuō)明如下：以氧為中繼體的電催化（第一代生物傳感器）溶液：GODOX + g

7、iucOse!giucOnOiactOne + GODred（l）GODred + O2!GODOX + H2O2（2）電極：H2O2!O2 + 2H+ + 2e （3）基于人造中繼體的電催化（第二代生物傳感器）溶液：GODOX + giucOse!giucOnOiactOne + GODred（4）GODred + MOX!GODOX + Mred（5）電極：Mred!MOX + !e （6）直接電催化（第三代生物傳感器）溶液：GODOX + giucOse!giucOnOiactOne + GODred（7）電極：GODred!GODOX + 2e可見前兩種類型的電催化并沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別，它們

8、都需要中繼體作為電子受體（或供體）才能完成催化循環(huán)，因此屬于間接電催化；而直接電催化電極本身就是電子的受體（或供體），在這里酶與電極直接進(jìn)行電子交換從而完成催化循環(huán)。圖l 更直觀地示意出直接電催化和間接電催化的區(qū)別。從應(yīng)用方面而言，酶直接電化學(xué)的實(shí)現(xiàn)可用于研制第三代生物傳感器和發(fā)展人工心臟用的生物燃料電池5。近年來(lái)，人們更關(guān)注酶與電極之間的直接電子傳遞研究并用于構(gòu)造第三代生物傳感器。 圖l 酶電催化類型Fig .l Kinds of electrocatalysis of enzymesS，P，EOX，Ered，MOX和Ired分別代表底物，產(chǎn)物，氧化態(tài)酶，還原態(tài)酶，氧化態(tài)媒介體和還原態(tài)媒介體

9、l .3 酶的固定化技術(shù)由于生物傳感器最主要的一個(gè)元件是固定化的生物傳感器，因此酶膜的固定一直是生物傳感器研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有的固定化方法分為3 大類：即吸附法、包埋法的物理方法，共價(jià)法、交聯(lián)法的化學(xué)方法和電化學(xué)聚合法。吸附法和包埋法簡(jiǎn)單易行，對(duì)酶的失活作用小，但吸附法在制備過(guò)程中受pH、離子強(qiáng)度、溫度的影響比較大，酶固定化不牢，容易脫落；包埋法則因?yàn)榘褫d體網(wǎng)絡(luò)的限制，對(duì)大分子的底物不太適用，且包埋在載體里的生物活性材料亦很容易從載體中逸出。 共價(jià)法和交聯(lián)法主要是利用化學(xué)反應(yīng)將蛋白質(zhì)等生物活性材料的游離基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)到載體上而達(dá)到固定化目的。生物活性材料中可供反應(yīng)的基團(tuán)有- NH2、- COO

10、H、- SH、- OH、咪唑基和苯酚基。 電化學(xué)鍵合法制備生物傳感器通常在中性溶液中。在酶、聚合單體、介體和輔酶同時(shí)存在時(shí)，通過(guò)恒電位或電位循環(huán)掃描法使單體電氧化或還原聚合在基體電極上。聚合過(guò)程中由于吸附或靜電作用，酶或介體等其他物質(zhì)同時(shí)嵌入聚合膜中，與傳統(tǒng)的固定法相比，有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（l）簡(jiǎn)單，電化學(xué)聚合和酶的固定化可一步完成并直接固定于電極表面；（2）聚合層厚度和酶的聚合量容易制得和調(diào)節(jié)，從而制得重現(xiàn)性好的電極；（3）有些高分子膜具有選擇性透過(guò)某些物質(zhì)的功能，可起到降低干擾，防止電極污染的作用。所以電化學(xué)聚合法為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種非常有效的新方法。穆紹林等6用聚苯胺類黃嘌呤氧化酶電極測(cè)

11、定黃嘌呤，就是將電位控制在+ 0 .65 V，在陽(yáng)極鉑片上形成聚苯胺膜，將還原的聚苯胺膜浸入含有黃嘌呤氧化酶的緩沖溶液中，在+ 0 . 6 V 下將聚苯胺膜氧化，使帶負(fù)電荷的黃嘌呤氧化酶摻雜到聚苯胺膜中，以達(dá)到固定酶的作用。羅穎華等7用聚吡咯電化學(xué)固定膽固醇氧化酶來(lái)測(cè)定膽固醇。Bartiett 等8用聚苯酚及其衍生物固定GOD 測(cè)定葡萄糖，獲得了與聚鄰苯二胺相似的結(jié)果，且聚苯酚的效果比其衍生物的效果要好。 圖2 酶的固定化示意圖 Fig .2 Schematic diagram of immobilization of enzyme 圖2生物傳感器問(wèn)世雖然僅30 年，但發(fā)展卻異常迅速，此項(xiàng)新的

12、檢測(cè)技術(shù)，以其專一、靈敏、快速、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越引人矚目，已成為分析科學(xué)中的前沿課題。今后的工作可尋找更為合適的固定方法，尤其是酶含量高，酶層薄的固化層，以制備性能優(yōu)越的第三代酶生物傳感器。酶的直接電化學(xué)和第三代生物傳感器已成為生物電化學(xué)研究的最重要發(fā)展方向之一。盡管如此，迄今只能獲得少數(shù)酶的直接電化學(xué)，尚未找到一種較普遍的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)酶的直接電化學(xué)，同時(shí)對(duì)直接電子傳遞反應(yīng)機(jī)理的研究還欠深入。因此，尋找更有效的方法和手段實(shí)現(xiàn)更多酶的直接電化學(xué)；通過(guò)研究酶的直接電化學(xué)以進(jìn)一步揭示生物體系氧化還原過(guò)程；制備性能優(yōu)越穩(wěn)定可靠的第三代生物傳感器，以滿足生物醫(yī)學(xué)，環(huán)境檢測(cè)和工業(yè)快速分析的需要；必將成為這個(gè)

13、領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。2 、氧化還原蛋白質(zhì)修飾電極氧化還原蛋白質(zhì)在電極上的直接電化學(xué)研究，對(duì)于理解和認(rèn)識(shí)它們?cè)谏w內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制和生理作用具有重要意義。但迄今為止，只觀察到極少數(shù)氧化還原蛋白質(zhì)可在裸固體電極上表現(xiàn)出電化學(xué)活性。 實(shí)現(xiàn)氧化還原蛋白質(zhì)與電極之間的直接電子傳遞并非易事。首先，根據(jù)Marcus 電子轉(zhuǎn)移理論，兩氧化還原電對(duì)之間電子傳遞的動(dòng)力學(xué)特性由以下因素決定9：推動(dòng)力（如電勢(shì)的差異），重組能（定性反映氧化還原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)）和氧化還原中心間的距離。通常，由于氧化還原蛋白質(zhì)的輔基（生物活性基團(tuán)常常為電化學(xué)活性基團(tuán)）被多肽鏈所包裹，其與電極表面的距離較大，因而難于進(jìn)行電子傳遞。第二，氧化還原蛋

14、白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有各向異性，它們的活性中心并不正好位于蛋白的中心，此外蛋白質(zhì)分子表面還呈現(xiàn)電荷分布不均勻性。因此，蛋白質(zhì)在電極表面的取向是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)-電極電子轉(zhuǎn)移的重要因素。蛋白質(zhì)的電化學(xué)研究常常不得不借助于某些具有電化學(xué)活性的媒介體和其他輔助手段來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與電極之間間接的電化學(xué)反應(yīng)。采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ陔姌O表面固定蛋白質(zhì)，是目前蛋白質(zhì)電化學(xué)研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)在電極表面具有良好的取向是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)-電極之間直接電子轉(zhuǎn)移的前提。除了對(duì)電極進(jìn)行表面修飾，是蛋白質(zhì)處于適宜的取向外，另一重要途徑是采用化學(xué)方法或生物學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行人工改造，設(shè)計(jì)和構(gòu)造有利于電子傳遞的新的蛋白質(zhì)體系。2 .l 蛋白質(zhì)在

15、電極表面的固定2 .l .l 蛋白質(zhì)-裸電極 蛋白質(zhì)在金屬電極上的電化學(xué)反應(yīng)通常是不可逆的，但當(dāng)金屬電極經(jīng)一系列預(yù)處理后，可得到準(zhǔn)可逆甚至可逆的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)，如細(xì)胞色素c 在處理過(guò)的金和鉑電極上發(fā)生可逆或準(zhǔn)可逆電子傳遞l0，在經(jīng)拋光和電化學(xué)粗糙化銀電極上也發(fā)生直接電子傳遞ll。實(shí)驗(yàn)表明：蛋白質(zhì)和金屬電極之間能否進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移和蛋白質(zhì)與電極間的化學(xué)微環(huán)境及結(jié)構(gòu)有關(guān)。而電極表面的清潔度直接影響電極表面疏水/親水特性。如金對(duì)有機(jī)污染物具有強(qiáng)烈的親合力，趨向于使表面疏水，清潔的電極表面則顯親水性。電極表面可形成有序的水分子內(nèi)單層和稍無(wú)序的第二單層，水合的電解質(zhì)離子濃縮在水分子內(nèi)單層附近以平衡電極表面電

16、荷，細(xì)胞色素c 的賴氨酸殘基與位于內(nèi)單層吸附的分子間存在著氫鍵，從而形成了電子傳遞的通道。 氧化還原蛋白質(zhì)能在金屬氧化物如摻氟氧化錫、氧化釕、氧化銥、摻錫氧化銦等電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)。這是蛋白質(zhì)與電極界面靜電吸附從而實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溶液的離子強(qiáng)度和pH 對(duì)蛋白質(zhì)電子轉(zhuǎn)移影響很大，因?yàn)榻饘傺趸镫姌O表面的羥基具有兩性：MOH + H+ !MOH2+ 帶正電荷（pH 較低）MOH!MO- + H+ 帶負(fù)電荷（pH 較高）調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度和pH，改變電極的靜電特性，使蛋白質(zhì)的氧化還原活性中心更接近電極表面，依靠靜電吸附作用，蛋白質(zhì)能與電極間進(jìn)行快速的電子轉(zhuǎn)移。所以選擇合適條件，無(wú)

17、論帶正電荷的細(xì)胞色素c 還是帶負(fù)電荷的銅藍(lán)蛋白、紅素氧化蛋白、質(zhì)體藍(lán)素等在氧化物電極表面有較快的電子傳遞速率12。 經(jīng)不同氧化步驟預(yù)處理的碳電極表面存在一系列C - O 功能團(tuán)，如羧基、羰基、酚基和類脂基團(tuán)等。為氧化還原蛋白質(zhì)進(jìn)行直接電化學(xué)反應(yīng)提供良好微環(huán)境，與氧化物電極相似，電極表面的靜電特性以及某些功能團(tuán)的質(zhì)子化或去質(zhì)子化影響蛋白質(zhì)的靜電吸附，從而影響電子轉(zhuǎn)移的速率13。Hiii 等描繪了蛋白質(zhì)與棱面裂解石墨電極表面相互作用的示意圖14，并提出蛋白質(zhì)-電極間的相互作用模式。2 .1 .2 蛋白質(zhì)-促進(jìn)劑-電極 促進(jìn)劑可以用來(lái)修飾電極表面或?qū)﹄姌O進(jìn)行處理，也可加入到溶液中，以加快氧化還原蛋白

18、和酶與電極之間的電子轉(zhuǎn)移。它在所研究的電位范圍內(nèi)本身是非電活性的。1987 年，Hiii 等發(fā)現(xiàn)4，4*-聯(lián)吡啶能促進(jìn)細(xì)胞色素c 在金電極上的電子轉(zhuǎn)移15，此后還發(fā)現(xiàn)了一大批細(xì)胞色素c 在金電極上電化學(xué)反應(yīng)具有促進(jìn)作用的修飾劑，并提出促進(jìn)劑必須具有X-Y 結(jié)構(gòu)且含有雙能團(tuán)的模型16。這里X 是能吸咐于金屬電極表面的表面活性功能團(tuán)，Y 是陰離子或堿性基團(tuán)，它與細(xì)胞色素c 分子分布于一側(cè)，與血紅素裂隙附近質(zhì)子化的賴氨酸殘基發(fā)生鍵合作用，形成了離子鍵、鹽橋或氫鍵，而這種鍵合被認(rèn)為是進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移的先決條件。近來(lái)研究表明17，只具有單一功能團(tuán)的有機(jī)小分子如吡啶、噻吩、咔唑等對(duì)蛋白質(zhì)的氧化還原有較強(qiáng)的促進(jìn)

19、作用。此外，人們還發(fā)現(xiàn)生物大分子、無(wú)機(jī)物、聚合物以及生物小分子如氨基酸、糖分子等對(duì)氧化還原蛋白質(zhì)的電化學(xué)反應(yīng)也有促進(jìn)作用。這些結(jié)果突破了Hiii 等提出的模型。這說(shuō)明促進(jìn)劑分子的結(jié)構(gòu)不是產(chǎn)生電催化的唯一因素，還要考慮促進(jìn)劑分子在電極表面吸附能力的強(qiáng)弱，以及促進(jìn)劑分子與生物大分子之間的相互作用方式。關(guān)于促進(jìn)劑分子的結(jié)構(gòu)及其在電極表面吸附能力強(qiáng)弱與電子轉(zhuǎn)移的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。2 .1 .3 蛋白質(zhì)-媒介體-電極 媒介體在所研究的電位范圍內(nèi)是具有電活性的。通過(guò)加到溶液中或修飾在電極表面，在生物大分子與電極之間起電子傳遞橋梁作用，也就是催化生物大分子氧化還原的催化體。1971 年，Kuwana 開創(chuàng)

20、性地在染料修飾石墨電極中得到血紅蛋白的催化反應(yīng)18、為研究氧化還原蛋白質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移提供了有效的研究途徑。在此基礎(chǔ)上科學(xué)家做了大量工作，發(fā)現(xiàn)了一批能加速蛋白質(zhì)與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的媒介體，而且大多數(shù)是有機(jī)染料。就能加速蛋白質(zhì)電子轉(zhuǎn)移染料修飾電極來(lái)說(shuō)，有以下特點(diǎn)：1 . 光譜電化學(xué)方法的應(yīng)用19。大多數(shù)氧化還原蛋白質(zhì)都具有靈敏的光譜吸收信號(hào)，在染料修飾電極上，通過(guò)對(duì)染料分子、蛋白質(zhì)分子特征光譜的同時(shí)監(jiān)測(cè)，可更深入地揭示染料分子對(duì)蛋白質(zhì)的作用機(jī)制及蛋白質(zhì)氧化還原反應(yīng)機(jī)理，而且光譜電化學(xué)方法不受光電電流和殘余電流的影響，可方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)氧化還原反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)研究；2 . 染料修飾電極應(yīng)用的廣泛

21、性20。!多種染料分子修飾電極能促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的氧化還原如亞甲藍(lán)、亞甲綠、甲苯胺藍(lán)、燦爛甲酚煉、亮甲基藍(lán)、天青A、健那綠、甲基紫精、甲酚固紫等。"同種染料修飾電極可加速多種蛋白質(zhì)分子的氧化還原，如亞甲藍(lán)修飾電極對(duì)肌紅蛋白、血紅蛋白、細(xì)胞色素c 3 種蛋白質(zhì)的氧化和還原過(guò)程均具有加速作用。#基于染料修飾電極對(duì)蛋白質(zhì)中血紅素基團(tuán)還原及蛋白質(zhì)中所含氨基酸殘基氧化的催化作用。染料修飾電極作為流動(dòng)注射分析（FIA）和液相色譜（LC）的電化學(xué)檢測(cè)器，應(yīng)用于氧化還原蛋白質(zhì)的檢測(cè)，克服了蛋白質(zhì)分子在電極上具有不可逆的電化學(xué)反應(yīng)，電位大的缺點(diǎn)，而且檢出限較低。3 . 導(dǎo)電聚合物包埋染料能更快地促進(jìn)蛋白

22、質(zhì)氧化還原反應(yīng)21。如血紅蛋白在亞甲綠、聚吡咯修飾電極上的式量異相電子轉(zhuǎn)移速率常分別為1 .75 X 10 - 5 cm/S 和11 .8 X 10 - 10 cm/S，在聚吡咯-亞甲綠修飾電極上為8 . 76 X 1O - 5 cm/s，而且克服實(shí)驗(yàn)過(guò)程中部分染料分子會(huì)從電極表面脫落，從而導(dǎo)致電極活性降低的缺點(diǎn)，具有較高的穩(wěn)定性。4 . 雙媒介體染料修飾電極克服單一染料修飾電極只能使蛋白質(zhì)氧化或還原的弊端，既可加速蛋白質(zhì)的氧化過(guò)程也可加速其還原過(guò)程22。2 .1 .4 蛋白質(zhì)-納米粒子-電極 納米粒子具有比表面積大、催化活性高、親和力強(qiáng)的特點(diǎn)，用于固定生物組分備受關(guān)注。用納米憎水Au 顆粒、

23、親水Au顆粒、憎水SiO2顆粒以及Au 和SiO2顆?；旌吓c聚乙烯醇縮丁醛（PVB）構(gòu)成復(fù)合固定酶膜基質(zhì)，用溶膠/凝膠法固定GOD 制備納米增強(qiáng)型葡萄糖傳感器。實(shí)驗(yàn)表明，納米顆?？梢源蠓忍岣吖潭ɑ傅拇呋钚?，認(rèn)為是通過(guò)Au 顆粒的作用，葡萄糖氧化酶的輔基FAD 與鉑電極間直接進(jìn)行電子傳遞23。將納米金自組裝至三維硅凝膠中，可實(shí)現(xiàn)HRP 的直接電化學(xué)反應(yīng)，構(gòu)筑第三代電化學(xué)生物傳感器24。納米TiO2膜電極不僅具有生物親和性和相容性，而且能加快氧化還原蛋白質(zhì)的電子傳遞速度25。利用Hb/TiO2電極的光電特性，可研究蛋白質(zhì)光氧化還原現(xiàn)象，檢測(cè)水溶液中微量的一氧化碳26。在磁性納米粒子表面修飾媒

24、介體，可作為酶與電極之間電子傳遞的開關(guān)，制備由磁場(chǎng)控制的生物電化學(xué)傳感器27。碳納米管對(duì)Cyt c 的電子傳遞也有加速作用28。隨著納米粒子與蛋白質(zhì)作用機(jī)理研究的深入，各種新型納米粒子的制備，特別是量子點(diǎn)的引入及制備微型傳感器和芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的發(fā)展，可望從分子水平動(dòng)態(tài)研究生物體系，揭示其內(nèi)在規(guī)律。2 .1 .5 蛋白質(zhì)-DNA-電極DNA 和氧化還原 蛋白質(zhì)同存在于線粒體內(nèi)，研究氧化還原蛋白質(zhì)與DNA 的作用，對(duì)理解生物呼吸鏈能量轉(zhuǎn)換具有重要的意義。DNA 在金電極和碳電極表面能形成穩(wěn)定的薄膜，可用于基因雜交指示劑的選擇和DNA損傷檢測(cè)29，3O。RusIing 等采用逐層組裝的方法，將DNA

25、-mb 和DNA-Cyt P45O 固定在電極表面，得到Fe（!）/Fe（"）電對(duì)的可逆電化學(xué)反應(yīng)，應(yīng)用于環(huán)境污染物的檢測(cè)與轉(zhuǎn)化31。用DNA 固定HRP于石墨電極表面，加快了HRP 與電極的直接電子傳遞速度，用于H2O2的檢測(cè)32。表面活性劑膜、雙層類脂膜和DNA 膜具有獨(dú)特的類生物結(jié)構(gòu)和生物相容性，為電化學(xué)模擬氧化還原蛋白質(zhì)的生物功能創(chuàng)造了條件。尋找適當(dāng)?shù)妮d體和基體電極以形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)膜層應(yīng)該是今后努力的方向。2 .1 .6 蛋白質(zhì)-仿生界面-電極 生物膜主要由蛋白質(zhì)和磷脂組成。磷脂分子結(jié)構(gòu)的兩性特征決定了它們?cè)谏锬ぶ械碾p分子層排列及其與各種蛋白質(zhì)相結(jié)合的特性。表面活性劑具有

26、類磷脂兩性結(jié)構(gòu)，它們?cè)陔姌O表面能形成穩(wěn)定的膜33，并能促進(jìn)氧化還原蛋白質(zhì)與電極之間的電子傳遞34。制備蛋白質(zhì)-表面活性劑修飾電極有兩種方法：1 .在電極表面蘸涂含表面活性劑的氯仿溶液，氯仿?lián)]發(fā)后，形成表面活性劑膜電極，該電極可從溶液中吸附蛋白質(zhì)；2 . 將蛋白質(zhì)與表面活性劑的微囊分散混合，取混合液蘸涂至電極表面，空氣干燥?；w電極以棱面裂解石墨、金、鉑電極為佳，而膜在摻錫氧化銦和銀電極上的穩(wěn)定性較差。在表面活性劑膜中，蛋白質(zhì)保持著原始構(gòu)象不變，與電極之間的電子傳遞速度大大加快。肌紅蛋白（mb）35，36、血紅蛋白（Hb）37、細(xì)胞色素P45O（CytP45O）38、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）39

27、、過(guò)氧化氫氧化酶4O，41、細(xì)胞色素c 氧化酶42等含有血紅素的蛋白質(zhì)，都可實(shí)現(xiàn)Fe（!）/Fe（"）電對(duì)與電極之間直接、可逆、快速的電子傳遞過(guò)程。在表面活性劑膜中，蛋白質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性43。表面活性劑的結(jié)構(gòu)和所帶凈電荷對(duì)蛋白質(zhì)在電極表面的取向有一定影響44。 雙層類脂膜在結(jié)構(gòu)上與天然生物膜相似，能將生物分子嵌入其中同時(shí)保持其生物活性。利用各種固相載體支撐的自組裝雙層類脂膜或混合層類脂膜的高度有序且穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)45，作為仿生膜，可以模擬氧化還原蛋白質(zhì)生物代謝過(guò)程的特性46。將細(xì)胞色素c 氧化酶固定在雙層類脂膜中，與金電極之間直接傳遞電子，且能氧化溶液中的Cyt cC47，4

28、8將HRP 固定于鹽橋支撐的雙層類脂膜中，實(shí)現(xiàn)了直接電化學(xué)反應(yīng)及對(duì)H2O2的催化還原49。2 .2 蛋白質(zhì)的分子改造 蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行模擬，了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系5O，51。WiIIner 等將含有兩個(gè)血紅素輔基的4 肽螺旋束共價(jià)鍵合至自組裝膜修飾金電極表面。兩個(gè)血紅素輔基由于與電極表面的距離不同，其氧化還原電勢(shì)也不同，分別為- O143 V 和- O136 V（ !" SCE）。這一性質(zhì)可應(yīng)用于制備生物電子整流器。另外，這種模擬蛋白質(zhì)可以作為硝酸根還原酶或CO（"）原卟啉重組血紅蛋白的電子媒介體，催化還原NO3- 或催化2-炔-丁二酸加氫52。 采用分子生

29、物學(xué)方法，將氧化還原性蛋白質(zhì)模塊（如電子傳遞模塊）與功能性蛋白質(zhì)模塊（如生物催化模塊）融合，顯著改善蛋白質(zhì)的應(yīng)用特性，形成新型多功能蛋白質(zhì)。GiIardi 等使用黃素蛋白作為電子傳遞蛋白模塊，以Cyt c555 和CytP450cam 作為催化蛋白模塊，通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)，用肽鏈聯(lián)接一種蛋白的C 末端和另一種蛋白的N 末端或者引入雙硫鍵橋，使兩種蛋白融合。實(shí)驗(yàn)表明，黃素蛋白的引入，加速了Cyt c555 和Cyt P450 BM 3 與電極的電子傳遞速度c555 和CytP450 BM 3 與電極的電子傳遞速度53。 定點(diǎn)突變技術(shù)可以有目的地對(duì)蛋白質(zhì)中的少數(shù)氨基酸殘基進(jìn)行替換，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性

30、能基本維持不變。HRP 的表面存在8 個(gè)糖基化位點(diǎn)，其碳水化合物的含量l8%。這些碳水化合物有如一道屏障，阻礙了酶的氧化還原中心與電極的電子傳遞。Gorton 等利用基因工程手段，制得不含糖基化位點(diǎn)的HRP 突變體；另外在其基礎(chǔ)上，制得分子表面含有6 個(gè)組氨酸分子的突變體，由于組氨酸與金較強(qiáng)的親和力，使HRP 定向固定于金電極表面。這兩種突變體的電子傳遞速度由l S - l 分別增加到4 .7 S - l 和7 .5 S - l54。利用組氨酸與金屬離子較強(qiáng)的親和力定向固定蛋白質(zhì)的原理也運(yùn)用到鐵蛋白：NADP+ 還原酶的突變體55。將肌紅蛋白中的組氨酸（H64）用甘氨酸或亮氨酸取代，其直接電子

31、傳遞速度大大增加56。 HiII 等將Cyt P450cam 分子表面的5 個(gè)半胱氨酸全部突變?yōu)楸彼?，而將與電子傳遞相關(guān)聯(lián)的4個(gè)氨基酸殘基分別獨(dú)立地突變?yōu)榘腚装彼?。半胱氨酸的SH 與金電極表面鍵合，定向固定蛋白質(zhì)，使電子傳遞通道與電極表面接近57。他們研究了定點(diǎn)突變蛋白質(zhì)（Cyt P450cam、天青蛋白和Cyt c）的電化學(xué)特性，用掃描探針顯微鏡觀察電極表面蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形貌58。應(yīng)用化學(xué)方法和生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)和改造蛋白質(zhì)分子，不僅對(duì)于理解生物體內(nèi)電子傳遞機(jī)理、生物代謝過(guò)程，而且對(duì)于發(fā)展生物傳感器均具有重要意義。 氧化還原蛋白質(zhì)的電化學(xué)研究具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景，值得重視的研究方向?yàn)椋?/p>

32、（l）深入研究氧化還原蛋白質(zhì)的電子傳遞過(guò)程，弄清反應(yīng)機(jī)理；（2）通過(guò)基因工程、蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)化學(xué)修飾等技術(shù)，合成新的酶，尋找新的酶促體系；（3）發(fā)掘酶的催化活性，提高酶促反應(yīng)的效率；（4）人工酶模擬研究，發(fā)展特異、高效、穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的電催化劑；（5）制備壽命長(zhǎng)、價(jià)格低、使用方便的電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?；開發(fā)生物能源電池、計(jì)算機(jī)生物芯片。3、免疫傳感器 免疫傳感器是一種以抗體-抗原反應(yīng)為基礎(chǔ)的生物傳感器?；谶@類反應(yīng)的高度親和性及專一性，免疫傳感器具有極高的選擇性和靈敏度，并且使用簡(jiǎn)便，成本低。目前它的應(yīng)用已涉及到臨床醫(yī)學(xué)與生物檢測(cè)技術(shù)、食品工業(yè)、環(huán)境檢測(cè)等廣泛領(lǐng)域。3 .l 免疫傳感器的定義

33、、分類和工作原理 將高靈敏度的傳感器技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，用以監(jiān)測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的生物傳感器稱作免疫傳感器59。免疫傳感器分為兩類：非標(biāo)識(shí)免疫傳感器；標(biāo)識(shí)免疫傳感器。將抗體固定在傳感器表面上，在其上進(jìn)行抗原抗體復(fù)合體的形成，測(cè)定這時(shí)產(chǎn)生的電位變化就可直接檢測(cè)抗原的，稱之為非標(biāo)識(shí)免疫傳感器。比較適宜用于血型判定及梅毒血清診斷等半定量測(cè)定場(chǎng)合。而在標(biāo)識(shí)免疫傳感器中由于使用酶等標(biāo)識(shí)劑，使免疫傳感器靈敏度大大提高。比較適宜用于類似微量荷爾蒙的測(cè)定。圖3 和圖4 為非標(biāo)識(shí)和標(biāo)識(shí)型免疫傳感器的基本設(shè)計(jì)，圖中固定化載體上的抗體接觸到含有抗原的溶液時(shí)，在載體表面上形成抗原抗體復(fù)合體。形成復(fù)合體前后的物

34、理變化，有如下4種形式：（l）膜電位；（2）電極電位；（3）壓電特性；（4）光學(xué)特性。 圖3 非標(biāo)識(shí)免疫傳感器 Fig .3 Non-labeled immunosensors 圖4 標(biāo)識(shí)免疫傳感器 Fig .4 Lobeled immunosensors 免疫傳感器的工作原理和傳統(tǒng)的免疫測(cè)試法相似，都屬于固相免疫測(cè)試法，即把抗原或抗體固定在固相支持物表面，來(lái)檢測(cè)樣品中的抗體或抗原。不同的是，傳統(tǒng)免疫測(cè)試法的輸出結(jié)果只能定性或半定量地判斷，且一般不能對(duì)整個(gè)免疫反應(yīng)過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。而免疫傳感器具有能將輸出結(jié)果數(shù)字化地精密換能器，不但能達(dá)到定量檢測(cè)的效果，而且由于傳感與換能同步進(jìn)行，能

35、實(shí)時(shí)檢測(cè)到傳感器表面的抗原抗體反應(yīng)，有利于對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。因此，它可促使免疫診斷方法向定量化、操作自動(dòng)化方向發(fā)展。3 .2 基于電化學(xué)換能器的免疫傳感器 抗體與目標(biāo)抗原之間的識(shí)別反應(yīng)是免疫傳感器的基礎(chǔ)?？贵w抗原反應(yīng)的親合常數(shù)也就決定了免疫傳感器的專一性。但是，太大的親合常數(shù)也會(huì)使免疫傳感器的識(shí)別反應(yīng)失去可逆性。此外，如何將識(shí)別反應(yīng)成功地轉(zhuǎn)換為可紀(jì)錄的物理、化學(xué)信號(hào)也是免疫傳感器的決定因素，這一過(guò)程被稱為換能過(guò)程，完成這一過(guò)程的儀器被稱為換能器。典型的換能器有電化學(xué)、光學(xué)、聲學(xué)和半導(dǎo)體的。 傳統(tǒng)的電流法和電位法都已成功地應(yīng)用于免疫傳感器中。最近，Deasy 等報(bào)道了一種基于電流分析的免

36、疫傳感器，用于測(cè)定7-羥基香豆素（傘形酮）60。這種傳感器巧妙地使用了辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的7-羥基香豆素抗體。具體過(guò)程如下：將與甲狀腺球蛋白結(jié)合的7-羥基香豆素抗原用全氟磺酸膜（Nafion fiim）固定于玻碳電極表面后，將電極浸入含有7-羥基香豆素抗體和游離7-羥基香豆素抗原的溶液中，通過(guò)測(cè)定7 - 羥基香豆素抗體在兩種形態(tài)的7-羥基香豆素抗原之間的競(jìng)爭(zhēng)分配就可定量分析游離的7 - 羥基香豆素抗原。確定抗體分配的手段是在溶液中加入足量過(guò)氧化氫。隨抗體附著在電極上的那部分辣根過(guò)氧化酶就會(huì)氧化過(guò)氧化氫，產(chǎn)生與其數(shù)量成正比的陰極電流。近來(lái)發(fā)展的電流型免疫傳感器有用于測(cè)定膽堿酶的，還有利用含導(dǎo)電聚合

37、物的抗體測(cè)定血清蛋白的。 電位法也有應(yīng)用的實(shí)例。1975 年Janata61首次描述了用來(lái)監(jiān)測(cè)免疫化學(xué)反應(yīng)的電位測(cè)量式換能器。這種免疫測(cè)試法的原理是先通過(guò)聚氯乙烯膜把抗體固定在金屬電極上，然后用相應(yīng)的抗原與之特異性結(jié)合，抗體膜中的離子遷移率隨之發(fā)生變化，從而使電極上的膜電位也相應(yīng)發(fā)生改變。膜電位的變化值與待測(cè)物濃度之間存在對(duì)數(shù)關(guān)系，因此根據(jù)電位變化值進(jìn)行換算，即可求出待測(cè)物濃度。1990 年Biackburm 等62將一種可選擇性催化乙酸苯酯水解的單克隆抗體固定在微型pH 電極表面，通過(guò)測(cè)定水解過(guò)程中所產(chǎn)生的質(zhì)子間接地選擇測(cè)定乙酸苯酯。 導(dǎo)電率測(cè)量法可大量用于化學(xué)系統(tǒng)中，因?yàn)樵S多化學(xué)反應(yīng)都產(chǎn)生

38、或消耗多種離子體，從而改變?nèi)芤旱目倢?dǎo)電率。通常是將一種酶固定在某種貴重金屬電極上（如金、銀、銅、鎳、鉻），在電場(chǎng)作用下測(cè)量待測(cè)物溶液中導(dǎo)電率的變化。例如，當(dāng)尿被尿激酶催化生成離子產(chǎn)物NH4+ 時(shí)，后者引起溶液導(dǎo)電率增加，其增加值與尿濃度成正比。1992 年Sandberg63描述了一種以聚合物為基礎(chǔ)的導(dǎo)電率測(cè)量式免疫傳感器，它與常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理基本相同，只是后者的結(jié)果是通過(guò)顏色來(lái)顯示，而它則是將結(jié)果轉(zhuǎn)換成電信號(hào)（即導(dǎo)電率）。3 .3 抗體和抗原的固定 免疫傳感器制作過(guò)程中一個(gè)重要的步驟是將抗體或抗原固定在傳感器表面，這樣才能檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。然而傳感器表面構(gòu)造不一，

39、有金屬（如金、銀、銅、鉑、鉛、鋰、鈦、鎳或鉻）、碳、玻璃、石英等，它們與抗原或抗體的結(jié)合特性都不同，這就需要不同的固定方法，使得吸附好了的抗原或抗體不在反應(yīng)中脫落。固定方法可分為直接法和間接法64。前者是用含抗體或抗原的溶液涂覆或浸泡電極，通過(guò)物理或化學(xué)吸附作用使其表面生成具有識(shí)別功能的生物膜。該法簡(jiǎn)單、快速，但易阻礙特異性反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致非特異性吸附和脫落。后者則采用中間連接層（如戊二醛）來(lái)連接傳感表面和抗體或抗原，最常用的是聚乙烯亞胺（PEI）法、硅烷化（A PTE）法、牛血清白蛋白（BAS）和葡萄球菌A 蛋白（SPA ）法，其中SPA 法效果最好65，66，但它只限于固定抗體。另外，還有

40、聚合膜連接法、生物素-親和素體系、自組裝技術(shù)和LB 膜技術(shù)等。間接法提高了固定效率、固定化層的適應(yīng)性和反應(yīng)靈敏度。3 .4 免疫傳感器的發(fā)展趨勢(shì) 免疫傳感器相對(duì)于一般免疫檢測(cè)方法的主要優(yōu)勢(shì)在于：它能彌補(bǔ)目前常規(guī)免疫檢測(cè)方法不能進(jìn)行定量測(cè)定的缺點(diǎn)。除此之外，它還能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗原抗體反應(yīng)，不需分離步驟，即在抗原抗體反應(yīng)同時(shí)就把反應(yīng)信號(hào)連續(xù)地記錄下來(lái)，有利于抗原抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)分析。免疫傳感器相對(duì)于其他傳感器的優(yōu)勢(shì)則是：由于抗原與抗體的結(jié)合具有很高的特異性，從而減少了非特異性干擾，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，且檢測(cè)范圍也很寬?？傊?，集生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)及醫(yī)學(xué)為一體的免疫傳感技術(shù)其發(fā)展?jié)摿薮?，它不但將推?dòng)傳

41、統(tǒng)免疫測(cè)試法發(fā)展，而且會(huì)影響臨床和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域里的實(shí)用性研究。 免疫傳感器的發(fā)展趨勢(shì)主要有如下幾點(diǎn)：（1）標(biāo)記物的種類層出不窮，從酶和熒光試劑發(fā)展成膠乳顆粒、膠體金、磁性顆粒和金屬離子等；（2）向微型化、商品化方向發(fā)展，廉價(jià)的一次性傳感表面大有潛力可挖；（3）與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，向智能型、操作自動(dòng)化方向發(fā)展；（4）應(yīng)用范圍日漸擴(kuò)大，已深入到環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生等工業(yè)和臨床診斷等領(lǐng)域；（5）繼續(xù)提高其靈敏度、穩(wěn)定性和再生性，使其更簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確。隨著分子生物學(xué)、材料學(xué)、微電子技術(shù)和光纖化學(xué)等高科技的迅速發(fā)展，免疫傳感器會(huì)逐步由小規(guī)模制作轉(zhuǎn)變?yōu)榇笠?guī)模批量生產(chǎn)，并在大氣監(jiān)測(cè)、地質(zhì)勘探、通訊、軍事、交通管

42、理和汽車工業(yè)等方面起作用。4、展望利用電化學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代分析手段相結(jié)合來(lái)研究電子傳遞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，在近10多年來(lái)已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，獲得了一些極為重要的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。這為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)生物體系的電子傳遞反應(yīng)機(jī)理以及能量轉(zhuǎn)換奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，關(guān)于氧化還原酶的直接電化學(xué)研究也有許多報(bào)道，但研究工作尚處起步階段。有越來(lái)越多的研究組開始致力于這方面的研究。隨著對(duì)氧化還原生物大分子直接電化學(xué)反應(yīng)認(rèn)識(shí)的加深，對(duì)于分析生物體內(nèi)的長(zhǎng)程電子傳遞反應(yīng)機(jī)理、蛋白質(zhì)分子間的相互識(shí)別、第三代生物傳感器的研制等具有重大意義，同時(shí)，通過(guò)對(duì)功能化電極性能的不斷完善，有望研制出某一功能化電極只對(duì)生物體系中被測(cè)物

43、種有響應(yīng)，從而有效防止生物分子在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)生變性而使生物活性喪失，這無(wú)疑對(duì)于快速分析檢測(cè)生物體系中有效成份的含量、提高酶活性將有很大益處，功能化電極性能的進(jìn)一步完善，還會(huì)大大推動(dòng)新型、實(shí)用生物傳感器的研制，促進(jìn)各種微型化、智能化分子器件的開發(fā)和利用。 參考文獻(xiàn)1 HiII H A 0. Pure App Chem，1987，59：7432 Bond A M. AnaI Proc，1993，30：2183 Fraser F，HiII A 0 H，NichoIas J W. Acc Chem Res，1988，21：4074 程瓊，蔡麗玲. 嘉興高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，1996，12（2）：405 池

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