《酶的組織化學》ppt課件

1、酶組織化學反響主要經過兩步：酶組織化學反響主要經過兩步：1.1.酶促反響，即酶催化細胞內相應底物，酶促反響，即酶催化細胞內相應底物，生成無色的初級反響底物。生成無色的初級反響底物。2.2.顯色反響，捕獲和偶聯(lián)。將初級反響產顯色反響，捕獲和偶聯(lián)。將初級反響產物與捕獲劑反響，經過一步或兩步反響物與捕獲劑反響，經過一步或兩步反響生成有色的最終反響產物，或將初級反生成有色的最終反響產物，或將初級反響產物與一些偶聯(lián)劑發(fā)生偶聯(lián)反響生成響產物與一些偶聯(lián)劑發(fā)生偶聯(lián)反響生成有色沉淀，顯示酶活性部位。有色沉淀，顯示酶活性部位。遵照原那么：遵照原那么：1.1.盡量堅持組織細胞生活時的形狀和構造。盡量堅持組織細胞生活

2、時的形狀和構造。2.2.盡量堅持組織細胞生活時酶及其他成分的盡量堅持組織細胞生活時酶及其他成分的活性，不影響酶的活性和分布。活性，不影響酶的活性和分布。3. 3. 底物和輔助劑必需迅速而同步地浸透到組底物和輔助劑必需迅速而同步地浸透到組織和細胞中去。織和細胞中去。4. 4. 底物最好只能被一種酶催化分解。底物最好只能被一種酶催化分解。 5. 盡量減少初級反響產物在組織細胞內的彌散程度。 6. 反響產生的最終反響產物應是不溶于水的有色而穩(wěn)定的物質，堆積于原位，其顏色深度與物質含量或酶活性應有一定量效關系。 7. 由于酶的活性可遭到很多要素影響，因此在酶生化方面有許多要求，以保證充分顯示酶的活性：

3、 最適孵育溫度25-37。C 最適pH值 最適底物及輔助物濃度 激活劑與抑制劑 酶的組織化學方法根本原理酶的組織化學方法根本原理沉淀反響法沉淀反響法 1. 1. 金屬鹽法金屬陽離子沉淀金屬鹽法金屬陽離子沉淀反響由于酶的活性可使孵育底反響由于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基團可與金屬物分解，其生成的基團可與金屬離子結合而產生沉淀，最后在酶離子結合而產生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金的活性部位生成不溶性的有色金屬鹽沉淀。如鈣屬鹽沉淀。如鈣- -鈷法顯示堿性鈷法顯示堿性磷酸酶。磷酸酶。 2. 偶聯(lián)偶氮色素法 由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解產物可與重氮鹽結合，引起偶聯(lián)偶氮

4、反響，構成不溶性的偶氮色素，以證明酶的活性部位。 電子傳送法電子傳送法 根據(jù)氧化復原的原理顯示氧化酶根據(jù)氧化復原的原理顯示氧化酶和脫氫酶。脫氫酶的作用使底物脫氫氧和脫氫酶。脫氫酶的作用使底物脫氫氧化，脫下的氫可與作為受氫體的無色四化，脫下的氫可與作為受氫體的無色四唑鹽或雙四唑鹽結合，后者被復原成甲唑鹽或雙四唑鹽結合，后者被復原成甲或雙甲潛紫藍色沉淀。如琥珀酸脫氫酶或雙甲潛紫藍色沉淀。如琥珀酸脫氫酶顯示方法屬于此法。顯示方法屬于此法。 水解酶類 水解酶催化以下反響 ： AB+H2O AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。 堿性磷酸酶鈣-鈷顯示法 原理：AKP在有激活劑Mg+存在和pH9

5、.4時，將磷酸鹽底物分解產生磷酸根離子，磷酸根離子被孵育液中高濃度的鈣鹽所捕獲，在有酶活性存在處生成磷酸鈣沉淀，再參與硝酸鈷，用Co2+置換 Ca2+ ，從而生成磷酸鈷沉淀，因其無色需經過硫化銨處置構成黑色硫化鈷顆粒沉淀，顯示酶活性所在部位，此沉淀與AKP含量成正比。 試劑配制： 1. 作用液 2%巴比妥鈉 5ml；3%-甘油磷酸鈉 5 ml；2%無水氯化鈣 10ml；0.1%硫酸鎂 0.5 ml；蒸餾水 2.5 ml。 此液pH為9.4，如不到9.4，可用0.1N NaOH調理。 2. 2% 硝酸鈷 3. 1-2% 硫化銨 現(xiàn)配 操作步驟 1. 新穎組織恒冷切片，切片直接入孵育液37。C 1

6、0-40 分鐘。 2. 流水洗2分鐘。 3. 2%硝酸鈷5分鐘。 4. 蒸餾水洗。 5. 硫化銨30秒-1分鐘。 6. 蒸餾水洗。 7. 甘油明膠封固。 堿性磷酸酶堿性磷酸酶結果：結果： AKPAKP所在部位呈所在部位呈黑色硫化鈷沉黑色硫化鈷沉淀。淀。 6-磷酸磷酸葡萄糖酶葡萄糖酶結果：結果：酶活性處酶活性處為棕黃色為棕黃色硫化鉛沉硫化鉛沉淀，細胞淀，細胞核為陰性核為陰性反響。反響。 對照 去底物對照，作用液中以蒸餾水替代-甘油磷酸鈉，其他步驟同上，酶反響陰性。 氧化復原酶氧化復原酶催化氧化復原反響的酶。催化氧化復原反響的酶。 琥珀酸脫氫酶SDH硝基四唑鹽法 原理：琥珀酸脫氫酶SDH作用于底物

7、琥珀酸鈉，脫下氫，以無色的硝基四唑鹽為受氫體，后者獲氫后被復原為不溶于水的有色甲潛，原位堆積于酶活性部位。 試劑配制試劑配制 0.2M0.2M磷酸緩沖液磷酸緩沖液pH7.6 5mlpH7.6 5ml1 1A A液液 0.2M0.2M琥珀酸鈉琥珀酸鈉 5ml5ml B B液液 0.1%0.1%1mg/ml1mg/ml硝基四唑鹽硝基四唑鹽Nitro-BTNitro-BT 10ml10ml 臨用前將兩液等量混合，調整臨用前將兩液等量混合，調整pHpH至至7.67.6。 操作步驟： 1. 新穎組織恒冷切片，切片直接入孵育液37。C 5-40分鐘。 2. 蒸餾水洗。 3. 甘油明膠封固。 琥珀酸脫氫酶 結果： 酶活性部位為紫藍色顆粒沉淀。 對照 另配一孵育液，以等量的蒸餾水替代0.2M琥珀酸鈉液，酶活性部位