遞歸漸進光譜投影比較中藥材鐵線蓮色譜指紋特征△解析

1、遞歸漸進光譜投影比較中藥材鐵線蓮色譜指紋特征【摘要】運用遞歸漸進光譜投影法，探索中藥材東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮石油 醚提取物的色譜指紋特征化學(xué)成分的異同。指紋特征數(shù)據(jù)由高效液相色譜法獲 得，流動相為乙腈-1%0磷酸水溶液梯度洗脫，流速1.0 ml/min，柱溫20 C, 光譜記錄范圍為200400 nm。經(jīng)比較，東北鐵線蓮和棉團鐵線蓮的色譜指紋 特征中，至少分別有8和6種單獨的化學(xué)成分存在，兩者的共有的化學(xué)成分有 14種。【關(guān)鍵詞】遞歸漸進光譜投影法；東北鐵線蓮；棉團鐵線蓮；指紋特征借助化學(xué)計量學(xué)方法分析色譜光譜二維數(shù)據(jù)中化學(xué)成分的異同，是中藥 指紋圖譜研究的重要內(nèi)容，已有光譜相關(guān)色譜、窗口目標(biāo)

2、檢驗因子分析、交替 移動窗口因子分析等方法成功用于多種中藥化學(xué)成分比較分析13。毛莨科植物東北鐵線蓮(Clematis manshurica Rupr )和棉團鐵線蓮(Clematis hex-apetala Pall)的干燥根及根莖被收載在中國藥典一部中的威靈仙藥材項下4，近年來發(fā)現(xiàn)具有多種藥理作用5。中藥威靈仙的指紋圖譜研究， 現(xiàn)僅涉及其揮發(fā)油部分6,揭示威靈仙內(nèi)在化學(xué)成分本質(zhì)的差異，對相關(guān)的 藥學(xué)深入研究與臨床使用有重要的意義。遞歸漸進光譜投影是新近提出的一種 化學(xué)計量學(xué)多元分辨方法，可用于二維色譜數(shù)據(jù)重疊峰濃度窗口的確認(rèn)7。本研究將遞歸漸進光譜投影法用于不同色譜指紋特征的化學(xué)成分的異同

3、的分 析，比較東北鐵線蓮和棉團鐵線蓮石油醚提取物的指紋圖譜HPLC-DA二維數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)東北鐵線蓮和棉團鐵線蓮石油醚提取部分中共有的化學(xué)成分有14種,兩者單獨的化學(xué)成分分別有8種和6種，東北鐵線蓮中較棉團鐵線蓮含有較多 的齊墩果酸。實驗結(jié)果為進步確定兩種藥材石油醚提取物中的化學(xué)成分及相關(guān) 的藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。1方法原理設(shè)A和B分別為經(jīng)色譜-光譜聯(lián)用采集的兩種中藥樣品的色譜指紋圖譜的數(shù) 據(jù)矩陣，矩陣的大小均為 M XN階，它們行的方向表征了色譜的流出信息(M 個流出時間點)，列的方向表征了光譜信息(N個吸收波長)。選擇A中某一 指紋特征峰的測定數(shù)據(jù)矩陣片斷X,用漸近因子分析方法分別前向計算和反向計

4、算獲得其秩圖8,根據(jù)秩圖給出的組分?jǐn)?shù) m在A中設(shè)定m個前向和反向 信息區(qū)。從第一信息區(qū)，選取一列數(shù)據(jù)作為代表性光譜si ，按設(shè)定的窗口尺寸w,從樣品B中數(shù)據(jù)矩陣片斷丫自色譜起始時間取w行子矩陣丫1 ,計算投影 殘差r1 1 : r1 1 =s1 T (I-Y1 丫1 +)si ( 1)其中I為N階單位方陣，“T”表示矢量的轉(zhuǎn)置，“ +”表示矩陣的廣義逆；移動1個色譜時間點窗口，計 算投影殘差r'2 ;不斷移動窗口，運算至丫的色譜終點，得一系列投影殘差 r11 ，r1 2，r1 i ，r1 n 。由第二信息區(qū)，選取代表性光譜 s2 ，對丫計算一系列投影殘差r2 i =s2 T (I-Y2

5、 Y2 +) s2。其中矩陣丫2由樣品數(shù)據(jù)丫子矩陣丫1和光譜s1構(gòu)成:丫2 = Y1，s1 ( 2)對每一信息區(qū) j，選取代表性光譜sj，按Yj = Y1，sj-1 計算一系列投影殘差rj i =sj T (I-Yj Yj +) sj。以得到的m個投影殘差矢量對n個保留時間作圖，判定兩樣品中化學(xué)成分的異同。當(dāng)在某一保留時間i處，樣品B中含有樣品A中的化學(xué)成分，rj i的數(shù)值必將接近于零，反之，在該保留時間點樣品B中缺少樣品A中的化學(xué)成分。同理，以樣品B為基準(zhǔn)進行因子分析，選取代表性光 譜，對樣品A計算投影殘差，可判定A中有無B中的化學(xué)成分。2實驗部分2.1儀器與試劑 高效液相色譜儀:HP110

6、0型，包括Agilent1100四元泵， HP11O0X極管陣列檢測器，HP色譜化學(xué)工作站(美國安捷倫科技公司)。東北 鐵線蓮、棉團鐵線蓮:2005年9月采自伊春市亮子河林區(qū)，按中國藥典2005版一部相關(guān)項下鑒別為藥典規(guī)定的相應(yīng)品種。齊墩果酸對照品(110709-200304)購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈、甲醇為色譜純；無水乙醇、鹽酸與石油醚(6090 C)為分析純。2.2樣品制備2.2.1對照品溶液 取齊墩果酸對照品約10mg精密稱定，置10ml容量瓶 中，加甲醇適量使其溶解，加甲醇至刻度。制成1mg/ml的齊墩果酸對照品溶液。2.2.2供試品溶液 東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮的干燥根和根莖，

7、經(jīng)粉碎后， 分別過5號(180± 7.6卩m藥篩。分別取藥材粉末1g，加乙醇50ml，加熱回 流2h，濾過，濾液濃縮至約20ml，加鹽酸3ml，加熱回流1h，加水10ml，放 冷，加石油醚振搖提取3次，石油醚用量分別為20ml、10ml、10ml，蒸干石油 醚，殘渣用1ml甲醇溶解，經(jīng)0.45卩m油性微孔濾膜過濾，制成東北鐵線蓮及 棉團鐵線蓮的供試品溶液。2.2.3空白溶液 取乙醇50ml，同供試品溶液制備方法，加熱回流提取，石 油醚殘渣加甲醇1ml溶解制得。2.3指紋圖譜獲取2.3.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18 柱(250 mmK 4.0mm ID，5 卩

8、m)，保護柱：Zorbax SB-C18 柱(12.5mmX 4.6mm ID ,5 卩 m);流動相：乙腈（A） -1%。磷酸水溶液（B）作梯度洗脫，Omin, 25%A-75%,保持5min;30min , 85%A-15%,保持 1Omin;45min , 100%A 保持 15min。流速:1.0ml /min;柱溫:20 C;檢測波長與參比波長分別為 210nm與400nm相應(yīng)譜帶寬分 別為4nm與50nm進樣量為20卩l(xiāng)。2.3.2指紋圖譜 取齊墩果酸對照品溶液、空白溶液、東北鐵線蓮及棉團鐵 線蓮供試液，分別按2.3.1項下的色譜條件進行檢測。根據(jù)齊墩果酸對照品色 譜與空白溶液的色

9、譜確定齊墩果酸與空白峰，見圖1a和圖1b。選取兩種鐵線蓮色譜中的齊墩果酸色譜峰為參照物峰，結(jié)合空白色譜峰，按國家藥品監(jiān)督管 理局的中藥注射劑色譜指紋圖譜研究技術(shù)要求（暫行）規(guī)定的檢測方法與相關(guān) 內(nèi)容制備指紋圖譜，結(jié)果分別見圖 2a和2b。2.4數(shù)據(jù)分析在色譜儀上間隔2 nm記錄采集東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮色譜 光譜二維數(shù)據(jù)，并選取各色譜中與參照物峰峰面積比大于2%勺色譜峰作為比較分析的目標(biāo)峰。以棉團鐵線蓮作為被比較的樣品，按方法原理，從東北鐵線蓮 的色譜光譜數(shù)據(jù)中的相應(yīng)信息區(qū)內(nèi)分別選取光譜，計算棉團鐵線蓮的數(shù)據(jù)投影 殘差并繪圖，判定相同的化學(xué)成分是否存在以及在色譜指紋圖譜中的位置。將 東北鐵線蓮

10、作為被比較的樣品，比較計算、判定有無棉團鐵線蓮的化學(xué)成分， 從而完成色譜指紋圖譜化學(xué)成分存在與否的判別。s-齊墩果酸1，2-空白色譜峰圖1齊墩果酸對照品（a）和空白溶液（b）色譜圖（略）圖2東北鐵線蓮（a）與棉團鐵線蓮（b）的色譜指紋圖（略）3結(jié)果與討論表1東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮的化學(xué)成分保留時間（略）3.1兩種鐵線蓮的比較 交替比較計算分析東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮色譜-光譜數(shù)據(jù)，得到兩色譜指紋圖譜中各化學(xué)成分和峰位結(jié)果如表1。由表1可知，東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮分別有 22及20個化學(xué)成分，至少有8個化學(xué)成 分存在于東北鐵線蓮中，而在棉團鐵線蓮色譜指紋圖譜中未發(fā)現(xiàn)，棉團鐵線蓮 至少有6個化學(xué)成分

11、在東北鐵線蓮中未發(fā)現(xiàn)。色譜指紋圖中東北鐵線蓮43.61min與棉團鐵線蓮43.22 min處的色譜峰為齊墩果酸色譜峰。與棉團鐵線蓮比 較，齊墩果酸在東北鐵線蓮中的含量較高。3.2空白溶液色譜峰空白溶液的色譜圖 1b顯示，空白溶液在35.20min與 52.30min處有兩個不可忽略的色譜峰。另由圖 2可知，東北鐵線蓮及棉團鐵線 蓮的色譜在相對應(yīng)的保留時間處，均有一定強度的色譜峰。兩種鐵線蓮色譜光 譜所涉及的空白色譜峰處數(shù)據(jù)秩圖表明，第1與第2個色譜峰的成分?jǐn)?shù)分別為1和2。分別用空白溶液峰1和峰2的光譜，對兩種鐵線蓮涉及的色譜峰處的數(shù) 據(jù)作窗口移動正交投影、計算投影殘差，結(jié)果得到東北鐵線蓮與棉團

12、鐵線蓮在 保留時間35.18min及52.24min處色譜峰的光譜，與空白溶液色譜峰的光譜相 同，可斷定為是由樣品制備的溶劑而引入，而在保留時間東北鐵線蓮與棉團鐵 線蓮52.32、52.54min處重疊色譜峰中有空白溶劑峰 2。3.3化學(xué)成分的比較實驗結(jié)果表明，遞歸漸進光譜投影不僅可用于二維色 譜數(shù)據(jù)重疊峰濃度窗口的確認(rèn)，而且可用于不同色譜指紋特征的化學(xué)成分異同 的比較分析。東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮含有較多的相同化學(xué)成分，這些成分與 威靈仙藥理作用的聯(lián)系，需要深入的相關(guān)藥學(xué)研究加以證實。另外，由于實驗 中色譜特征的光譜數(shù)據(jù)為紫外光譜，僅能在一定的程度上判定不同色譜指紋特征的化學(xué)成分的異同，無法確

13、定化學(xué)成分歸屬。遞歸漸進光譜投影法及本實驗 的色譜條件可供液-質(zhì)的二維數(shù)據(jù)的獲取，以便分析確認(rèn)色譜指紋特征的化學(xué)結(jié) 構(gòu)。東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮色譜指紋特征可用于相關(guān)藥材的質(zhì)量控制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Li BY， Hu Y， Liang YZ ， et al. Spectral correlative chromatogra-phy and its applicati on to an alysis of chromatographic fingerprints of herbal medicines. J Sep Sci，2004， 27:581 588.2 Zeng ZD， Liang YZ ，

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