硬脂酸鎂的微生物限度檢查

1、硬脂酸鎂的微生物限度檢查一、 概述本報(bào)告按USP31中“61-62非滅菌產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查”的規(guī)定，對(duì)硬脂酸美的微生物學(xué)檢查方法學(xué)考察。參照企業(yè)提供標(biāo)準(zhǔn)，通過測(cè)試實(shí)驗(yàn)制定適合于本品的微生物學(xué)檢查的方法。企業(yè)提供標(biāo)準(zhǔn)：總需氣菌數(shù)（TAMC）不得過1000 cfu/g；霉菌及酵母菌總數(shù)（TYMC）不得過500 cfu/g；每1g樣品不得檢出大腸埃希菌；每10g樣品不得檢出沙門氏菌。二、 方法學(xué)1、 培養(yǎng)基及試劑實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基及緩沖液均符合USP規(guī)定。BP：pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液CA：溴化十六烷基三甲銨MCA：麥康凱瓊脂MCB：麥康凱肉湯MSA：甘露醇鹽瓊脂RVS：RV沙門菌增菌肉湯SDA：沙氏

2、葡萄糖瓊脂SDB：沙氏葡萄糖肉湯TSA：大豆胰酪胨瓊脂TSB：大豆胰酪胨肉湯XLD：賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂2、 實(shí)驗(yàn)菌株黑曲霉 ATCC16404枯草芽孢桿菌 ATCC6633，CMCC(B)63501白色念珠菌 ATCC10231，CMCC(F)98001大腸埃希菌 ATCC8739銅綠假單胞菌 ATCC9027霍亂沙門氏菌 ATCC14028金黃色葡萄球菌 ATCC6538，CMCC(B)26003本實(shí)驗(yàn)取用中國臨床醫(yī)學(xué)菌種保存中心（CMCC）的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌。這三株菌也來源于ATCC。實(shí)驗(yàn)用菌株，自種子批啟用傳代不超過5次。黑曲霉為3個(gè)月內(nèi)制得的4保存的孢子懸液，

3、可直接稀釋使用。參照表格2，將其他6株菌分別接種至規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。上述各菌分別以pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍稀釋至大約50-100 cfu/mL的濃度，備用。參照表格2各菌株的生長條件，采用澆碟法測(cè)定稀釋得到的最終菌液濃度。3、 方法學(xué)本部分主要包括培養(yǎng)基特性測(cè)試和方法的適用性考察。3.1 培養(yǎng)基特性測(cè)試按照USP31中“61-62非滅菌產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查”的規(guī)定，與已經(jīng)通過測(cè)試驗(yàn)證的參比培養(yǎng)基（M）相比，當(dāng)微生物限度檢查用培養(yǎng)基（M）符合以下標(biāo)準(zhǔn)，則用于硬脂酸美的微生物學(xué)檢驗(yàn)：a. 固體培養(yǎng)基的促生長能力：與M相比，M的回收率應(yīng)在50%-200%之間。b. 固體培養(yǎng)基指示能力：與M

4、相比，規(guī)定菌株在M的生長特征應(yīng)與之類似。c. 液體培養(yǎng)基促生長能力：與M相比，規(guī)定菌株在M有明顯渾濁。d. 抑制能力：無論是固體培養(yǎng)基或是液體培養(yǎng)基，規(guī)定菌株在其不得生長。對(duì)于固體培養(yǎng)基，通常采用平皿計(jì)數(shù)法(包括澆碟法和表面接種法)來評(píng)價(jià)培養(yǎng)基特性，每次平行測(cè)試兩皿，最后取平均數(shù)為計(jì)算結(jié)果。培養(yǎng)基特性測(cè)試結(jié)果見表格3-表格5。3.2 方法適用性當(dāng)微生物學(xué)檢查方法符合以下要求時(shí)，說明該方法適用該品種：a. 樣品供試液不得抑制測(cè)試菌株的生長。計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試微生物在供試樣品中的回收率不得低于接種量的50%；控制菌檢查中，測(cè)試菌在含有規(guī)定量供試品的環(huán)境中應(yīng)可以生長。b. 樣品自身含有的微生物水平不得

5、干擾菌株回收實(shí)驗(yàn)。供試液制備：以70%的乙醇擦拭供試品的外包裝，使自然揮干。由于硬脂酸美是一種脂溶性物質(zhì)，因此用表面活性劑吐溫-80將其溶解。無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入一定量的45滅菌的含1%吐溫-80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，振搖使分散均勻，制成1:40的供試液。計(jì)數(shù)方法適用性：a. 實(shí)驗(yàn)組：取4個(gè)直徑為9cm的無菌平皿。其中兩個(gè)平皿中加入1:40供試液4mL和50-100cfu 測(cè)試菌，取另兩平皿加入1:40供試液2mL和50-100cfu測(cè)試菌。每個(gè)平皿傾注45表格2中的規(guī)定培養(yǎng)基，搖勻。待瓊脂凝固后，參照表格2的條件倒置培養(yǎng)。5株測(cè)試菌（黑曲霉、枯草芽孢桿菌

6、、白色念珠菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）均進(jìn)行該測(cè)試。b. 樣品組：取8個(gè)直徑為9cm的無菌平皿。其中兩個(gè)平皿中分別加入1:40供試液4mL和2mL，每個(gè)平皿傾注45 TSA；取另兩平皿加入1:40供試液4mL和2mL，每個(gè)平皿傾注45 SDA；各平行測(cè)試兩皿。參照表格2培養(yǎng)。記錄平皿計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算測(cè)試菌回收率。c. 菌液組：計(jì)數(shù)方法適用性檢查中測(cè)試菌包括5株測(cè)試菌，分別為黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。參考表格2培養(yǎng)條件，采用澆碟法計(jì)數(shù)，確定接種量。d. 回收率計(jì)算公式如下：A-實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)；B-樣品組平均菌落數(shù)；C-菌液組平均菌落數(shù)。控制菌測(cè)試方法適

7、用性：大腸埃希菌a. 預(yù)培養(yǎng)：取1:40供試液40mL（相當(dāng)于1g）至400mL滅菌TSB，混勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)。b. 陽性組1：接種50-100cfu大腸埃希菌至滅菌TSB中，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)。c. 實(shí)驗(yàn)組1：取1:40供試液40mL（相當(dāng)于1g）和50-100cfu大腸埃希菌至400mL滅菌TSB，混勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)。d. 陽性組2：取1mL滅菌TSB和50-100cfu大腸埃希菌至100mL滅菌麥康凱肉湯中，置42至44培養(yǎng)24至48小時(shí)；劃線接種至麥康凱瓊脂，30至35培養(yǎng)18至72小時(shí)。e. 實(shí)驗(yàn)組2：取TSB預(yù)培養(yǎng)物1mL和50-10

8、0cfu大腸埃希菌至100mL滅菌麥康凱肉湯中，置42至44培養(yǎng)24至48小時(shí)。劃線接種至麥康凱瓊脂，30至35培養(yǎng)18至72小時(shí)。沙門氏菌a. 預(yù)培養(yǎng)：無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入45的400mL1%吐溫-80的滅菌TSB，振搖使分散均勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)。b. 陽性組1：接種50-100cfu霍亂沙門氏菌至滅菌的1%吐溫-80的TSB中，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)。c. 實(shí)驗(yàn)組1：無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入45的400mL滅菌的1%吐溫-80的TSB，振搖使分散均勻。加入50-100cfu霍亂沙門氏菌置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)

9、。d. 陽性組2：取0.1mL滅菌TSB（含1%吐溫-80）和50-100cfu霍亂沙門氏菌至10mL滅菌RVS肉湯中，30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)；劃線接種至XLD瓊脂，30至35培養(yǎng)18至48小時(shí)。e. 實(shí)驗(yàn)組2：取TSB（含1%吐溫-80）預(yù)培養(yǎng)物0.1mL和50-100cfu霍亂沙門氏菌至10mL滅菌RVS肉湯中，30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)；劃線接種至XLD瓊脂，30至35培養(yǎng)18至48小時(shí)。4、 討論表格3至表格5表明本品涉及到所有培養(yǎng)基均符合微生物學(xué)檢查用的要求。培養(yǎng)基的滅菌方式各異，參見表格1。表格6至表格8表明硬脂酸美并不抑制各株測(cè)試菌的生長。計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，膠囊殼自身的顏色使得

10、瓊脂清晰度降低，使得對(duì)3株細(xì)菌（枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的計(jì)數(shù)較為困難，但并不影響黑曲霉和酵母菌的計(jì)數(shù)。因此，通過方法適用性實(shí)驗(yàn)，確定以增加培養(yǎng)基體積的方式使得平皿計(jì)數(shù)可行?？刂凭鷻z查方法依照常規(guī)方法即可滿足。本品微生物學(xué)檢查方法的具體內(nèi)容在后續(xù)細(xì)述，詳見“微生物學(xué)檢查檢驗(yàn)操作程序”。三、 微生物學(xué)檢查檢驗(yàn)操作程序1、 供試樣品制備以70%的乙醇擦拭供試品的外包裝，使自然揮干。無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入的45含1%吐溫-80滅菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，振搖使分散均勻，制成1:40的供試液。取1:40供試液4mL至6mL pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖

11、液，制得1:100供試液。2、 計(jì)數(shù)測(cè)試實(shí)驗(yàn)中均使用直徑為9cm的滅菌平皿。a. 需氣菌計(jì)數(shù)（TAMC）：取1:40供試液2mL，平行測(cè)定4皿；取1:100供試液1mL，平行測(cè)定2皿，分別傾注15-20mL45 TSA瓊脂，充分搖勻分散供試品。待平皿中瓊脂凝固后，30-35倒置培養(yǎng)3至5天。b. 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)（TYMC）：取1:40供試液2mL，平行測(cè)定4皿，；取1:100供試液1mL，平行測(cè)定2皿，傾注15-20mL45 SDA瓊脂，充分搖勻分散供試品。待平皿中瓊脂凝固后，20-25倒置培養(yǎng)5至7天。按照規(guī)定培養(yǎng)條件結(jié)束培養(yǎng)后，點(diǎn)擊平皿中的菌落數(shù)（CFU）。通過平皿計(jì)數(shù)結(jié)果求算均值，最后

12、轉(zhuǎn)換為相當(dāng)于每g樣品中含有的菌落數(shù)。若樣品中未檢出菌落，則結(jié)果可解釋為“每g樣品中菌落數(shù)少于10個(gè)?！薄?、 控制菌檢查3.1 大腸埃希菌取1:40供試液40mL（相當(dāng)于1g）至400mL TSB，混勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)，觀察結(jié)果。取TSB培養(yǎng)物2mL接種至100mL麥康凱肉湯，置42至44培養(yǎng)24至48小時(shí)，觀察結(jié)果并劃線接種至麥康凱瓊脂，置30至35培養(yǎng)18至72小時(shí)，逐日觀察結(jié)果。3.2 沙門氏菌無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入400mL的45滅菌TSB（含1%吐溫-80），振搖使分散均勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)，觀察結(jié)果。取0.1mL TSB培養(yǎng)物

13、接種至10mLRVS肉湯，置30至35培養(yǎng)18至24小時(shí)，觀察結(jié)果并劃線接種至XLD瓊脂，置30至35培養(yǎng)18至48小時(shí)，逐日觀察結(jié)果。4、 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組，以確證實(shí)驗(yàn)操作條件的可靠性。陰性對(duì)照操作同上述操作過程，其中以稀釋劑代替供試品同步操作。表格:表格 1 : 培養(yǎng)基來源信息參比培養(yǎng)基測(cè)試用培養(yǎng)基滅菌條件廠家批號(hào)廠家批號(hào)BP/美壇090205121, 15minMCANICPBPDCM0008美壇070124121, 15minMCBNICPBPDCM0013美壇080321121, 15minRVSNICPBPDCM0003MerckVM855366721115, 15min

14、SDANICPBPDCM0005美壇070315121, 15minSDBNICPBPDCM0001美壇090209121, 15minTSANICPBPDCM0002美壇080701121, 15minTSBNICPBPDCM0011美壇090414121, 15minXLDNICPBPDCM0012BD7088156Heat to boiling表格 2 : 測(cè)試用菌株生長條件測(cè)試用菌株菌株復(fù)蘇用培養(yǎng)基計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間黑曲霉/SDA20-255-7days枯草芽孢桿菌TSBTSA30-353-5days白色念珠菌SDBSDA20-255-7days大腸埃希菌TSBTSA30-3

15、53-5days銅綠假單胞菌TSBTSA30-353-5days霍亂沙門氏菌TSBTSA30-353-5days金黃色葡萄球菌TSBTSA30-353-5days表格3. 固體培養(yǎng)基促生長能力測(cè)試結(jié)果培養(yǎng)基測(cè)試菌株測(cè)試次數(shù)平均菌落數(shù)回收率(%)接種量回收量TSA黑曲霉119178721916863928189枯草芽孢桿菌1135114852858296312812084白色念珠菌152509526451793775773銅綠假單胞菌18956632382564314211581金黃色葡萄球菌181536625839673523975SDA黑曲霉145439422625963241981白色念珠

16、菌188859724842873565294MCA大腸埃希菌1168161962125160128380100125XLD霍亂沙門氏菌1967881211092843125132106方法: 澆碟法 表面接種法接種量-M菌落計(jì)數(shù)結(jié)果；回收量-M菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表格4. 固體培養(yǎng)基指示能力和抑制能力測(cè)試結(jié)果培養(yǎng)基測(cè)試菌株指示能力抑制能力MCA大腸埃希菌紫紅色或粉紅色圓形菌落。/XLD霍亂沙門氏菌紅色菌落，有黑色中心。/大腸埃希菌白色圓形菌落/表格4中各測(cè)試均采用表面接種法。表格5. 液體培養(yǎng)基促生長能力和抑制能力測(cè)試培養(yǎng)基測(cè)試菌株促生長能力抑制能力TSB枯草芽孢桿菌+/銅綠假單胞菌+/金黃色葡萄球菌+/SDB白色念珠菌+/MCB大腸埃希菌+/金黃色葡萄球菌/No growthRVS霍亂沙門氏菌+/金黃色葡萄球菌/No growth表格 6. 計(jì)數(shù)方法適用性考察結(jié)果測(cè)試菌株測(cè)試次數(shù)平均菌落數(shù)回收率(%)接種量回收量枯草芽孢桿菌13331942109978931059691銅綠假單胞菌11701549