項目實訓手冊-項目1-牛乳中金黃色葡萄球菌定性檢驗解析

1、微生物檢驗技術教學資源庫微生物檢驗技術課程實訓指導手冊項目一 牛乳中金黃色葡萄球菌的定性檢驗（依據(jù) GB 4789.10-2010 第一法）一、實訓目的掌握按照國標進行食品中金黃色葡萄球菌的檢驗和判定，學會樣品的制備和處理方法， 掌握金黃色葡萄球菌定性檢驗的程序及要點，掌握金黃色葡萄球菌在分離平板上的菌落特征 以及血漿凝固酶試驗的操作過程及結果判定，學會按照二級采樣方案對金黃色葡萄球菌定性 檢驗結果進行判定。二、實訓原理即一般的檢驗流程是：增菌-平板分離-鑒定。其中增菌，進行選擇性增菌培養(yǎng)，允許金 黃色葡萄球菌持續(xù)增殖，同時阻止大多數(shù)其他細菌的增殖；平板分離，采用可抑制非金黃色 葡萄球菌生長的

2、固體選擇性培養(yǎng)基和血平板，提供肉眼可見的疑似金黃色葡萄球菌的純菌落 和溶血現(xiàn)象；最后通過菌體形態(tài)觀察、血漿凝固酶試驗進行鑒別和判定。三、實訓要求本實驗項目操作標準依據(jù) GB 4789.10-2010第 一法。本項目全面考察學生對牛乳中沙門氏菌檢驗項目的實施過程中所涉及樣品處理，增菌，平板分離，鑒定等3個環(huán)節(jié)整體把握和運用能力以及在整個實驗過程中的操作文明和操作安全意識。本項目按4人 /組為單位進行操作，要求按照無菌操作完成樣品的處理過程，正確配制培養(yǎng)基和試劑，學會樣品的接種，液 -液接種，平板劃線以及相應的鑒定試驗（如染色鏡檢，血漿凝固酶試驗等），掌握金黃色葡 萄球菌在各分離平板上的典型特征和

3、溶血試驗現(xiàn)象，學會原始記錄的書寫以及結果的判定。四、實驗材料和設備1. 實驗設備金黃色葡萄球菌檢驗的實驗設備有：天平、均質器、超凈工作臺、生物安全柜、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、顯微鏡。2. 實驗用具金黃色葡萄球菌檢驗的實驗用具有：無菌吸管、微量移液器及吸頭、無菌試管、接種環(huán)。3. 培養(yǎng)基及試劑金黃色葡萄球菌檢驗用到的培養(yǎng)基及試劑有：（1）增菌試劑：7.5%氯化鈉肉湯。增菌可使用7.5漁化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大 豆肉湯，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長，而除某些嗜高鹽的 海洋菌外，大多數(shù)細菌都能被增菌液中的高鹽所抑制。(2) 分離平板：血瓊脂平板和 baird-p

4、arker ( BP瓊脂平板；其中BP瓊脂培養(yǎng)基需按 照95mL的倍數(shù)配制，高壓滅菌后，冷卻至 50C,每95mL加入預熱50C的卵黃亞碲酸鉀增菌 劑5mL搖勻后傾注平板，培養(yǎng)基應是致密不透明的，使用前在冰箱保存不得超過 48h。(3) 純化平板：營養(yǎng)瓊脂平板或營養(yǎng)瓊脂小斜面。本實驗采用營養(yǎng)瓊脂平板(4) 鑒定試劑：革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯(BHI)、凍干兔血漿。4、實驗室要求及個人防護用品實驗室要求：實驗根據(jù)GB 4789.1-2010食品安全國家標準 食品微生物檢驗 總則中要求，一般樣 品檢驗在潔凈實驗室中進行，病原微生物分離鑒定在二級生物安全實驗室( BSL-2)中進行。 該實訓要求

5、，樣品處理與增菌在無菌室中進行，分離鑒定在 BSL-2實驗室中進行。無菌室個人防護用品有：無菌工作服、一次性口罩、帽子和無粉乳膠手套。BSL-2實驗室個人防護用品有：防滲透工作服，一次性口罩(有條件者備N95 口罩)、帽子、無粉乳膠手套及聚氯乙烯手套各 1畐嘰五、實訓任務1、無菌室消毒和準備前增菌需在潔凈區(qū)域中進行，無菌室的消毒和準備如下： 進入無菌室緩沖間，將樣品和增菌液放入傳遞窗中，打開傳遞窗紫外燈進行表面殺菌。 進入已進行整體消毒過的無菌室，用75%酒精棉擦拭工作臺面，將消毒水廢液缸等常 用物品放置在臺面上。開啟無菌室的紫外燈，輻照滅菌 30min后，關閉無菌室和傳遞窗的紫 外燈。 進入

6、無菌室緩沖間，更換無菌工作服，戴一次性帽子、口罩和無菌手套，穿上鞋套， 用75%酒精棉徹底消毒雙手，取出傳遞窗內的物品，放在工作臺面上，進行后續(xù)操作。2、樣品處理與增菌在已進行消毒的無菌室內，以75%酒精擦拭樣品外包裝，尤其是包裝的開口處，用無菌 剪刀在樣品封口處剪開包裝袋，打開盛有 225mL7.5%氯化鈉肉湯的樣品瓶，用量程為 10mL 的無菌吸管量取25mL牛奶樣品至樣品瓶中，充分振搖混勻。若樣品為固態(tài)，需用拍擊式均質器拍擊2 min。處理完畢的樣品通過傳遞窗出無菌室，清 理無菌室，打開紫外燈，輻照滅菌 30 min。將上述處理好的檢測樣品放于預先設置 36 C± C的恒溫恒濕

7、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h24h。3、平板分離(1) BSL-2實驗室消毒與準備病原微生物分離鑒定工作應在 BSL-2實驗室中進行，BSL-2實驗室的消毒與準備如下： 進入BSL-2實驗室緩沖間，做好個人防護，將增菌所用無菌試劑放入BSL-2緩沖間的傳遞窗中，打開傳遞窗紫外燈進行表面殺菌。 進入已進行整體消毒過的BSL-2實驗室，用75%酒精棉擦拭生物安全柜臺面，依次開 啟生物安全柜和BSL-2實驗室的紫外燈，輻照滅菌1小時后關閉。 進入BSL-2實驗室緩沖間，更換防滲透防護衣，戴一次性帽子、口罩和無菌手套，穿 上鞋套，取出傳遞窗內的物品，放在工作臺面上。進行后續(xù)操作。注意：操作時避免雙臂頻 繁穿過氣

8、幕破壞氣流。(2) 平板分離金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在 10%氯化鈉胰酪胨大 豆肉湯內呈混濁生長。在已進行消毒的生物安全柜內用接種環(huán)取培養(yǎng)后的7.5%氯化鈉肉湯，分別劃線接種到BP平板和血平板，于36± C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h24h，BP平板有時需要延 長至45h48h。本實驗中各分離平板上的菌落特征如下：BP平板：菌落直徑為2 mm3 mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶， 在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解 的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。BP培養(yǎng)基中含有卵黃、氯化鋰和亞碲酸鉀，能抑制大多

9、 數(shù)細菌的繁殖，而丙酮酸鈉和甘氨酸能促進金黃色葡萄球菌的生長使其產生黑色和暈圈。長 期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并 干燥。血平板：菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見完全 透明溶血圈。金黃色葡萄球菌可以產生溶血素，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，這是鑒 定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標。4、鑒定(1)染色鏡檢取潔凈載玻片，于其上滴加1滴生理鹽水，用接種環(huán)將可疑菌落涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直 徑約為 0.5 yrml(2)血漿凝固酶試驗挑取B

10、P平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5 mL BHI和營養(yǎng)瓊脂平板， 36±C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h24 h。取BHI培養(yǎng)物0.20.3 mL加入到已用0.5 mL無菌生理 鹽水完全溶解的凍干兔血漿安瓿瓶中，振蕩搖勻，加入0.5 mL無菌生理鹽水至完全溶解，再加入BHI培養(yǎng)物0.2 mL0.3 mL,振蕩搖勻， 置36±°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每半小時觀察一次，共觀察6 h，如兔血漿呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，則判定為陽性結果。由于病原性葡 萄球菌能產生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細菌表面，生成

11、 凝塊。凝固酶試驗是鑒定葡萄球菌致病性的重要依據(jù)。注意：測試時須同時以血漿凝固酶試 驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的新鮮肉湯培養(yǎng)物作為對照，建議陽性菌株可選擇金黃色葡萄球 菌標準菌株ATCC6538，陰性菌株可選擇表皮葡萄球菌或白色葡萄球菌標準菌株。本實驗金黃色葡萄球菌標準菌株和待檢菌均為凝固，表皮葡萄球菌不凝固，判定該待檢 菌為陽性。結果如可疑，可再挑取營養(yǎng)瓊脂平板的菌落到5 mL BHI ,36±C培養(yǎng)18 h48 h，重復本試驗以進行確認。5、金黃色葡萄球菌腸毒素檢驗金黃色葡萄球菌腸毒素是一種重要的致病物質，是引起的食物中毒的重要原因。近年報 導顯示，50%以上的金黃色葡萄球菌菌株在

12、實驗室條件下可產生腸毒素，并且1個菌株能產生兩種或兩種以上的腸毒素。可疑食物中毒樣品或產生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌 株的鑒定，可按標準附錄B進行葡萄球菌腸毒素檢驗。6、結果與報告染色鏡檢和血漿凝固酶特征符合金黃色葡萄球菌特征的，可判定為金黃色葡萄球菌。結 果報告為：在25 g ( mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。本實驗在血平板和BP平板上的菌落形態(tài)典型，經染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄 串狀排列，血漿凝固酶陽性，可判定為檢出金黃色葡萄球菌，結果報告為25mL樣品中檢出。填寫原始記錄單和報告。根據(jù)GB4789.1-2010食品安全國家標準 食品微生物檢驗 總則要求檢驗后樣品要進

13、 行無害化處理。4微生物檢驗技術教學資源庫8六、原始數(shù)據(jù)記錄表金黃色葡萄球菌檢驗原始記錄樣品編號樣品名稱樣品狀態(tài)固態(tài)，無異常 液態(tài)，無異常 其他：樣品數(shù)量溫度C濕度檢驗方法檢測地點主要檢測儀器 名稱及編號分析前設備狀態(tài)正常異常分析后設備狀態(tài)正常異常主要培養(yǎng)基和試劑檢驗項目測試數(shù)據(jù)記錄檢驗結果技術指標檢驗結論金黃色葡萄 球菌檢樣 25g(ml) + 225 ml7.5% 氯 化鈉肉湯(36±1C, 1824h)培養(yǎng)結果血平板(36 ±1 C, 1824h)培養(yǎng)結果Baird-parker 平板(36 ±1 C, 1824h)培養(yǎng)結果革蘭氏染色結 果和菌落形態(tài) 25g (mL)樣品中未檢出 25g (mL)樣品中檢岀n=5c= m=M=符合不符合顏色清澈混濁生長無可疑菌