大腸埃希菌耐藥性分析與產(chǎn)ESBLs基因型研究

1、大腸埃希菌耐藥性分析與產(chǎn)esbls基因型研宄1 （青島大學(xué)，山東青島）2 （海陽市人民醫(yī)院，山東海陽）摘要h目的：監(jiān)測(cè)海陽市產(chǎn)esbls與非產(chǎn)esbls大腸埃希菌的耐藥情況及 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因型分布。方法:收集2014年海陽市人民醫(yī)院臨床標(biāo)木中 96株大腸埃希菌，對(duì)產(chǎn)esbls菌株和非產(chǎn)esbls菌株分別用whonet5.6進(jìn)行耐藥 統(tǒng)計(jì)與分析，并用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)產(chǎn)酶菌株耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:產(chǎn)esbls 菌株耐藥率明顯高于非產(chǎn)esbls菌株。43株產(chǎn)酶菌株檢測(cè)出的耐藥基因型為 ctx-m和tem,其陽性率分別為55.81%和6.98%,未檢測(cè)出shv和oxa。結(jié)論: 海

2、陽市人民醫(yī)院產(chǎn)esbls大腸埃希菌耐藥性明顯高于非產(chǎn)esbls大腸埃希菌，產(chǎn) esbls菌株攜帶的耐藥基因以ctx-m為主。關(guān)鍵詞:esbls大腸埃希菌耐藥基因analysis of e. coli resistance and research on producing esbls genotypeswang shufeng xing jinlei zhou qi（qingdao university,qingdao）abstract:objective:to monitore the resistance of producing esbls and non-producing esbls

3、 of escherichia coli in haiyang city, and to analysis the genotypedistribution of producing esbls.methods:to collect 2014 clinical specimens inhaiyang city peoples hospital of 96 strains of e.coli, the producing esbls strains andnon producing esbls strains respectively using whonet5.6 resistant, sta

4、tistics andanalysis by using polymerase chain reaction to test the enzyme production strains ofresistant genes.results:producing esbls strains resistant rate was significantly higherthan producing esbls strains.43 strains enzyme producing strains were detectedresistant genotypes of ctx-m and tem, th

5、e positive rate were 55.81% and 55.81%, not been detected the shv and oxa.conclutions:haiyang city peoples hospital of producing esbls e.coli resistance significantly higher than non-producing esbls e.coli, producing esbls strains carrying resistance genes is given priority to with ctx-m.key wordses

6、bls;escherichia coli;resistance genes引言大腸埃希菌是革蘭氏陰性桿菌中造成醫(yī)院感染的主要致病菌之一，可以造成 病人各種部位的感染。近年來，隨著抗菌藥物廣泛使用，以及一些臨床醫(yī)生對(duì)抗 菌素的濫用，產(chǎn)esbls菌株的逐年增加，這己近引起了國(guó)家各級(jí)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的高度 重視。本研宄針對(duì)海陽市人民醫(yī)院96株大腸埃希菌產(chǎn)esbls菌株與非產(chǎn)esbls 菌株進(jìn)行耐藥比較及相關(guān)耐藥基因型測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)告結(jié)果如下。材料與方法1材料1.1菌株來源與質(zhì)控菌株菌株來源于2014年海陽市人民醫(yī)院臨床分離的96 株大腸埃希菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌atcc 25922。1.2主要儀器與試劑vit

7、ek2 compact微生物自動(dòng)分析儀，pcr紫外凝膠成 像系統(tǒng)，各種電泳緩沖液pcr引物和taq dna聚合酶等。2. 方法2.1菌株鑒定及藥敏測(cè)定所有菌株通過vitek compct微生物全自動(dòng)分析儀 進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。將儀器篩選出的產(chǎn)esbls的菌株采用雙紙片協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行 確認(rèn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2 pcr模板制備將-41°c保存的產(chǎn)esbls大腸埃希菌菌株分別接種于血瓊脂 平板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)出的單個(gè)菌落直接作為 模板使用。2.3引物設(shè)計(jì)tem f:5’-ac

8、gacattcgtcaactgcaa-3, 414bpr:5’-taaattggcaccctgtaggc-3,shv f:5’-tctccctgttagccaccctg-3* 592bpr:5’-ccactgcagcagctgccgtt-3'ctx-m f:5’-tgcggtattatcccgtgttg-3i 343bprs&rsquotcgtcgtttggtatggcuoxa f:5’-gtctttcaagtacggcatta-3* 822bpr:5’-ga

9、ttttcttagcggcaactta-3'2.4 pcr擴(kuò)增pcr 反應(yīng)體系共 30μl，包括 0.2μipremixtaq 酶，3.0μl 引物，牙 簽挑一點(diǎn)菌落作為dna模板，21.4μl無菌雙蒸水,3μl 10×bufferopcr 擴(kuò)增條件:94°c預(yù)變性7min,變性94°c30s,復(fù)性55°c30s,延伸72°clmin，共 30個(gè)循環(huán)，最后72"c延伸lomin。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.2ml/dl瓊脂糖凝膠 上進(jìn)行電泳30min,

10、在凝膠成像系統(tǒng)上成像觀察結(jié)果。結(jié)果1. 菌株分布經(jīng)調(diào)查表明，來自于臨床標(biāo)本的96株大腸埃希菌中奮43株為產(chǎn)esbls菌株， 主要來源于普外二科，構(gòu)成比為25.58%。標(biāo)本主要來源于膿液和血液，分別為 18株和13株，構(gòu)成比分別為41.86%、30.23%。2. 產(chǎn)esbls和非產(chǎn)esbls大腸埃希菌耐藥情況比較研究結(jié)果表明，來源于該醫(yī)院的96株大腸埃希菌中，產(chǎn)esbls菌株耐藥性 明顯高于非產(chǎn)esbls菌株。二者對(duì)9種藥物耐藥性具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p<0.05)o九種藥物分別為阿米卡星、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢替 tt、頭孢西丁、厄他培南、慶大霉素、亞胺培南、哌拉西林

11、/他唑巴坦和復(fù)方新 諾明。產(chǎn)esbls菌株對(duì)氨芐西林和頭孢唑啉耐藥性為100%;氨芐西林/舒巴坦、 氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明耐藥率皆大于60%。對(duì)阿米卡星、 厄他培南、亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦尚有良好的敏感性。非產(chǎn)esbls菌株 對(duì)氨芐西林耐藥性為77.4%；復(fù)方新諾明耐藥性54.7%；對(duì)阿米卡星、頭孢西丁、 亞胺培南和帕拉西林/他唑巴坦敏感率為100%。3. 產(chǎn)esbls大腸埃希菌基因型檢測(cè)結(jié)果在43株產(chǎn)esbls人腸埃希菌中冇24株攜帶ctx-m基因，3株攜帶tem基因，其中奮2株冋吋攜帶如上兩種基因。未檢測(cè)出shv和oxa兩種基因。產(chǎn)esbls 大腸埃希菌ctx-m與

12、tem兩種耐藥基因pcr擴(kuò)增片段凝膠分析分別見圖1和圖 2,擴(kuò)增片段大小與設(shè)汁一致。討論大腸埃希菌是最為常見的產(chǎn)esbls革蘭氏陰性桿菌之一。超廣譜β-內(nèi)酰 胺酶（esbls）產(chǎn)生及播散給臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)，是新-代β-內(nèi) 酰胺類抗生素耐藥的主要原因。它不僅可水解普通β-內(nèi)酰胺抗菌素的 β-內(nèi)酰胺環(huán)，而且對(duì)耐酶的廣譜β-內(nèi)酰胺抗菌素尤其是頭孢他啶和氨曲 南等新型廣譜頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)亦冇水解作用1。本研究中顯示產(chǎn) esbls大腸埃希菌對(duì)氨曲南耐藥率為65.1%,對(duì)頭孢他啶耐藥

13、率為34.9%,皆奮較 高的耐藥性。esbls基因型冇tem型、shv型、ctx-m型和oxa型等，大多數(shù)為tem型 和shv型。ctx-m型酶能水解絕大部分頭孢菌素，典型的ctx-m型酶對(duì)頭孢噻 肟具有超強(qiáng)水解能力，而對(duì)頭孢他啶中低度耐藥，還有一種為變異型ctx-m型 酶，可以將頭孢他啶水解。tem型酶是由tem-1和tem-2的基因發(fā)生突變?cè)斐?1-4個(gè)氨基酸改變而形成的一系列酶蛋白。該基因由質(zhì)粒介導(dǎo)，主要引起細(xì)菌對(duì) β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥2。近年來,ctx-m型逐漸成為我國(guó)主要流行亞型3。 本研究顯示本院43株產(chǎn)esbls人腸埃希菌中冇24株攜帶ctx-m基|±

14、|, di 55.8%,是本院產(chǎn)esbls菌株的主要基因型；有3株攜帶tem基因，占6.98%。符合近年 來我國(guó)產(chǎn)esbls菌株主要流行型別。我院分離的96株人腸埃希氏菌中產(chǎn)esbls菌株共43株，陽性率為44.79%。 比申月靜等4在文獻(xiàn)中報(bào)道產(chǎn)esbl大腸埃希菌陽性率55.6%低，比天津市紅 橋醫(yī)院5報(bào)道的21.7%要高，比范雪蓮等6報(bào)道2013年廣東省海珠區(qū)婦 幼保健院產(chǎn)esbls大腸埃希菌檢出率為61.3%低，比王興林7等報(bào)道貴州黔西 南州產(chǎn)esbl大腸埃希菌檢出率為29.33%高。大腸埃希菌也是醫(yī)院感染常見的病 原菌，可引起腸道外感染。本次研宄結(jié)果顯示，大腸埃希菌可引起各種部位器官

15、感染，包括傷口感染、泌尿系感染、血液感染等，最主要是傷口感染和血液感染。產(chǎn)esbls菌株主要來自于主要來源于普外二科、icu、婦科和腎內(nèi)科。產(chǎn)esbls大腸埃希菌耐藥情況越來越嚴(yán)重，院內(nèi)感染管理科和臨床醫(yī)生應(yīng)當(dāng)重視病原學(xué)檢査,對(duì)己經(jīng)感染產(chǎn)esbls菌株的患者進(jìn)行隔離治療，加強(qiáng)臨床診療環(huán) 境的檢測(cè)，重視手衛(wèi)生，避免醫(yī)患、患者之間相互傳染，防止產(chǎn)esbls大腸埃希 菌在全院的流行甚至暴發(fā)流行。重視實(shí)驗(yàn)室病原菌藥物敏感性試驗(yàn)，臨床醫(yī)生養(yǎng) 成根據(jù)藥敏結(jié)果選擇和及時(shí)更改抗生素的用藥 上慣，合理使用抗生素，避免濫用。參考文獻(xiàn)1】滑立偉，秦樹林.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(esbl)細(xì)菌的現(xiàn)狀及

16、其對(duì)策 j .infect dis info,2000,13(4).2sirot d'sirot j'lsbia r,etal.transferable resistance to third-generation cephalosperins in clinical isolates of klebsiellapnermoniae:identification of ctx-l,anovel β-lactamase j j antinicrob chemother,1987,20(3):323-334.3】張玲.產(chǎn)esbls腹瀉病原菌的耐藥性和分子流行病學(xué)研究d.中國(guó)人民解 放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2008.4】申月靜