大蒜素對大鼠肝損傷細(xì)胞因子保護(hù)作用

1、大蒜素對大鼠肝損傷細(xì)胞因子保護(hù)作用【摘要】目的研究大蒜素對高脂飲食致大鼠慢性肝損 傷的保護(hù)作用及內(nèi)毒素(lps)刺激引起肝臟枯否細(xì)胞(kcs) 分泌細(xì)胞因子的變化。方法wistar大鼠隨機(jī)分為3組，10 周后腹主動脈采血測定血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、白細(xì) 胞介素(il) 6、il (10)、腫瘤壞死因子(tnf) a水平，取肝組織用于組織病理切片的制備。分離培養(yǎng)kcs，檢測在 lps刺激下kcs上清液中i l 6、il 10、tnf a的水 平。結(jié)果大鼠發(fā)生慢性肝損傷時，血清alt及il 6、tnfcl水平明顯升高(p【關(guān)鍵詞】大蒜素 大蒜素作為一種來源廣泛的含硫化合物，其對四氯化碳、酒

2、精等引起的肝損傷有明顯保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對 高脂飲食引起的慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，但機(jī)制尚未 闡明。為此，我們通過復(fù)制大鼠慢性肝損傷模型，觀察大蒜 素對肝臟枯否細(xì)胞(k c s)分泌調(diào)節(jié)的影響。1材料與方法1 1材料111實(shí)驗(yàn)動物wistar雌性大鼠，體重150170g (山西醫(yī)科大學(xué)動物中心)。2主要試劑及藥物膽固醇(北京化學(xué)試公司)；大蒜素膠囊(湖北金龍藥業(yè)公司)；iv型膠原酶、胎牛血清培養(yǎng)液(dmem)、percoll 液、內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,lpsfromescher ichiacoliolll：b4）（美國 sigma公司）； 白細(xì)胞介素（il）

3、 6、il 10、腫瘤壞死因子（tnf） a （解 放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫所）；胎牛血清（杭州四季 青生物工程公司）。12方法121動物模型的建立選用雌性wi star大鼠36只，正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，對照組正常飲食飼養(yǎng)； 模型組給予高脂飲食（普通飼料+5%的膽固醇+15%的玉米油）; 藥物組高脂飲食同時隔日大蒜素（0 5%, 10ml/kg）灌胃。10周后各組取實(shí)驗(yàn)動物8只，1%戊巴比妥納麻醉后腹主動脈 采血處死動物，取肝左葉置于10%中性福爾馬林固定備做病 理切片。122血清指標(biāo)的檢測采集的血液經(jīng)肝素抗凝后，3000r/min離心15min，分離血漿，用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶（

4、alt）、il 6、il 10、tnf a水平的檢測，按試 劑盒說明書進(jìn)行操作。123枯否細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定采用改進(jìn)seglen膠原酶兩步灌流和percoll密度梯度離心法分離得到 各組大鼠肝臟細(xì)胞，經(jīng)5%c02、37°c恒溫培養(yǎng)箱孵育4h，洗 去未貼壁細(xì)胞。經(jīng)臺盼藍(lán)非特導(dǎo)性酯酶染色，活性和純度分 別達(dá)到95%時，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5x106,接種于48孔培養(yǎng)板中， 每組8孔。124培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的檢測于培養(yǎng)液中加入100 mg/mllps2滴，4h后收集培養(yǎng)上清，用于il 8、 tnf a、il10 的測定。1 3統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用土s表示，采用spss120軟件進(jìn)行方差分析(sn

5、k法)。2 結(jié)果2 1慢性肝損傷結(jié)果211肝組織病理學(xué)變化肝組織病理學(xué)顯示，模型組與藥物組大鼠體肝組織均出現(xiàn)不同程度的彌漫性改變， 肝內(nèi)可見到大量的脂肪空泡(肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞/總細(xì)胞 數(shù)1/3)及肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)和匯管區(qū)有大量的以單 核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，但未見明顯肝纖維 化，表明慢性損傷大鼠發(fā)生脂肪肝炎；與模型組相比，藥物 組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。212血清alt的變化對照組為(615±126)u/l,而模型組與藥物組alt水平明顯升高，分別為(2103 ±1054), (1441±729)u/l,與對照組比較，p2 13 血清i

6、l 6、il 10,tnf a的變化(表1) 隨著動物發(fā)生慢性肝損傷，模型組與藥物組il 6、tnf a 水平明顯升高，il10則明顯下降；藥物組il 6水平明顯低于模型組，而tnf a降低及il 10升高，差異無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。表1大蒜素對血漿胞因子的影響注：與對照組比較，ap2 2枯否細(xì)胞的分離、培養(yǎng)結(jié) 果221 kcs形態(tài)的改變與對照比較分離kcs結(jié)果表明，對照組kcs體積較小，形態(tài)相對規(guī)整，胞漿突起纖細(xì)， 胞漿內(nèi)僅有少量空泡。而模型組kcs體積明顯增大，核漿比 例增大，胞漿突起明顯增多、變粗、胞漿高度空泡化，吳典 型的活化狀態(tài)。222 kcs分泌細(xì)胞因子的變化（表2）加入lps后，模型組

7、與藥物組培養(yǎng)上清液中il 6、tnf a水平明 顯高于對照組，il 10、水平發(fā)生明顯下降。藥物組與高 脂組比較il 6、tnf a水平顯降低，而il 10水平顯 著升高。表2大蒜素對大鼠kcs培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的影響注：與對照組比較，ap3 討論近年來，非酒精性脂肪肝炎發(fā)病率明顯增高，盡管該病 的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但對先天肥胖性ob/ob小鼠和 fa/fa大鼠研究表明，kcs分泌功能紊亂參與了疾病的發(fā)生。 其自然發(fā)展成為脂肪肝，特征有胰島素抵抗、肥胖、脂質(zhì)代 謝紊亂，與人類的非酒精性脂肪肝炎直接相關(guān)1 ）。yang 等2提出肥胖個體枯否細(xì)胞功能紊亂可以增加肝細(xì)胞對 內(nèi)毒素的敏感性，從而加

8、速脂肪肝炎的形成。對肥胖、瘦素 受體功能紊亂的大鼠、小鼠枯否細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，枯否細(xì) 胞表型異常，在給予內(nèi)毒素刺激后與對照比較，促炎因子il6、tnf ci表迗?jiān)黾?，而抑炎因子il 10表迗抑制3）。 盡管肝臟各種細(xì)胞均可產(chǎn)生tnf a ,但普遍認(rèn)為內(nèi)毒素活 化枯否細(xì)胞是tnf a產(chǎn)生的主要來源。研究表明，tnf a在脂肪肝炎的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，其不僅可通過 活化受體，產(chǎn)生各種適應(yīng)性蛋白、促進(jìn)肝細(xì)胞的抗凋亡（4 ）， 也可引發(fā)肝細(xì)胞線粒體釋放出活性氧引起肝細(xì)胞死亡、凋亡 和肝臟的炎病浸潤。il 6是肝臟kcs產(chǎn)生的另一種重要促 炎因子，可與tnf a在協(xié)同促進(jìn)肝內(nèi)炎癥的產(chǎn)生。相反il1

9、0可通過抑制各種促炎因子的生成，從而減少肝內(nèi)中性 粒細(xì)胞的浸潤。大蒜素是從大蒜中提取出的一種有效成分， 其作用十分廣泛。有文獻(xiàn)報道其對cc14及乙醇所致的急、 慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用5, 6）。在我們以往的研究 中也發(fā)現(xiàn)，其對高脂飲食所致肝臟慢性損傷也有較好的保護(hù) 作用。為進(jìn)一步證實(shí)大蒜素是否可能通過調(diào)節(jié)kcs分泌功能 來改善肝組織慢性損傷，實(shí)驗(yàn)中以高脂飲食復(fù)制慢性肝損傷 模型。檢測結(jié)果表明，模型組大鼠發(fā)生脂肪肝炎時，血漿促 炎因子il 6、tnf a明顯升高而抑炎因子il 10顯著 降低，大蒜素可抑制il 6水平的升高。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步 證實(shí)，大蒜素可降低kcs對il 6、tnf a的表迗

10、，在提 高il 10的表達(dá)方面作用十分顯著。說明大蒜素可通過調(diào)節(jié)kcs的分泌，改善肝臟內(nèi)促炎因子與抑炎因子的失衡，參 與對肝臟慢性損傷的保護(hù)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1) yelley mounterma, cullenmf , bakermb, etoftheob eseprobuctonbodywe ightregulationinob obmice j. science，1995,269:540-543.2 yangsq,linhz,la nemd,etincreasetoe ndotoxinliverinjur y：implicationsforp athogenesis j . pro cncadacadsicusa, 19 97,94： 2557-2563.3 ) lefkowitchjh , hay thejh,regentcellag gregationandperive nlardistributionin steatohepatitis j . modpathol,2002,15 ： 699-704.4) faggi onir, shigenagaj,mo srea, etofucp2genee xpressionbylps：apotentialmechanismforincreasedthermogenesisdur