對古生菌硫磺礦硫化葉菌功能未知蛋白序列引物設(shè)計及PCR擴增

1、對古生菌硫礴礦硫化葉菌功能未知蛋白序列引物設(shè)計及pcr擴增生 112-1 劉群 201170502138【目的】根據(jù)vector nit suite 8軟件，利用所給古生菌硫磺礦硫化葉菌的16srrna,進行酶切，找出可以將其功能未知蛋白序列80709完整切下的酶，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳將這段序列找出，然后用這個軟件設(shè)計引物進行pcr擴增，從而用于以后各項分子生物學(xué)的研宄?！竟ぞ摺縱ector nti suite 8應(yīng)用此軟件可以對硫磺礦硫化葉菌的16srrna進行酶切，以及通過電泳選出功能未知蛋白序列，同時可通過一定程序設(shè)計出引物進行pcr擴增。這個軟件可以模擬真實情景，在網(wǎng)絡(luò)上完成酶切、電泳以

2、及引物的設(shè)計，簡化了實驗步驟使選擇過程更加的簡單、快捷?！静牧稀抗派虻V礦硫化葉菌的16srrna硫磺礦硫化葉菌（古生菌界，泉古菌門，熱變形菌綱，硫化葉菌目，硫化葉菌科，硫化葉菌屬）【方法步驟】1、利用vector nti suite 8軟件對硫磺礦硫化葉菌的全部的16srrna進行所有酶的酶切。2、根據(jù)上述酶切結(jié)果，以及電泳的結(jié)果找出可以將硫磺礦硫化葉菌的功能未知蛋白序列(80709)完整切下的酶，根據(jù)電泳的性質(zhì)找出該條帶。3、利用這個軟件設(shè)計出該序列的正向引物和反向引物，根據(jù)引物設(shè)計原則選擇出最適合的引物進行pcr擴增。利用vector nti suite 8軟件對硫磺礦硫化葉菌的全部的

3、16srrna進行酶切的結(jié)果如下：1)5)5)8)0)0)afaafaadebstlz316bfro)l (11207)07)12)12)1 (11312)141 (11312)11312)11(11312)11312)12)12)12)11312)12)17)68)68)681 (11839)ti (11935)ai (11935)1 (11935)硫磺礦硫化葉菌12389 bp尋找可以將硫磺礦硫化葉菌的功能未知蛋白序列完整切下的酶分析：1、由于將功能未知蛋白序列切不之后還要設(shè)計引物進行擴增，因此在這段80-709序列前后仍要保留一段序列，防止我們所需要的序列在擴增之后被切除。因此這段序列的

4、前邊不需要進行酶切，保留80之前的片段，只需要在709之后尋找一個酶，使這個酶在709之后有一個酶切位點而在80-709之間不存在酶切位點。這樣既可以保證這段序列被完整的切下，又可以確保在下一步設(shè)計引物進行擴增完成切掉引物后這段序列 不會被切除。2、根據(jù)上圖可以看出，bstlz316l和adel在980處都有酶切位點，因此用這兩種酶分別進行酶切，用這兩種酶分別進行酶切的結(jié)果如下：bstiz硫磺礦硫化葉菌12389 bpade硫礴礦硫化葉112389 bp由上圖可以看出：酶bstlz316l和adel這兩種酶在這段rna序列上只有一個酶切位點，均在980處，可以將我們所需要的序列完整的切下，因此

5、為獲得這段完整的rna序列，我們可以選取這兩種酶屮的任意一種進行酶切。4、然后分別將這兩種酶的酶切結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下圖：bstlz316l酶切電泳結(jié)果adel酶切電泳結(jié)果從電泳結(jié)果可以看出，這兩種酶均能將這段序列切成兩段，推斷它們就只有在980處這一個酶切位點，因此這兩種酶均可成功的將這段我們所需要的蛋tl序列切下來。這兩段序列分別是1 一980, 98112389.根據(jù)電泳的性質(zhì)，相對分子質(zhì)量小的條帶在電泳時移動的速度快，因此可回收那段在前面的條帶（也可根據(jù)分子量的大小選擇分子量小的那個條帶），即我們所需耍的該古生菌的功能未知蛋白序列。收集完條帶之后我們需要進行引物的設(shè)計來對其

6、進行擴增：引物設(shè)計的基木原則為:a長度在1835bp，gc含量在40%60%之間，內(nèi)部無發(fā)卡結(jié)構(gòu)b引物之間避免形成二聚體；c引物3端和模板之間不應(yīng)少于12個連續(xù)堿基相匹配；d在模板基因內(nèi)部不應(yīng)有和引物對中任一條引物相似的片斷；有時需要在引物的3端加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c。e. 引物3'端不能選擇a，最好選擇t。f. 引物的5"端可以修飾，而3'端不可修飾。引物的5'端決定著pcr產(chǎn)物的長度，引物5'端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、eu34等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合dna序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等首先運用vector

7、nti suite 8軟件進行正向引物的設(shè)計，輸出的三個引物分別是：pcr analysis#1: product of length 66 (rating: 153) contains region of the moleculefrom 3 to 68tm: 58.4 c taopt: 38.1 c gc: 21.2 senseprimer:a at ctt cc a attattt c agtagsimilarity: 100.0% length: 22tm: 42.4 c gc: 27.3 dh: -161.7 kcal/mol ds: -432.9 cal/mol dg: -30.9

8、kcal/mol antisense primer:tt c a a acta a a ac at c a a a asimilarity: 100.0%length: 20 tm: 40.4 c gc: 20.0 dh: -145.9 kcal/mol ds: -388.7 cal/mol dg: -28.2 kcal/mol tm difference: 2.1 gc difference: 7.3 #2: product of length 67 (rating: 153) contains region of the molecule from 3 to 69tm: 58.4 c ta

9、opt: 38.1 c gc: 20.9 sense primer:aatcttccaattatttcagtag similarity: 100.0% length: 22 tm: 42.4 cgc: 27.3 dh: -161.7 kcal/mol ds: -432.9 cal/mol dg: -30.9 kcal/molantisense primer:ttt c a a acta a a ac at c a a a similarity: 100.0%length: 20 tm: 40.4 c gc: 20.0 dh: -145.9 kcal/mol ds: -388.7 cal/mol

10、dg: -28.2 kcal/mol tm difference: 2.1 gc difference: 7.3#3: product of length 66 (rating: 153) contains region of the moleculefrom 3 to 68tm: 58.4 c taopt: 38.1 c gc: 21.2 senseprimer:a at ctt cc a attattt c agtagtsimilarity: 100.0% length: 23tm: 43.8 c gc: 26.1 dh: -168.2 kcal/mol ds: -450.2 cal/mo

11、l dg: -32.2kcal/mol antisense primer:tt c a a acta a a ac at c a a a asimilarity: 100.0%length: 20 tm: 40.4 c gc: 20.0 dh: -145.9 kcal/mol ds: -388.7 cal/moldg: -28.2 kcal/mol tm difference: 3.4 gc difference: 6.1然后繼續(xù)利用該軟件進行反向引物的設(shè)計，輸出的結(jié)果如下：pcranalysis#1: product of length 233 (rating: 153) contains

12、region of themolecule from 711 to 943tm: 68.8 c taopt: 45.5 c gc:28.8 sense primer:aattcatgcatattaaattactsimilarity: 100.0%length: 22 tm: 40.8 c gc: 18.2 dh: -164.0 kcal/mol ds: -442.0 cal/moldg: -30.4 kcal/mol antisense primer:gctgtaatatattttggtacttasimilarity: 100.0% length: 23 tm: 41.2 c gc: 26.1

13、 dh: -170.1 kcal/mol ds: -459.6 cal/mol dg: -31.3 kcal/mol tm difference: 0.4 gcdifference: 7.9 #2: product of length 233 (rating: 153) contains region ofthe molecule from 711 to 943tm: 68.8 c taopt: 45.6 c gc:28.8 sense primer:aattcatgcatattaaattacta similarity: 100.0%length: 23 tm: 41.5 c gc: 17.4

14、 dh: -170.0 kcal/mol ds: -458.9 cal/moldg: -31.4 kcal/mol antisense primer:gctgtaatatattttggtacttasimilarity: 100.0%length: 23 tm: 41.2 c gc: 26.1 dh: -170.1 kcal/mol ds: -459.6cal/mol dg: -31.3 kcal/mol tm difference: 0.3 gc difference: 8.7 #3: productof length 233 (rating: 153) contains region of

15、the molecule from 711 to943tm: 68.8 c taopt: 45.6 c gc: 28.8 sense primer:aattcatgcatattaaattacta asimilarity: 100.0% length: 24 tm: 43.4c gc: 16.7 dh: -179.1 kcal/mol ds: -482.9 cal/mol dg: -33.3 kcal/molantisense primer:gctgtaatatattttggtacttasimilarity: 100.0%length: 23 tm: 41.2 c gc: 26.1 dh: -170.1 kcal/mol ds: -459.6 cal/moldg: -31.3 kcal/mol tm difference: 2.2 gc difference: 9.4根據(jù)引物設(shè)計的原則，從以上引物巾選擇出一個合適的引物正向引物為：#1: product of length 233 (rating: 153)sense primer:aatt