限制性酶切方式及連接ppt課件

1、 限制酶切方式及銜接1.1 單酶切1.2 雙酶切1.3 部分酶切1.4 完全酶切1.1 單酶切 假設(shè)DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，產(chǎn)生與識(shí)別序列n一樣的DNA片段數(shù)。 假設(shè)DNA樣品是LDNA片段，完全酶切產(chǎn)生n+1個(gè)DNA片段。 1.1 單酶切 酶切體系： 13L ddH2O 反響體系 2L 10buffer 4L 底物DNA 1L 限制酶 總體積：20L 酶切步驟： 加樣； 搖勻，短時(shí)離心； 反響13h； 反響終止。 65水浴1015min1.2 雙酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。 環(huán)狀DNA分子完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生DNA片段數(shù)是兩種限制酶識(shí)別序列數(shù)之和。 線性DNA分子完全酶

2、切的結(jié)果，產(chǎn)生DNA片段數(shù)是兩種限制酶識(shí)別序列數(shù)加1. 雙酶切可以在不同的反響系統(tǒng)中進(jìn)展。A 需求較低鹽濃度的酶先切割，然后升高鹽濃度，另一個(gè)酶切割；B 最適反響溫度較低的酶先切割，然后升高溫度，另一個(gè)酶切割；C 第一個(gè)酶切割后，經(jīng)凝膠電泳回收DNA，再選用適宜反響系統(tǒng)，進(jìn)展第二個(gè)酶的切割。 D 雙酶切在同一個(gè)反響系統(tǒng)中。 1.3 部分酶切 指限制酶對(duì)其在DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)展不完全的切割。 用途：當(dāng)某種限制酶的多個(gè)識(shí)別序列之中有一個(gè)識(shí)別序列恰好在回收待用的DNA片段上，假設(shè)完全酶切，將此DNA片段從中切斷。 為理處理這個(gè)問(wèn)題，就需求用到部分酶切，以滿足實(shí)驗(yàn)的需求。 2 限制酶切后的銜

3、接2.1 DNA ligase: 能催化dsDNA片段緊靠在一同的3羥基末端與5磷酸基團(tuán)末端之間構(gòu)成磷酸二酯鍵，使兩末端銜接的一種核酸酶。目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA ligase重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連2.2 DNA片段之間的銜接 具互補(bǔ)黏性末端之間的銜接 具平末端之間的銜接5GGACTG-0H P-AATTCTGCAA-33CCTGACTTAA-P 0H-GACGTT-5 E.coR I 切割 E.coR I切割 DNA ligase 5GGACTGAATTCTGCAA-3 3CCTGACTTAAGACG

4、TT-5 E.coR I 識(shí)別序列結(jié)論： 待銜接的兩個(gè)DNA片段的末端假設(shè)是用同一個(gè)酶切割的，銜接后仍保管原限制酶的識(shí)別序列。 Bam H切割反響切割反響 GGATCC CCTAGGT4 DNA ligase GATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCG

5、GATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)銜接同一限制酶切位點(diǎn)銜接不同限制酶切位點(diǎn)的銜接不同限制酶切位點(diǎn)的銜接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA ligase 重組體重組體 5CAAGCTCA3 5GTAGCTTA3 3GTTCGAGT5 3CATCGAAT5 AluI AluI P-CTCA-3 5CAAG-OH P-CTTA3 5GTAG-OH OH-GAGT5 3GTTC-P OH-GAAT-5 3CATC-P T4 DNA ligase 5CA AGCT TA-3 3GT TCGA AT-5 AluI AGCT Hind AAGCTT結(jié)論： 假設(shè)