限制性酶切方式及連接ppt課件

1、 限制酶切方式及銜接1.1 單酶切1.2 雙酶切1.3 部分酶切1.4 完全酶切1.1 單酶切 假設(shè)DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，產(chǎn)生與識別序列n一樣的DNA片段數(shù)。 假設(shè)DNA樣品是LDNA片段，完全酶切產(chǎn)生n+1個DNA片段。 1.1 單酶切 酶切體系： 13L ddH2O 反響體系 2L 10buffer 4L 底物DNA 1L 限制酶 總體積：20L 酶切步驟： 加樣； 搖勻，短時離心； 反響13h； 反響終止。 65水浴1015min1.2 雙酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。 環(huán)狀DNA分子完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生DNA片段數(shù)是兩種限制酶識別序列數(shù)之和。 線性DNA分子完全酶

2、切的結(jié)果，產(chǎn)生DNA片段數(shù)是兩種限制酶識別序列數(shù)加1. 雙酶切可以在不同的反響系統(tǒng)中進(jìn)展。A 需求較低鹽濃度的酶先切割，然后升高鹽濃度，另一個酶切割；B 最適反響溫度較低的酶先切割，然后升高溫度，另一個酶切割；C 第一個酶切割后，經(jīng)凝膠電泳回收DNA，再選用適宜反響系統(tǒng)，進(jìn)展第二個酶的切割。 D 雙酶切在同一個反響系統(tǒng)中。 1.3 部分酶切 指限制酶對其在DNA分子上的全部識別序列進(jìn)展不完全的切割。 用途：當(dāng)某種限制酶的多個識別序列之中有一個識別序列恰好在回收待用的DNA片段上，假設(shè)完全酶切，將此DNA片段從中切斷。 為理處理這個問題，就需求用到部分酶切，以滿足實驗的需求。 2 限制酶切后的銜

3、接2.1 DNA ligase: 能催化dsDNA片段緊靠在一同的3羥基末端與5磷酸基團(tuán)末端之間構(gòu)成磷酸二酯鍵，使兩末端銜接的一種核酸酶。目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA ligase重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連2.2 DNA片段之間的銜接 具互補(bǔ)黏性末端之間的銜接 具平末端之間的銜接5GGACTG-0H P-AATTCTGCAA-33CCTGACTTAA-P 0H-GACGTT-5 E.coR I 切割 E.coR I切割 DNA ligase 5GGACTGAATTCTGCAA-3 3CCTGACTTAAGACG

4、TT-5 E.coR I 識別序列結(jié)論： 待銜接的兩個DNA片段的末端假設(shè)是用同一個酶切割的，銜接后仍保管原限制酶的識別序列。 Bam H切割反響切割反響 GGATCC CCTAGGT4 DNA ligase GATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCG

5、GATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點銜接同一限制酶切位點銜接不同限制酶切位點的銜接不同限制酶切位點的銜接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA ligase 重組體重組體 5CAAGCTCA3 5GTAGCTTA3 3GTTCGAGT5 3CATCGAAT5 AluI AluI P-CTCA-3 5CAAG-OH P-CTTA3 5GTAG-OH OH-GAGT5 3GTTC-P OH-GAAT-5 3CATC-P T4 DNA ligase 5CA AGCT TA-3 3GT TCGA AT-5 AluI AGCT Hind AAGCTT結(jié)論： 假設(shè)