第八章、蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

1、第八章第八章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)和氨基酸的測定 蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由很大。主要由C C、H H、O O、N N、S S五種元素組五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的 P P、CuCu、FeFe、I I 等。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人等。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體體11%11% 13%13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動物、總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物

2、直接影響食品的色、香、味。與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。 一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為為 20.0%20.0%左右，豬肉左右，豬肉 9.5%,9.5%,兔肉兔肉 21%,21%,雞雞肉肉 20%20%，牛乳，牛乳 3.5%,3.5%,帶魚帶魚 18.0%,18.0%,大豆大豆 40%40%，面粉面粉 9.9%,9.9%,菠菜菠菜 2.4%,2.4%,黃瓜黃瓜 1.0%,1.0%,蘋果蘋果 1.4% 1.4% 。 測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的

3、營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。制均具有極其重要的意義。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)測測定方法分兩大類：定方法分兩大類：一類一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量另一類另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測定酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量。具體測定方法有：具體測定方法有：凱氏定氮法凱氏定

4、氮法雙縮脲法雙縮脲法染料結(jié)合法染料結(jié)合法酚試劑法酚試劑法紫外分光光度法紫外分光光度法水揚(yáng)酸比色法水揚(yáng)酸比色法折光法折光法旋光法旋光法 蛋白質(zhì)的測定，目前多采用將蛋蛋白質(zhì)的測定，目前多采用將蛋白質(zhì)消化，測定其含氮量，再乘一個白質(zhì)消化，測定其含氮量，再乘一個蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)換算系數(shù)換算為蛋白質(zhì)含量的換算系數(shù)換算為蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法。凱氏定氮法。不同的蛋白質(zhì)其氨基酸不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，各種不同的蛋構(gòu)成比例及方式不同，各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量不同，白質(zhì)其含氮量不同，所以不同食品的所以不同食品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)有所不同。蛋白質(zhì)換算系數(shù)有所不同。 在食品和生物材料中的氮包括蛋在食品和生物

5、材料中的氮包括蛋白質(zhì)氮，還包括有非蛋白質(zhì)氮，如核白質(zhì)氮，還包括有非蛋白質(zhì)氮，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮的色素等類脂、卟啉和含氮的色素等, ,所以凱氏所以凱氏定氮法測定的只能稱為粗蛋白含量。定氮法測定的只能稱為粗蛋白含量。一、凱氏定氮法一、凱氏定氮法 凱氏定氮法凱氏定氮法由由KieldhlKieldhl于于18331833年提出，年提出，是是測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡操作較為簡單的方法之一，可用于所單的方法之一，可用于所有動、植物食品有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析及各種加工食品的分析的分析，可同時測

6、，可同時測定多個樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是定多個樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個經(jīng)典分析個經(jīng)典分析方法，至今仍方法，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。方法?，F(xiàn)發(fā)展為常量、微量、半微量法、現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、半微量法、改良凱氏法及自動定氮儀法。書中只介紹改良凱氏法及自動定氮儀法。書中只介紹前三種。前三種。 （一）常量凱氏定氮法（一）常量凱氏定氮法（1 1）原理）原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)

7、合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。使氨蒸出。）用）用H H3 3BOBO3 3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HClHCl溶液滴定。溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。量。也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H H2 2SOSO4 4或標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)HClHCl溶溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOHNaOH滴定過量的酸。滴定過量的酸。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4+6CO+6CO2 2+12SO+12SO2 2+16H+16H2 2O O一定要用濃硫酸（一

8、定要用濃硫酸（98%98%）總反應(yīng)式：總反應(yīng)式：為了加快消化速度，縮短消化時間常加入以下物為了加快消化速度，縮短消化時間常加入以下物質(zhì)質(zhì)硫酸鉀硫酸鉀：加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快快有機(jī)物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提有機(jī)物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度一般純硫酸的沸點在高反應(yīng)溫度一般純硫酸的沸點在340340左右，而添左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到加硫酸鉀后，可使溫度提高到400400以上，原因主以上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解 ，水分，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大不斷逸出而

9、使硫酸鉀濃度增大 ，故沸點升高，其，故沸點升高，其反應(yīng)式如下：反應(yīng)式如下： K K2 2SOSO4 4+H+H2 2SOSO4 4=2KHSO=2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4=K=K2 2SOSO4 4+H+H2 2O+SOO+SO3 3 但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：生熱分解而造成損失： （NH4NH4）2 2SOSO4 4=NH=NH3 3+(NH+(NH4 4)HSO)HSO4 4 2(NH2(NH4 4)HSO)HSO4 4=2NH=2NH3 3

10、+2SO+2SO3 3+2H+2H2 2O O除硫酸鉀外也可加入無水硫酸鈉，氯化鉀除硫酸鉀外也可加入無水硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。催化劑催化劑 C+2CuSOC+2CuSO4 4=Cu=Cu2 2SOSO4 4+SO+SO2 2+O+O2 2CuCu2 2SOSO4 4+2H+2H2 2SOSO4 4=2CuSO=2CuSO4 4+2H+2H2 2O+SOO+SO2 2 指示指示消化消化終點的到達(dá)終點的到達(dá)此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，后，不再不再有硫酸亞銅有硫酸亞銅（褐色）（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)

11、清澈生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)的藍(lán)綠色綠色, ,可以指示可以指示消化消化終點的到達(dá)終點的到達(dá)。下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)（加堿是否足量）加堿是否足量）的指示劑。的指示劑。 可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦來代替硫酸銅。粉、二氧化鈦來代替硫酸銅。氧化劑：氧化劑：如雙氧水、次氯酸鉀、高錳酸鉀如雙氧水、次氯酸鉀、高錳酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。等加速有機(jī)物氧化速度。 消化時要防止爆沸，直到消化到溶液消化時要防止爆沸，直到消化到溶液的顏色為藍(lán)綠色或綠色透明為止。的顏色為藍(lán)綠色或綠色透明為止。用用4%硼酸吸收或用過量的硼酸吸收或用過

12、量的 H2SO4 或或 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收液吸收，）用硼酸吸收用硼酸吸收）用過量的用過量的 H H2 2SOSO4 4 或或 HCl HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收H2SO4（或（或HCl） Cl） 滴定滴定）加熱蒸餾所放出的氨，用加熱蒸餾所放出的氨，用4%4%硼酸吸收完全后，硼酸吸收完全后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲甲基紅基紅溴甲基酚綠混合指示劑溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭）國標(biāo)用亞甲基蘭+ +甲基紅。甲基紅。 指示劑紅色指示劑紅色 綠色綠色 紅色紅色 （酸）（酸） （堿）（堿） （酸）（酸）因硼酸呈微弱酸性（因硼酸呈

13、微弱酸性（k k5.85.81010-10-10），用酸滴定），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，滴定的反應(yīng)方程式如下：滴定的反應(yīng)方程式如下：吸收吸收滴定滴定）用過量的用過量的 H H2 2SOSO4 4 或或 HCl HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用吸收，再用 NaOH NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用的酸液，用甲基紅指示劑甲基紅指示劑。奈氏試劑奈氏試劑NesslerNessler試劑，試劑，K K2 2（HgI4HgI4） 檢驗檢驗NHNH4 4+ +離子，遇銨根，離子離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀

14、。析出黃色或紅棕色沉淀。試劑試劑 硫酸銅硫酸銅硫酸鉀硫酸鉀硫酸硫酸 40 40gLgL硼酸硼酸溶液溶液； 混合指示劑：混合指示劑：1 1gLgL甲基紅乙醇甲基紅乙醇溶液與溶液與1 1gLgL甲基藍(lán)乙醇甲基藍(lán)乙醇 溶液，臨用時溶液，臨用時按按2 2：1 1的比例混合?；蛘叩谋壤旌稀；蛘? 1gLgL甲基紅乙甲基紅乙醇溶液與醇溶液與1 1gLgL溴甲溴甲酚酚綠乙醇溶液，臨用綠乙醇溶液，臨用時按時按1 1：5 5的比例混合的比例混合； 400 400gLgL氫氧化氫氧化鈉鈉；0 0. .1molL1molL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（4 4）操作步驟）操作步驟 準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品準(zhǔn)確稱取均勻的固

15、體樣品0.50.53 3g,g,或或半固體樣品半固體樣品2 25 5g,g,或吸取溶液樣品或吸取溶液樣品15152525mlml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中小心移入干燥的凱氏燒瓶中( (勿粘附勿粘附在瓶壁上在瓶壁上) )。加入。加入0.50.51 1g g硫酸銅硫酸銅、1010g g硫酸硫酸鉀及鉀及2525mlml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸一小漏斗，瓶頸4545角傾斜置電爐上，在角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。先以小火緩慢加熱，先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠

16、色。取下漏斗，繼續(xù)力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱加熱0.50.5h h，冷卻至室溫。冷卻至室溫。，冷凝管下端浸入接受瓶冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶內(nèi)預(yù)先裝有液面之下（瓶內(nèi)預(yù)先裝有5050ml40ml40 gLgL硼酸溶液及硼酸溶液及混合指示劑混合指示劑5 5 6 6滴）。滴）。 在在 常量凱氏定氮蒸留裝置常量凱氏定氮蒸留裝置 滴定滴定 將接受瓶內(nèi)的硼酸液用將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.10.1mol/Lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。同時做一鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。操作完全相同）。100014.

17、0)(12mFVVcW(5) (5) 結(jié)果計算結(jié)果計算式中式中： WW蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，% %； c c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/Lmol/L； V V1 1空白滴定消耗空白滴定消耗酸酸標(biāo)準(zhǔn)液量，標(biāo)準(zhǔn)液量，mLmL； V V2 2樣液樣液滴定消耗滴定消耗酸酸標(biāo)準(zhǔn)液量，標(biāo)準(zhǔn)液量，mLmL； m m樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量，g g； 0.014 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mmol； F F蛋白質(zhì)系數(shù)。蛋白質(zhì)系數(shù)。（6 6）注意事項：）注意事項：所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制, ,凱凱氏燒瓶和小漏斗必須是干燥

18、的。氏燒瓶和小漏斗必須是干燥的。消化時不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，消化時不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。損失。 消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進(jìn)其消化完全。洗下，并促進(jìn)其消化完全。 樣品中若含糖、脂肪較多時，消化過樣品中若含糖、脂肪較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用

19、小火加熱，并時時外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強(qiáng)度。油消泡劑，并同時注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入凱氏燒瓶冷卻，加入3030過氧化氫過氧化氫2-3m1 2-3m1 后再繼續(xù)加熱消化。后再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大，如干試樣超過若取樣量較大，如干試樣超過5g5g可按可按每克試樣每克試樣5m15m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。般消化至呈透明后，繼續(xù)消化般消化至呈透明后，繼續(xù)消化3030分鐘分鐘即可，但對于含有

20、特別難以氨化的氮化合即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。蒸餾裝置不能漏氣蒸餾裝置不能漏氣, ,小漏斗要用水封保小漏斗要用水封保持其氣密性。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管持其氣密性。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸下端提離液面清洗管口，再蒸1 1分鐘后關(guān)分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。掉熱源否則可能

21、造成吸收液倒吸。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在70709090時發(fā)黑。時發(fā)黑。硫酸銅最好除去結(jié)晶水后再用。硫酸銅最好除去結(jié)晶水后再用。（二）微量凱氏定氮法（二）微量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法的原理與操作方微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與常量法基本相同，所不同的是法，與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測定的定型儀器適于微量測定的定型儀器微量凱微量凱氏定氮器。氏定氮器。100100ml

22、ml凱氏燒瓶。凱氏燒瓶。微量凱氏定氮器。微量凱氏定氮器。 20 20g/Lg/L硼酸溶液。硼酸溶液。 400 400g/Lg/L氫氧化鈉。氫氧化鈉。 1 1g/Lg/L甲基紅乙醇溶液與甲基紅乙醇溶液與1 1g/Lg/L溴甲酚綠溴甲酚綠 乙醇溶液，臨用時按乙醇溶液，臨用時按1 1：5 5混合?；旌?。 0.010000.01000mol/Lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 其他試劑同常量法。其他試劑同常量法。樣品消化步驟同常量法。將消化完全樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100100容量瓶中，容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。加蒸餾水至刻度，搖勻。

23、蒸餾蒸餾吸收吸收 按圖安裝好按圖安裝好微量定微量定氮蒸餾裝置。氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/32/3容積處，容積處，加加甲基紅甲基紅指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈以保持水呈紅色紅色，加入數(shù)粒玻璃珠，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。在加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。在加入加入1010mlml2 20g/L0g/L硼酸及硼酸及2 2滴混合滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。 樣品樣品由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)室。再量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)

24、室。再從進(jìn)樣口加入從進(jìn)樣口加入1010ml ml 400400g/Lg/L氫氧化鈉使氫氧化鈉使呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次，呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次，蓋塞，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。蒸餾至吸收液蓋塞，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑酒紅色變?yōu)橹兴拥幕旌现甘緞┚萍t色變?yōu)樘m綠色蘭綠色開始記時，繼續(xù)蒸餾開始記時，繼續(xù)蒸餾10-15min10-15min后，將冷后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾凝管尖端提離液面再蒸餾1min1min，用蒸餾，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。 微量凱氏定氮蒸留裝置微量凱氏定氮蒸留裝置微量凱氏定氮蒸餾裝置微量凱氏定氮蒸餾裝置 取

25、下接受瓶取下接受瓶，以，以0.010000.01000mol/Lmol/L鹽酸鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰紫色灰紫色為終點。為終點。 (V (V1 1-V-V0 0) )C C0.0140.014 X= X= F F100100 V V2 2 m m 100 100式中：式中：WW蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，% %；V V0 0滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mLmL；V V1 1滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mLmL；V V2 2蒸餾時吸取樣品稀釋液體積，蒸餾時吸取樣品稀釋液體積，mLmL；CC鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液

26、的濃度，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/Lmol/L；0.0140.014氮的毫摩爾質(zhì)量，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mmol；FF蛋白質(zhì)系數(shù)；蛋白質(zhì)系數(shù)；mm樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量，g g。改良式凱氏定氮裝置改良式凱氏定氮裝置（三）自動凱氏定氮法（三）自動凱氏定氮法1 1、原理、原理 同前。同前。2 2、特點、特點（1 1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐?；?，紅外線加熱的消化爐。（2 2）快速：一次可同時消化）快速：一次可同時消化8 8個樣品，個樣品，3030分鐘可消化完畢。分鐘可消化完畢。（3 3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和）自動：自

27、動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置。可計算總氮百滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，分含量并記錄，1212分鐘完成分鐘完成1 1個樣。個樣。北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司 產(chǎn)品名稱：產(chǎn)品名稱： 凱氏定氮儀凱氏定氮儀 二、雙縮脲法二、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時間，有度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時間，有環(huán)境污染。環(huán)境污染。新開發(fā)的：新開發(fā)的： 雙縮脲法、雙縮脲法、 紫外分光光度法紫外分光光度法 染料結(jié)合法、染料結(jié)合法、 水楊酸比色法等。水楊酸比色法等。1.1.原理原理脲（尿素）脲

28、（尿素）NHNH2 2CONHCONH2 2 加熱至加熱至150-150-160160時，兩分子縮和成雙縮脲。時，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）反應(yīng)） NHNH2 2CONHCONHCONHCONH2 2 + NH+ NH3 3 NHNH2 2CONHCONH2 2 + + NHNH2 2CONHCONH2 2蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH CONH 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件

29、下，其顏色有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計（光度計（540nm540nm）來測其吸光度，確定）來測其吸光度，確定含量。含量。注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲，樣品不用消化。加雙縮脲，樣品不用消化。2.2.方法特點及應(yīng)用范圍方法特點及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。等作物種子及

30、肉類等樣品測定。 3.3.主要儀器主要儀器: :分光光度計分光光度計, ,離心機(jī)離心機(jī)（4000 r/min4000 r/min） 4.4.試劑：試劑：（1 1）標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（）標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（5 mg/ml5 mg/ml） （2 2）雙縮脲試劑：溶解）雙縮脲試劑：溶解1.501.50克硫酸銅克硫酸銅（CuSO45H2OCuSO45H2O）和）和6.06.0克酒石酸鉀鈉克酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O64H2ONaKC4H4O64H2O）于）于500ml500ml水中，水中，在攪拌下加入在攪拌下加入300ml10%300ml10%氫氧化鈉溶液，氫氧化鈉溶液，用水稀釋到用水稀釋到1 1升，貯存在

31、內(nèi)壁涂以石臘升，貯存在內(nèi)壁涂以石臘的瓶中。的瓶中。5 5、操作方法、操作方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一系列試管，分別加入取一系列試管，分別加入0 0， 0.4, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0ml0.8, 1.2, 1.6, 2.0ml的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（作為標(biāo)準(zhǔn)用的應(yīng)當(dāng)用凱氏定氮法測定蛋（作為標(biāo)準(zhǔn)用的應(yīng)當(dāng)用凱氏定氮法測定蛋白氮含量白氮含量, ,以確定酪蛋白的純度），用水補(bǔ)以確定酪蛋白的純度），用水補(bǔ)足到足到2ml2ml，然后加入，然后加入4ml4ml雙縮脲試劑在室溫雙縮脲試劑在室溫下（下（15152525）放置）放置30min30min，于，于540nm54

32、0nm波波長下用長下用7272型分光光度計比色測定。最后以型分光光度計比色測定。最后以光密度為縱坐標(biāo)，酪蛋白的含量為橫坐標(biāo)光密度為縱坐標(biāo)，酪蛋白的含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量的依據(jù)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量的依據(jù)。 未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定 未知樣品必須進(jìn)行稀釋調(diào)整，使未知樣品必須進(jìn)行稀釋調(diào)整，使2ml2ml中含有中含有1 110mg10mg蛋白質(zhì)，才能進(jìn)進(jìn)測定。蛋白質(zhì)，才能進(jìn)進(jìn)測定。吸取吸取1ml 1:101ml 1:10稀釋的待測液，用水補(bǔ)足稀釋的待測液，用水補(bǔ)足到到2ml2ml。操作同前，平行做兩份。與標(biāo)準(zhǔn)。操作同前，平行做兩份。與標(biāo)準(zhǔn)曲線的各管同時比色。比色

33、后從標(biāo)準(zhǔn)曲曲線的各管同時比色。比色后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)濃度，再按照稀釋倍線上查出其蛋白質(zhì)濃度，再按照稀釋倍數(shù)求出樣品的蛋白質(zhì)含量。數(shù)求出樣品的蛋白質(zhì)含量。三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1原理：由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙原理：由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)具有吸鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，最大吸收峰在收紫外光的性質(zhì)，最大吸收峰在280nm280nm波長波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度度OD280nmOD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，可作定量與其濃度呈正比關(guān)系，可作定量測定。測定。2 2適用范

34、圍：常用于生物化學(xué)工作，因為適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。廣泛。3 3主要儀器：主要儀器： 紫外分光光度計紫外分光光度計 離心機(jī)（離心機(jī)（3000 5000 r/min3000 5000 r/min）4 4試劑試劑（1 1）標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱）標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制成濃度為成濃度為1mg/mL1mg/mL的溶液。的溶液。（2 2）待測蛋白質(zhì)溶液：濃度為）待測蛋白質(zhì)溶液：濃度為1mg/mL1mg/mL左右左右的溶液。的溶液。5

35、5操作：操作：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用凱氏法測定蛋白質(zhì)純標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用凱氏法測定蛋白質(zhì)純度的標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線度的標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線. .分別向分別向8 8支試管內(nèi)依支試管內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(1mg/mL)0,0.5,1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.(1mg/mL)0,0.5,1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,0,再加入蒸餾水至總體積為再加入蒸餾水至總體積為4mL(4mL(相當(dāng)于蛋相當(dāng)于蛋白質(zhì)濃度為白質(zhì)濃度為0.125,0.25,0.375,0.50,0.6250.75,1.0m0.125,0.25,0.375,0.50,0.6250.75,1.0mg/mL

36、g/mL ，混勻。以光程為，混勻。以光程為1cm1cm的石英比色杯，的石英比色杯，在在280nm280nm波長處測定各管溶液的光密度值波長處測定各管溶液的光密度值OD280nmOD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定樣品測定 取待測蛋白質(zhì)溶液取待測蛋白質(zhì)溶液1mL1mL，加入蒸餾，加入蒸餾水水3mL3mL，混勻，按上述方法測定，混勻，按上述方法測定280nm280nm的光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出的光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出待測蛋白質(zhì)溶液的濃度。待測蛋白質(zhì)溶液的濃度。6 6、注意事項、注意事項

37、紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量迅速、簡便、紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用其在柱層析分離純化中，常用280nm280nm進(jìn)行紫進(jìn)行紫外檢測，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但外檢測，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法的缺點是對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中該法的缺點是對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)一定的誤差。故該法適于測定

38、與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)，若樣品中含有嘌氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)，若樣品中含有嘌呤、嘧啶（也就是說樣品中含有較多量的核呤、嘧啶（也就是說樣品中含有較多量的核酸）等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。酸）等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。 蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，雖然從各種天成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，雖然從各種天然源中分離得到的氨基酸已達(dá)然源中分離得到的氨基酸已達(dá)175175種以種以上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的中的2020種

39、，而在構(gòu)成的氨基酸中，亮氨種，而在構(gòu)成的氨基酸中，亮氨酸、酸、 異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨算、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8 8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠食品供給，故被稱為必需氨基酸，它們食品供給，故被稱為必需氨基酸，它們對人體有著極其重要的生理功能，常會對人體有著極其重要的生理功能，常會因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過補(bǔ)充因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。而增強(qiáng)了新陳代謝作用。 隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營養(yǎng)知識隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營養(yǎng)知識的普及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含的普

40、及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來愈得量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的效價而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對食品加工工藝的改革，對保理論，對食品加工工藝的改革，對保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。就具有極其重要的意義。一、雙指示劑甲醛滴定法一、雙指示劑甲醛滴定法 1.1.原理原理 氨基酸本身有堿性

41、氨基酸本身有堿性 NHNH2 2 基，又有酸性基，又有酸性 COOH COOH 基，成中性內(nèi)鹽，基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與加入甲醛溶液后，與 NHNH2 2 結(jié)合，堿結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定性消失，再用強(qiáng)堿來滴定 COOH COOH 基基, ,用用間接的方法測定氨基酸的總量。間接的方法測定氨基酸的總量。2 2方法特點及適用范圍方法特點及適用范圍 此法簡單易行、快速方便，在發(fā)酵工此法簡單易行、快速方便，在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基酸含量的業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基酸含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵

42、生產(chǎn)的及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高。定的化合物，使結(jié)果偏高。（適于食品中游離氨基酸的測定）（適于食品中游離氨基酸的測定）3 3試劑：試劑： 40%40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將劑，用氫氧化鈉將40%40%甲醛中和至藍(lán)色。甲醛中和至藍(lán)色。 0.1%0.1%百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液， 0.1%0.1%中性紅中性紅50%50%乙醇溶液，乙醇溶液， 0.1 mol/L 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4 4操作步驟操

43、作步驟 稱取粉碎樣品稱取粉碎樣品5-105-10克或液體樣品克或液體樣品5-5-10mL10mL，置于燒杯中，加入，置于燒杯中，加入50mL50mL水和活性炭水和活性炭5 5克，加熱煮沸過濾，用克，加熱煮沸過濾，用30-40mL30-40mL熱水洗滌熱水洗滌活性炭，收集濾液于三角瓶中，取樣品溶活性炭，收集濾液于三角瓶中，取樣品溶液液2 2份。份。 + 3+ 3滴中性紅指示劑，用滴中性紅指示劑，用0.1mol/L0.1mol/L氫氧氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴至由紅變?yōu)殓晟珵榛c標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點（中性紅終點（中性紅pH=7pH=7琥珀色），中和樣液中琥珀色），中和樣液中其它酸性物

44、質(zhì)。（游離酸）。其它酸性物質(zhì)。（游離酸）。 + 3+ 3滴百里酚酞滴百里酚酞+ + 中性甲醛中性甲醛20ml20ml，搖勻，搖勻，靜置靜置1 1分鐘，用分鐘，用0.1mol/L0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點（百里酚酞液滴定至淡藍(lán)色為終點（百里酚酞pH= pH= 9.3-10.49.3-10.4淡藍(lán)色），中和了樣液中氨基酸淡藍(lán)色），中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。（氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。（氨基酸+ + 游離酸游離酸 ） 二者之差可計算樣品中氨基酸含量。二者之差可計算樣品中氨基酸含量。5 5、結(jié)果計算、結(jié)果計算100014.0)(12mc

45、VV氨基酸態(tài)氮（氨基酸態(tài)氮（% %）式中：式中： c c 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;mol/L;V V1 1用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 的體積，的體積，mL;mL;V V2 2用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;mL;mm測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g g0.0140.014氮的毫摩爾質(zhì)量，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/m molg/m mol 6 6、注意事項、注意事項適用于有色樣品，加活性炭脫色。適用

46、于有色樣品，加活性炭脫色。加甲醛后立即滴定，不能放太久，加甲醛后立即滴定，不能放太久，防止甲醛聚合生成白色渾濁聚合物。防止甲醛聚合生成白色渾濁聚合物。樣品中含有酸式碳酸鹽時必須先加樣品中含有酸式碳酸鹽時必須先加0.1mol/L0.1mol/L的氫氧化鋇中和沉淀它后再的氫氧化鋇中和沉淀它后再加甲醛用氫氧化鈉滴定。加甲醛用氫氧化鈉滴定。二、單指示劑甲醛滴定法二、單指示劑甲醛滴定法操作：操作：稱取粉碎樣品稱取粉碎樣品5-105-10克或液體樣品克或液體樣品5-10mL5-10mL，置于，置于燒杯中，加入燒杯中，加入50mL50mL水和活性炭水和活性炭5 5克，加熱煮沸過克，加熱煮沸過濾，用濾，用30

47、-40mL30-40mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于三熱水洗滌活性炭，收集濾液于三角瓶中。角瓶中。在三角瓶中加入百里酚酞在三角瓶中加入百里酚酞3 3滴，用滴，用0.1mol/L0.1mol/L氫氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡蘭色為終點，記下所用氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡蘭色為終點，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)的氫氧化鈉的體積數(shù)V V1 1。（滴定樣品中自然存在。（滴定樣品中自然存在的游離酸）的游離酸）再在以上的三角瓶中加入再在以上的三角瓶中加入甲醛甲醛10mL10mL，快速搖勻，快速搖勻，用用0.1mol/L0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液再滴定至淡蘭色為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液再滴定至淡蘭色為終點，記下所用的氫氧

48、化鈉的體積數(shù)終點，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)V V2 2。 本法與雙指示劑法相比，只用了本法與雙指示劑法相比，只用了一種指示劑，在滴定時存在微量過量，一種指示劑，在滴定時存在微量過量，準(zhǔn)確度比雙指示劑法稍差。準(zhǔn)確度比雙指示劑法稍差。 式中：式中： c c 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;mol/L;V V1 1用百里酚酞作指示劑滴定樣品中自然存在用百里酚酞作指示劑滴定樣品中自然存在的游離酸時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，的游離酸時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;mL;V V2 2用百里酚酞作指示劑滴定氨基酸用百里酚酞作指示劑滴定氨基酸+ +游離酸游離酸時消耗氫氧化鈉

49、標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;mL;mm測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g g0.0140.014氮的毫摩爾質(zhì)量，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/m mol g/m mol 結(jié)果計算結(jié)果計算100014.0)(12mcVV氨基酸態(tài)氮（氨基酸態(tài)氮（% %）三、電位滴定法三、電位滴定法1.1.原理原理 將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計指示的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計指示的pHpH值為值為8.28.2為終點，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)為終點，記下所用

50、的氫氧化鈉的體積數(shù)V V1 1, ,此時滴定的是游離酸此時滴定的是游離酸, ,根據(jù)氨基酸的根據(jù)氨基酸的兩性作用兩性作用, ,再加入甲醛以固定氨基的堿性，再加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)使羧基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計指示的準(zhǔn)溶液滴定到酸度計指示的pHpH值為值為9.29.2為為終點終點, ,此時滴定的是氨基酸。此時滴定的是氨基酸。2. 2. 儀器儀器附磁力攪拌器的酸度計附磁力攪拌器的酸度計;25mL;25mL酸式滴定管酸式滴定管; 10mL; 10mL胖肚吸管。胖肚吸管。3.3.試劑試劑酚酞乙醇指示液：酚酞乙醇指示液：1%1%硼砂（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）緩

51、沖液：硼砂（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）緩沖液：PH9.22 PH9.22 甲醛：甲醛：36%-38%36%-38%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.0500mol/L0.0500mol/L4.4.試驗步驟試驗步驟吸取含氨基酸約吸取含氨基酸約20mg20mg的樣品溶液，置于的樣品溶液，置于100mL100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL20.0mL至燒杯中，加至燒杯中，加60mL60mL水，開動磁力攪水，開動磁力攪拌器，用拌器，用0.05mol/L0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示定至酸度計指示pH8.2pH8.2（記下消耗

52、（記下消耗0.05mol/L0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，可計算游離酸含量）?？捎嬎阌坞x酸含量）。加入加入0.1mL0.1mL甲醛溶液，混勻。再用甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至定至pH9.2pH9.2，記下消耗，記下消耗0.05mol/L0.05mol/L氫氧氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)（游離酸化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)（游離酸+ +氨基氨基酸）。酸）。同時取同時取80mL80mL水，先用水，先用0.05mol/L0.05mol/L氫氧氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至化鈉溶液調(diào)節(jié)至pHpH為為8.28.2，再加入，再加入10.0mL10.0mL甲醛溶液，用甲醛溶液，用0.05mol/L0.05mol/L氫氧化氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2pH9.2，做試劑空白，做試劑空白試驗。試驗。 本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定。對于混濁和色游離氨基酸含量測定