固定化蔗糖酶的研究

1、固定化蔗糖酚的研究摘要:利用海藻酸鈣凝膠球的包埋作用制備固定化蔗旃酶，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了初步研究, 結(jié)果表明，游離酶被固定化后，最適ph值為4. 0,雖適溫度為60°co在高ph值(ph8)和 高溫下，固定化酶比游離酚更穩(wěn)定；固定化酶的米氏常數(shù)(k49. ()5mmol / l)略大于游離酶 (k一4545erotol / l)；同時(shí)固定化酶明顯提高了游離酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。 關(guān)鍵詞：蔗糖酶；固定化；穩(wěn)定性蔗糖酶從酵母屮提取，蔗糖在蔗糖晦的作用下，能得到比蔗糖溶解度更高、不易有結(jié)晶析出 的高濃度轉(zhuǎn)化糖漿，還原力增加，甜度增加。蔗糖輛主要應(yīng)用于制備蔗糖轉(zhuǎn)化糖漿，還可用 于軟糖和巧

2、克力糖軟芯屮防止出現(xiàn)蔗糖結(jié)晶，另外蔗糖酶還可丿ij于從棉籽糖制備蜜二糖和從 菊粉屮制備果糖，以及降低果汁屮蔗糖含杲等。對(duì)酶進(jìn)行i古i定化開(kāi)辟了酶的許多新用途。蔗 糖酶的固定化國(guó)內(nèi)外研究相對(duì)較少。包埋法是酶固泄化的一種常見(jiàn)方法，條件溫和，操作簡(jiǎn) 單，對(duì)陋活性影響小，有利于小分子量底物的進(jìn)入和小分子量產(chǎn)物的擴(kuò)散，適合固定化。本 文利用包埋法就蔗糖酶的固定化及固定化酶的性質(zhì)作了初步研究。1材料與方法1 1材料蔗糖酶(實(shí)驗(yàn)室從酵母中提取)，明膠，海藻酸鈉，氯化鈣，戊二醛等。1. 2儀器磁力攪拌器，酸度計(jì)，恒溫水浴鍋等。1. 3方法1. 3. 1蔗糖酶的固定化3. 5mg蔗糖臨0. 4g氯化鈣，0. 5

3、g明膠溶jtoml醋酸鈣緩沖溶液(25mmol / l, ph4.4) 中，充分溶解，并降溫至5°c10°c,通過(guò)6號(hào)注射器的針頭將上述冷卻液以5cm的高度滴 入到looml的1 %(w / v)的海藻酸鈉溶液(用naoh調(diào)ph8)中，過(guò)濾約得1!2()()個(gè)微球。微 球在醋酸鈣緩沖溶液(25mmol / l, ph4. 4)中硬化3()min后，將微球置入到2()°c、1%戊二 醛溶液中進(jìn)一步硬化2h,用醋酸鈣緩沖溶液(25mmol/l, ph4. 4)洗滌后,固定化酶置于 用酷酸鈣緩沖溶液(25mmol / l, ph4. 4)中，貯存在0°c-5&

4、#176;c冰箱中準(zhǔn)備在實(shí)驗(yàn)中使用。 132蔗糖酶的活力測(cè)定12ml酶液(稀釋率1： 300, w/v)與108ml蔗糖溶液(120g/l, ph5. 5醋酸溶液)混合均勻, 37°c反應(yīng)lomino用dns法測(cè)定反m液屮還原糖的量。以煮沸酶液作對(duì)照，以lmin內(nèi)催化 釋放lumol還原糖的醜量為1個(gè)酶活單位(u)。固定化酶醜活測(cè)定的反應(yīng)體系同游離醜，取 適量固定化酶底物混合，均勻攪拌反應(yīng)lornin,離心后取上清液，用dns法測(cè)反應(yīng)液屮 還原糖的量。2結(jié)果與討論2. 1蔗糖酶的固定化2. 1. 1固定化酶活力回收率與加酶量的關(guān)系固定化酶活力回收率()指固定化酶總活力與用于固定化的游

5、離酶總活力的百分比，如圖1 示。固定化陸活力回收率與所用的廉糖腮的量有關(guān)，當(dāng)廉糖腮用量較低時(shí)，固定化陸活力回 收率較高，這對(duì)能是由于蔗糖在微球膜上的擴(kuò)散限制，并不能使所有的蔗糖酶都能發(fā)揮作用。圖1蔗糖酶用雖對(duì)固定化酶冋收率的影響2. 1. 2固定化ph值的選擇選擇不同的ph值進(jìn)行蔗糖酶固定化，分別測(cè)定固定化他活力回收率(),結(jié)果如圖2所示。 當(dāng)ph4. 4時(shí)，蔗糖酶活力冋收率最高。蔗糖酶的等電點(diǎn)為ph5, ph4. 4時(shí)蔗糖酶帶正電 荷。同時(shí)海藻酸鈉是糖醛酸的鈉鹽聚合物，在高ph值(ph8)t,將有更多白由的竣基與鈣、 蔗糖酶等結(jié)合。綜合分析，ph4. 4時(shí)，蔗糖酶活力冋收率最高。圖2不同ph

6、值對(duì)酶活力回收率的影響2. 2固定化酶的性質(zhì)2. 2. 1最適ph值在不同的ph值條件下，于40%分別測(cè)定在各利| ph值下的游離酶與固定化酶的酶活，其酶 活以不同ph值下的酶活占最適ph值酶活的比率表示，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可知，蔗糖醜 在ph4. 0時(shí)何最高水解速度，在ph5. 0時(shí)蔗糖酶仍保持較高的水解速度，在中性或微堿 條件下腮水解速度迅速降低，ph8. 0時(shí)，游離酶水解速度僅為最高時(shí)的10%。固定化陸在 ph3. 0時(shí)亦有最高水解速度，ph5. 0、ph6. 0時(shí)，固定化酶仍保持較高的水解速度，當(dāng) ph8.()時(shí)，凝膠變軟，酶水解速度僅為最高時(shí)的4()%。由于在ph3.()時(shí)容易引起蔗

7、糖的 自然水解，所以應(yīng)在ph4. 0和4. 5時(shí)進(jìn)行酶解反應(yīng)。由此可見(jiàn)，雖然游離酶與固定化醜 的最適ph值均為4. 0,但固定化陋的ph值范圍比游離臨要寬圖3 ph值、溫度對(duì)游離酶和i古i定化酶活力的影響2. 2. 2最適溫度在ph4. 0和不同的溫度情況下，分別測(cè)定游離酶與固定化酶的酶活，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3 可知，游離晦和固定化猶的最適溫度都為60°c,同吋固定化晦穩(wěn)定的溫度范圍比游離陋要 寬，說(shuō)明固定化酶対溫度的耐受能力增強(qiáng)。2. 2. 3米氏常數(shù)(km)與最人反應(yīng)速度用蔗糖作底物，分別以不同濃度(20mmol / l loommovl),在60°c、ph4. 0下測(cè)定

8、酶活 力，以lmin時(shí)測(cè)定的酶活力代表酶促反應(yīng)初速度，按lincwcavcrburk作圖法以1 / v對(duì)1 /s作圖，見(jiàn)圖4。根據(jù)肓線在橫軸上的截距(-1/k求出米氏常數(shù)k,結(jié)果表明固定化酚 的米氏常'數(shù)(km=49. 05mmovl)較游離fw(km=45. 45mmol / l)大，即固定化対底物的親 和力相對(duì)較小，這與固定化載體的空間障爲(wèi)和擴(kuò)散限制有關(guān)。固定化酶的最大反應(yīng)速度為 35. 2mg述原糖/ (mg酶5伽)較游離酶v=45. 45mg原糖/ (mg酶.min)小，這也與固定化 載體的空間障礙和擴(kuò)散限制冇關(guān)。2. 2. 4固定化卿的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性圖4 1/v與1

9、/s關(guān)系 在溫度為4°c時(shí)游離腮和固定化酶都穩(wěn)定，但在室溫下，10d后游離輛活性損失達(dá)15%,而 固定化酚活力沒(méi)有變化,這說(shuō)明該固定化酶具有良好的貯藏穩(wěn)定性。固定化酶重復(fù)分批使用, 結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可知，使用1()次示固定化酶的酶活未見(jiàn)明顯損失，使用2()次示|古|定化 酶的酶活降低到78%,這是由于連續(xù)不斷地?cái)嚢鑼?dǎo)致固泄化酶的凝膠結(jié)構(gòu)和交聯(lián)結(jié)構(gòu)的改 變而引起嗨的泄漏。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該固定化酶具有一定的操作穩(wěn)定性。圖5重復(fù)使用次數(shù)對(duì)固定化酶悔活的影響3小結(jié)利用海藻酸鈣凝膠球的包埋作用制各固定化蔗柵酶，游離酶被固定化后，最適ph值和最適 溫度沒(méi)有變化，分別為4. 0和60°c；但在高ph值和高溫卞，固定化酶比游離陸更為