病原生物實驗

1、病原生物學(xué)實驗指導(dǎo)實驗一 顯微鏡的使用及細(xì)菌的觀察一、顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)目的 熟練掌握顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)，以便能嫻熟應(yīng)用油鏡觀察細(xì)菌材料標(biāo)本。原理 細(xì)菌個體微小，肉眼不能看到，必須使用油鏡，將其放大1000倍左右才能看到。如光線直接從標(biāo)本玻片經(jīng)空氣層進(jìn)入油鏡頭時，由于介質(zhì)密度不同發(fā)生折射現(xiàn)象，因此進(jìn)入物鏡中的光線很少，結(jié)果視野暗淡，物像不清晰。如在標(biāo)本玻片上加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），就可避免光線的分散，加強(qiáng)視野的亮度，獲得清晰的物像（見圖1）。材料 附有油鏡頭的普通光學(xué)顯微鏡一架，染色標(biāo)本片，香柏油，擦鏡紙，二甲苯，消毒缸。 方法步驟 （一）使用法

2、 1油鏡的識別 油鏡頭上都有標(biāo)記，標(biāo)有90×或100×；鏡頭前端有黑、白或紅色的圓圈：刻有“HI”或“oil”等，其孔徑也較其他物鏡小，約帽針頭大。 2油鏡的使用 (1)用油鏡觀察標(biāo)本時應(yīng)將顯微鏡直立，勿將鏡臂彎曲，以免鏡油流散。 (2)以天然光線為光源時，使用平面反光鏡，如以燈光為光源，使用凹面反光鏡。 (3)將聚光器升到最高位置，再將光圈完全打開，增大射入光線的強(qiáng)度。 (4)標(biāo)本固定在載物臺上，標(biāo)本面上加鏡油1小滴，用標(biāo)本移動器夾緊標(biāo)本。 (5)先用低倍鏡將視野調(diào)至最亮?xí)r，并找到標(biāo)本的適當(dāng)位置，然后換用油鏡。 (6)用眼從側(cè)方看著物鏡，緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使物鏡頭浸于油滴

3、內(nèi)，并幾乎與玻片接觸為止，但切勿使兩者相碰，防止損傷鏡頭或壓碎玻片；然后從目鏡觀察，輕輕轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，看到物像時，再調(diào)換細(xì)調(diào)節(jié)器，使物像清晰。未能看到物像時，再重復(fù)上述操作。 (7)油鏡頭使用后立即用拭鏡紙擦凈鏡頭上的油。如油已干，可在試鏡紙上滴少許二甲苯擦試，并隨即用干的試鏡紙擦去二甲苯，以防鏡片脫落。 （二）油鏡的保護(hù) 1顯微鏡是貴重精密儀器，使用時要精心愛護(hù)，不得隨意拆散和碰撞。 2取送顯微鏡時，應(yīng)右手持鏡臂，左手托鏡座，平端于胸前，然后輕放于臺面上或柜箱內(nèi)。 3防止與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醚、氯仿、酒精等化學(xué)藥品接觸。 4擦鏡頭時，用試鏡紙擦，切忌使用粗糙的紙片或布片擦試等。擦鏡時應(yīng)順其直徑方

4、向擦，不要轉(zhuǎn)圈擦。5不用時，將物鏡轉(zhuǎn)開呈八字，使其不正對聚光器，以免物鏡與聚光器相碰撞。將聚光器下降，罩上鏡套或蓋布，對號歸位。 思考題 1怎樣操作才能使顯微鏡的視野最亮？標(biāo)本最清晰？ 2使用油鏡應(yīng)注意哪些主要事項？二、細(xì)菌材料玻片標(biāo)本制備（操作）目的 細(xì)菌材料需涂布固定于玻片上，然后經(jīng)染色才能觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及染色反應(yīng)。原理 細(xì)菌為膠體原漿蛋白為主，涂布在玻片上經(jīng)火焰溫?zé)岷罂晒潭ㄓ诓Ｆ俳?jīng)染色沖洗既可被染上顏色，且不易被水沖洗掉。材料 葡萄球菌、大腸桿菌培養(yǎng)物、玻片、生理鹽水、接種環(huán)、酒精燈、火柴、消毒缸。 方法步驟 按涂片干燥固定順序進(jìn)行。 1涂片 取潔凈載玻片1張，用接種環(huán)取12環(huán)生理

5、鹽水置于玻片，接種環(huán)滅菌后取菌少許，與鹽水混勻并涂成面積不超過1cm2的薄膜。如用液體培養(yǎng)物涂片，可直接取培養(yǎng)物涂于玻片上，不加生理鹽水。 2干燥 將涂片放空氣中自然干燥，或?qū)?biāo)本面向上，放在離火焰較遠(yuǎn)處烘干，避免烤焦。3固定 手持載玻片一端，將涂片在火焰高處連續(xù)通過3次，約23秒，就可固定標(biāo)本。 注意事項 1玻片要潔凈無油，否則菌液不易涂開。不宜選用厚玻片，以免標(biāo)本觀察時視野難調(diào)清晰。 2取菌量宜少，涂上要均而薄3水洗時要以細(xì)流水徐緩沖洗，避免直接沖洗涂菌處，要切忌未經(jīng)火焰固定的標(biāo)本立即染色水洗。 思考題 涂片后為什么必須進(jìn)行固定？固定時應(yīng)注意什么？三、細(xì)菌的革蘭染色法（操作）目的 革蘭染色

6、法是最常用的細(xì)菌鑒別染色法，根據(jù)染色結(jié)果將細(xì)菌分成兩大類，即革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，此有助于細(xì)菌鑒別、分析細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特點、致病性和選用抗菌藥物提供依據(jù)。原理 由于兩大類細(xì)菌細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同。革蘭陰性菌細(xì)胞壁中有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖含量較少。當(dāng)用酒精脫色時，溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞的滲透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞脫色，經(jīng)復(fù)染后，染上復(fù)染液的顏色。而革蘭陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量多且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)酒精脫色后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，細(xì)胞仍保留結(jié)晶紫的顏色。 材料 1葡萄球菌和大腸桿菌1824小時培養(yǎng)后的混合菌液。 2革蘭染色液一套。 3其它材料同玻片標(biāo)本制備

7、法。 方法步驟 涂片干燥固定后按以下順序染色。 1初染 滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴于標(biāo)本面上，染色1分鐘，輕輕水洗，甩干。 2媒染 滴加盧戈氏碘液數(shù)滴于標(biāo)本面上，染色1分鐘，輕輕水洗，甩干。 3脫色 滴加95%酒精于標(biāo)本面上，頻頻傾動玻片，直到不再溶下染料為止，約半分鐘，視標(biāo)本片材料厚薄而增減時間，然后水洗、甩干。 4復(fù)染 加稀釋石炭酸復(fù)紅液于標(biāo)本面上，染1/21分鐘，水洗后甩干，用毛邊紙或濾紙輕輕吸干，待標(biāo)本充分干燥后加油，用油鏡觀察并繪圖。提示：經(jīng)革蘭染色后，顯紫色者為革蘭陽性菌，顯紅色者為革蘭陰性菌。 注意事項 1注意掌握好染色的時間，尤其是酒精脫色時間，不宜過長或過短。 2染色過程中，不可使染

8、液干涸。 3選用適齡培養(yǎng)物，以1824小時為宜，否則影響染色效果。4細(xì)菌染色標(biāo)本片觀察后仍應(yīng)放入規(guī)定的玻片缸中以便消毒處理。 思考題 1革蘭染色法的基本步驟如何？應(yīng)注意哪些關(guān)鍵步驟？ 2革蘭染色有何實際意義？四、細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察（示教）目的 在適宜條件下，各種細(xì)菌保持其原有形態(tài)和染色反應(yīng)，可作為菌種鑒別基本條件。某些細(xì)菌除了具有菌細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)之處，尚具有某些特殊結(jié)構(gòu)，可供菌種的鑒別。原理 細(xì)菌為無色半透明膠體，經(jīng)染色或特殊染色后，可顯示其固有形態(tài)或特殊結(jié)構(gòu)，可以供菌種的觀察和識別。 材料 1細(xì)菌基本形態(tài)標(biāo)本片 (1)球菌 葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌染色標(biāo)本片。 (

9、2)桿菌 大腸桿菌、白喉桿菌、炭疽桿菌等染色標(biāo)本片。 (3)螺菌類 霍亂弧菌、幽門彎曲菌標(biāo)本片等。 2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)標(biāo)本片肺炎球菌莢膜、破傷風(fēng)桿菌芽胞、變形桿菌鞭毛等染色片。 方法步驟 1使用油鏡觀察細(xì)菌基本形態(tài)各標(biāo)本片并繪圖。2在示教油鏡下觀察細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)標(biāo)本片并繪圖。 思考題 1細(xì)菌有哪些特殊結(jié)構(gòu)，其在醫(yī)學(xué)實踐中意義如何？ 2為什么細(xì)菌能保持其固有形態(tài)？實驗二 病原性球菌、桿菌一、觀察各病原性球菌的菌落特征（示教）目的 熟悉病原性球菌的培養(yǎng)特性及主要鑒別點 材料與方法 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌血瓊脂平板、腦膜炎雙球菌巧克力平板培養(yǎng)物。觀察

10、各菌生長情況，注意單個菌落的形態(tài)、大小、表面、邊緣、透明度、顏色及溶血環(huán)。 思考題 a和b溶血的實質(zhì)是什么？二、血漿凝固酶試驗-玻片法（操作）目的 掌握血漿凝固酶試驗的原理。原理 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使人或動物血漿發(fā)生凝固，因此，測定血漿凝固酶的有無是鑒定葡萄球菌致病性的重要依據(jù)。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細(xì)胞壁上，使血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附于細(xì)胞表面，發(fā)生凝集，可用玻片法測出。另一種是分泌至菌體外的游離凝固酶，作用類似凝血酶原物質(zhì)，可被血漿中的協(xié)同因子激活變成凝血酶樣物質(zhì)，而使纖維蛋白原變成纖維蛋白，從而使血漿凝固，可用試管法測出。 材料

11、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物、表皮葡萄球菌培養(yǎng)物、玻片、生理鹽水、兔血漿、接種環(huán)、酒精燈、火柴、消毒缸方法1取干凈玻片一張，用記號筆將玻片劃成三格，其中第一格、第二格各加2接種環(huán)的兔血漿，第三格加2接種環(huán)生理鹽水。 2用接種環(huán)取少許金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物分別于第一格的兔血漿及第三格的生理鹽水混勻，取少許表皮葡萄球菌培養(yǎng)物與第二格的兔血漿混勻。 35分鐘以內(nèi)觀察結(jié)果。 結(jié)果 若有凝塊出現(xiàn)，即為陽性；若無凝塊出現(xiàn)，則為陰性。 思考題 致病性葡萄球菌的特點有哪些？鑒定致病性葡萄球菌常用的方法有哪些？三、腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基上的菌落特點（示教） 選擇鑒別培養(yǎng)基中除基本營養(yǎng)成分外，含乳糖、指示劑、選擇性抑菌劑

12、等成分。如SS瓊脂培養(yǎng)基中指示劑為中性紅，選擇性抑菌劑為膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠等，對大腸桿菌有抑制作用而對腸道病原性桿菌無抑制作用或作用微弱。大腸桿菌在SS平板上生長受抑制，少數(shù)長出菌落者因發(fā)酵乳糖產(chǎn)生酸類，能使中性紅變紅，以致菌落呈紅色，而一般腸道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨產(chǎn)生鹼性物質(zhì)，故菌落呈淡黃色，故起到選擇鑒別大腸桿菌及其他腸道致病菌的作用。EMB培養(yǎng)基中伊紅、美藍(lán)兼有指示劑和選擇性抑菌劑的作用，大腸桿菌在EMB平板上因分解乳糖產(chǎn)酸，pH下降，使菌體帶正電荷，從而結(jié)合伊紅、美藍(lán)使呈紫黑色有金屬光澤的菌落，而一般腸道致病菌不分解乳糖、呈無色半透明菌落。SS瓊脂培養(yǎng)基對大腸桿菌抑制作用很

13、強(qiáng)，EMB瓊脂培養(yǎng)基對大腸桿菌抑制作用較弱，故前者更適宜于沙門菌、志賀菌等腸道病原性桿菌的分離培養(yǎng)。表 腸道桿菌在SS平板、EMB平板上的菌落特征培養(yǎng)基大腸桿菌菌落沙門菌、志賀菌等菌落SS平板紅色較小、淡黃色半透明EMB平板紫黑色、有金屬光澤較小，無色半透明四、腸道桿菌的生化反應(yīng)及動力（示教）材料 5種腸道桿菌在葡萄糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基、蛋白胨水、半固體培養(yǎng)基的24小時培養(yǎng)物。 結(jié)果觀察 1觀察葡萄糖發(fā)酵管內(nèi)5種腸道桿菌的生長情況，注意是否產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣。 2觀察克氏雙糖鐵培養(yǎng)基內(nèi)5種腸道桿菌生長情況，注意對葡萄糖及乳糖分解能力、能否產(chǎn)氣；有無硫化氫產(chǎn)生。 3觀察能否分解尿素

14、，如能分解尿素形成NH4OH呈鹼性，可使培養(yǎng)基（含指標(biāo)劑酚紅）變?yōu)樘壹t色。 4在蛋白胨水培養(yǎng)物中滴加數(shù)滴吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛），如能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，則出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)，即為吲哚試驗陽性。 5觀察細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中生長情況，如細(xì)菌僅沿穿刺線生長，為動力試驗陰性，如擴(kuò)散生長而使整個培養(yǎng)基混濁，則為動力試驗陽性。表 5種腸道桿菌的生化反應(yīng)及動力試驗菌名生 化 反 應(yīng)動力葡萄糖乳糖H2S尿素靛基質(zhì)大腸桿菌變形桿菌乙型副傷寒桿菌+傷寒桿菌痢疾桿菌 思考題 什么叫選擇鑒別培養(yǎng)基？舉例說明。實驗三 病毒及其它微生物一、鉤端螺旋體（示教） 材料 鉤端螺旋體鍍銀染色示教片 方法 用油鏡觀察鉤端螺旋體的形態(tài)、染色特點二、狂犬病病毒包涵體（示教） 材料 狂犬病病毒包涵體HE染色示教片 方法 用油鏡觀察狂犬病病毒包涵體的特征，在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見嗜酸性包涵體，至圓形或橢圓形，數(shù)量1個或多個。三、病毒的血凝抑制試驗（示教） 原理 病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，可于病毒（或其血凝素）懸液中，加入特異性免疫血清所抑制，即為病毒的紅細(xì)胞凝集抑制試驗。 方法 按下表進(jìn)行塑料板孔123456789血清對照10抗原對照11血球?qū)φ丈睇}水(ml)0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25病人血清(ml)1:10稀釋0.250.250.250.250.250.2