重慶醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士研究生蛋白質(zhì)組學(xué)試題答案

1、重慶醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士研究生蛋白質(zhì)組學(xué)試題姓名： 學(xué)號(hào)： 所在大班：蛋白質(zhì)組學(xué)2班專業(yè)： 得分： 交卷截止時(shí)間：2011.1.10 交卷地點(diǎn)：東大樓810/812房間交卷方式：各大班科代表收集并按學(xué)號(hào)順序整理后上交，統(tǒng)一用上次做科學(xué)社會(huì)主義的信簽紙寫(xiě)，如果用戶完了的請(qǐng)到F棟樓下浩洋書(shū)店購(gòu)買（2元一本的）。一、解釋（共15分）1、MALDI TOF MS（10分）基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time of Flight Mass Spectra），離子源是基質(zhì)輔助激光解吸電離，質(zhì)量分析器是飛行

2、時(shí)間管。MALDI-TOF MS是近年來(lái)獲得快速發(fā)展的一種軟電離生物質(zhì)譜，它的建立突破了生物大分子質(zhì)譜分析的難題，該技術(shù)無(wú)論在理論上還是在設(shè)計(jì)上都具有簡(jiǎn)單、高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確、測(cè)定質(zhì)量范圍大等特點(diǎn)。 基本原理：MALDI是利用一定波長(zhǎng)的激光脈沖，在極短的時(shí)間間隔內(nèi)，對(duì)含被測(cè)樣品靶物的一個(gè)微小區(qū)域提供高能量，從固相直接獲得離子的電離方法，其基本特點(diǎn)就是使用了固體基質(zhì)，特別適用于對(duì)熱敏感或不揮發(fā)化合物的離子化，因此在蛋白質(zhì)組分析中得到了廣泛應(yīng)用。TOF分析器的離子分離是用非磁方式達(dá)到的，離子在離子源中形成后為電場(chǎng)所加速，進(jìn)入真空無(wú)場(chǎng)漂移區(qū)，具有不同質(zhì)荷比的離子因其通過(guò)漂移區(qū)的時(shí)間不同而實(shí)現(xiàn)分離

3、，先后到達(dá)檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)。質(zhì)量較輕的離子飛行速度快,較早到達(dá)檢測(cè)器；較重的離子飛行速度慢，較晚到達(dá)檢測(cè)器，且離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比的平方根( m / z )1/2 成正比，因此可以通過(guò)檢測(cè)飛行時(shí)間來(lái)測(cè)定離子的質(zhì)荷比。2、免疫共沉淀（5分）Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗體-抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。基本原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能被沉淀下來(lái)。

4、該技術(shù)可用于鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合以及進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析，還可用來(lái)篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。二、 問(wèn)答題（共85分）1、Western Blotting 的流程（10分）。答1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 2. 電泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝膠配制 (2) 樣品處理(3) 上樣與電泳3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer) 4. 封閉(Blocking) 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)7. 蛋

5、白檢測(cè)(Detection of proteins)8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)2、血漿/血清蛋白質(zhì)組研究中需要著重注意的問(wèn)題（10分）。因血漿血清中的含有各種蛋白質(zhì)及降解產(chǎn)物，想要獲得所需蛋白，需選擇適合的前處理?xiàng)l件，尤其在進(jìn)行血漿的肽組學(xué)分析時(shí)顯得更為重要。1、血漿/血清樣品選擇去血小板的血漿由于避免血小板的激活作用，減少了蛋白質(zhì)的體外降解，因而較血清更適合一定的肽組學(xué)研究；去血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿樣品，更適合分析低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)；如果要使用一定的蛋白酶抑制劑，一定要在早期加入，而且要謹(jǐn)慎使用，因?yàn)橐种苿┑募尤肟赡軐?duì)MS分析造成一定的干擾，而且一些小

6、分子的抑制劑與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的亞型，這些都將使得分析結(jié)果變得復(fù)雜。2、樣品的收集與貯存為減少血小板的污染，血液樣品在分析前最好用0.2m的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜過(guò)濾，樣品分裝冰凍儲(chǔ)存，減少融化-再冰凍的循環(huán)；樣品應(yīng)分裝并貯存在液氮中，減少或不加蛋白酶抑制劑，以減少對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。3、去除高豐度蛋白和分級(jí)技術(shù)血漿/血清樣品中蛋白質(zhì)種類很多，而且所含蛋白質(zhì)具有較大的動(dòng)力學(xué)范圍，其中有許多豐度較高但不含有特殊生物學(xué)信息的蛋白質(zhì)，這將會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分析造成極大的困難，甚至根本不能檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)，因此，通過(guò)對(duì)原始蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫和分步分離減少樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，可以極大簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)和分析，提高

7、對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和識(shí)別的靈敏度和準(zhǔn)確度。4、多維策略的運(yùn)用3、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)定義及主要研究領(lǐng)域。試舉例說(shuō)明其在藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用（10分）。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)就是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究領(lǐng)域：1臨床前研究-發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)，以及針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部可能的化合物，以及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)；2臨床研究方面-發(fā)現(xiàn)藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物，或以蛋白質(zhì)譜的差異將患者分類并給予個(gè)體化治療。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用舉例：（1）研究人員通過(guò)比較給藥前后的蛋白質(zhì)組，找到了藥物阿霉素抗

8、乳腺癌的一個(gè)作用靶標(biāo)Hsp27。（2）瘧原蟲(chóng)入侵血紅細(xì)胞的阻斷靶點(diǎn)探測(cè)：半胱氨酸蛋白水解酶是瘧原蟲(chóng)生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化學(xué)探針I(yè)125-DCG-04打靶，然后通過(guò)抗DCG-04的生物素純化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶類的亞蛋白質(zhì)組；通過(guò)酶活性分析，最終發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲(chóng)的入侵血紅細(xì)胞的裂殖期，僅有一個(gè)有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)falcipain 1；從數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到falcipain 1的抑制劑YA29-Eps，結(jié)果證實(shí)YA29-Eps可阻斷瘧原蟲(chóng)的入侵紅細(xì)胞。4、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)與功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和內(nèi)容的差異，以及在臨床研究和應(yīng)用上的特點(diǎn)與作用（1

9、0分）。5、蛋白質(zhì)組學(xué)在心血管基礎(chǔ)和臨床研究中的目的和意義（10分）。臨床將研究結(jié)果主要用于：從蛋白質(zhì)水平研究相關(guān)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制；應(yīng)用心血管疾病蛋白標(biāo)記物來(lái)更早、更準(zhǔn)確地檢測(cè)心血管疾病，尤其是急性冠脈綜合征(ACS)；蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)源的信息作 為目前患者診斷的補(bǔ)充；蛋白質(zhì)組檢測(cè)獲得的信息有利于個(gè)體化治療，為其提供新的治療靶位；蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)工具和信息用于治療的各個(gè)階段，可以適時(shí)評(píng)估治療的效果和校正治療方案。 6、目前的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)和不足（10分）。蛋白質(zhì)是機(jī)體生理、病理活動(dòng)功能的直接執(zhí)行者，對(duì)于它的性質(zhì)和數(shù)量變化的精確把握是揭示機(jī)體生理變化和疾病病因、發(fā)病機(jī)制的重要切入

10、點(diǎn)。與傳統(tǒng)的單一蛋白質(zhì)研究方法相比，組學(xué)技術(shù)可大大提高診斷的敏感性和特異性，蛋白質(zhì)組學(xué)的這一技術(shù)特點(diǎn)無(wú)疑在醫(yī)學(xué)研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，它可以跟蹤機(jī)體最細(xì)微的生理病理變化，通過(guò)對(duì)疾病特異性蛋白質(zhì)的尋找，使疾病的早期診斷成為可能。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為正常生理研究、疾病診斷，尤其是早期診斷方面提供了廣闊的技術(shù)平臺(tái)，在指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后等方面具有巨大發(fā)揮空間。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在各個(gè)領(lǐng)域、各個(gè)方面，例如，神經(jīng)生理學(xué)方面，由于大腦高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，傳統(tǒng)研究方法已難以適應(yīng)亟待發(fā)展的科研及臨床需求，而蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)給神經(jīng)科學(xué)研究帶來(lái)新的動(dòng)力；腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷是目前蛋白質(zhì)7、鼻咽

11、癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究 的內(nèi)容和成果（10分）。1)NPC不同階段和分化程度的蛋白質(zhì)組學(xué)研究腫瘤分化過(guò)程中蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究對(duì)于腫瘤診斷和治療具有十分重要意義。FFPE組織蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的成功建立為腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究開(kāi)拓了更廣闊的研究領(lǐng)域（2）腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 為闡明腫瘤微環(huán)境在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制，從間質(zhì)中尋找 NPC 診斷或治療的分子靶標(biāo)，采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 對(duì)純化的鼻咽癌間質(zhì)和正常鼻咽間質(zhì)進(jìn)行了研究和比較。2D- DIGE（熒光雙向差異凝膠電泳）技術(shù)分離鑒定NPC間質(zhì)與正常鼻咽間質(zhì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)一步對(duì)差異蛋白Periostin的功能及作用機(jī)理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn):

12、&&Periostin 在NPC間質(zhì)高表達(dá)，&& 其通過(guò)與Integrin V5結(jié)合，來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，表明腫瘤微環(huán)境的蛋白質(zhì)組變異在鼻咽癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用3）NPC放療抵抗的蛋白質(zhì)組學(xué)部分 NPC 對(duì)放療抗拒，但其機(jī)制仍然不甚清楚，因此尋找鼻咽癌放療抗拒相關(guān)的蛋白質(zhì)，不僅有助于揭示鼻咽癌放療抗拒的機(jī)制，且能為鼻咽癌放療敏感性預(yù)測(cè)及鼻咽癌的個(gè)體放療提供科學(xué)依。2DE篩選放療抵抗（IR)的NPC細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)，研究結(jié)果提示：14-3-3和Maspin的下調(diào)及GRP78和Mn-SOD的上調(diào)與放療抵抗相關(guān)，這四個(gè)蛋白質(zhì)有望作為預(yù)測(cè)鼻咽癌放療反應(yīng)的分子標(biāo)

13、志物4）重要蛋白質(zhì)和信號(hào)分子在NPC發(fā)生發(fā)展中的作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究P53、TNF-RKIP： Raf 激酶抑制蛋白P53下調(diào)致HSP27和14-3-3上調(diào)，GRP75下調(diào),上調(diào)P53后， HSP27和14-3-3下調(diào)， GRP75上調(diào)。以上結(jié)果為揭示NPC細(xì)胞中p53蛋白聚集和功能異常的機(jī)制，以及p53基因在NPC發(fā)病中的作用提供了新線索通過(guò)多角度對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的探索和研究，發(fā)現(xiàn)了一批在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，為鼻咽癌發(fā)生機(jī)制和分子標(biāo)志物篩選提供了重要線索，部分蛋白有望成為腫瘤標(biāo)志物。8、雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的優(yōu)缺點(diǎn)（8分）。我雙向電泳是當(dāng)前蛋

14、白質(zhì)組學(xué)研究中分辨率最高、信息量最大的分離技術(shù)。具體優(yōu)點(diǎn)如下：1）. 可以將上千種不同的蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái) ，并得到每種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、表觀分子量和含量等信息。2）.如果雙向電泳后續(xù)接一系列自動(dòng)化操控，就能大大增加蛋白質(zhì)分析與鑒定的能力3）.可檢測(cè)翻譯后和翻譯過(guò)程的蛋白質(zhì)修飾雖然雙向電泳是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最有效的分離技術(shù)，其缺點(diǎn)：1）、不能進(jìn)行可完全的2-DE分析 2）、許多較大的疏水蛋白質(zhì)在IEF分析中的結(jié)果不理想 3）、對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大（）100000）的蛋白質(zhì)分離分析能力差 4、雙向電泳不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，不能適應(yīng)大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的需要5、雙向電泳首先由的主要染色技術(shù)（考馬斯亮蘭染色、銀染色）的檢測(cè)領(lǐng)命度較差，且局限在越100倍的動(dòng)態(tài)范圍，而細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)范圍為百萬(wàn)倍，而且從膠上切割下的蛋白點(diǎn)消化后所產(chǎn)生的肽的回收率常常低于60%，這更會(huì)妨礙MS對(duì)低豐度蛋白的鑒定。9、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵及其解決措施（7分）。 由于細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上與許多其他亞細(xì)胞組分相關(guān)聯(lián)，和細(xì)胞器組成的動(dòng)態(tài)性，所以分離得到的細(xì)胞器很難達(dá)到