影響血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳實驗分離效果的因素.

1、影響血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳實驗分離效果的因素 :【 1】 電泳介質(zhì) pH 的影響 :對于蛋白質(zhì)及氨基酸等兩性物質(zhì) ,電泳介質(zhì)的 pH 影響蛋白質(zhì)的電泳情況 即可 決定蛋白質(zhì)的帶電量 (Q 。pI-pH<0, 分子帶正電荷 ,向負極泳動 ;pI-pH>0, 分子到負電荷 ,向正極泳動 ;pI-pH=0,兼性離子 ,凈電荷為零。pH 偏離等電點越遠 ,分子所帶凈電荷越多 ,其泳動速度越快。所以,當 pI-pH 接近零時 ,分子處于等電狀態(tài) ,不移動 ,影響條帶清晰 度,從而 影響實驗分離效果?！緦⒁恻c】 由于血清蛋白質(zhì)的等電點多在 pH 46 之間,因此,分離血清 蛋 白常用

2、 pH 8.6的巴比妥緩沖液或者三羥甲基氨基甲烷 (Tris 緩沖液?！?2】緩沖溶液的離子強度 :離子強度低 ,電泳速度快 ,分離區(qū)帶不易清晰 ;離子強度高 ,電泳速度慢 ,但區(qū)帶分離較清晰。離子強度過低 ,緩沖溶液的緩沖量小 ,不易維持 pH 的恒定;離子強度過高 ,則降低蛋白質(zhì)的帶電量使電泳速度減慢。所以,當離子強度過低時 ,電泳速度雖快 ,但易引起分離區(qū)帶不清晰 ; 當離子強度 過高時 ,雖分離區(qū)帶清晰 ,但點用速度過慢 ,所以要選擇合適 的離子強度?！緦⒁恻c】 離子強度的選擇要合適 , 一般常用的離子強速為 0.020.2之 間?！?3】電場強度的影響 :電場強度和電泳速度成正比

3、關系。電場強度一每厘米的電勢差計算,也稱 電勢梯度。電場強度越高 ,則帶電離子的移動速度越快。隨著電場強度的 增高 ,電流強度 增加 ,產(chǎn)熱也增多。產(chǎn)熱的不良后果 :引起水的蒸發(fā) ,改變?nèi)芤?pH 及離子強度引起介質(zhì)溫度高 ,可使蛋白質(zhì)變性。另外 ,當電場強度過高時 ,電泳速度也會很快 ,分離區(qū)帶將不清晰?！緦⒁恻c】 電泳實驗要控制在一定范圍之內(nèi) , 進行高壓電泳時 , 必須裝備 有 效的冷卻裝置。【 4】電滲 :在電場中 ,由于多孔支持物吸附水中的離子使支持物表面相對帶電 ,在電 場作用 下 ,溶液就像一定方向移動 ,此種現(xiàn)象稱作電滲。在外電場的作用下 ,水向負極移動。如果被測定樣品帶正

4、電荷 ,則移動更快 ,區(qū)帶分離不清晰 ;如果被測定樣品帶負電荷 ,則移動減慢 ,區(qū)帶分離較清晰。所以 ,顆粒泳動所表現(xiàn)出來的速度決定于顆粒本身的泳動速度和溶液的電滲作用?！緦⒁恻c】在選用支持物時 ,應盡量避免高電滲作用的物質(zhì)。5】支持物的選擇 :醋酸纖維素膜具有均一得泡沫狀結構 ,滲透性強,對分子移動無阻力 ,用 它做區(qū)帶 電泳的支持物 ,用樣量少,分離清晰,無吸附作用,應用范圍廣 和快速便捷 ,且染色后的 薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液經(jīng)跑透明 ,透明后的 薄膜便于保存和定量分析。所以,本實驗以醋酸纖維素薄膜作為支持 ,于薄膜的一端加微量血清 ,膜 兩端連接 于緩沖溶液。因此 ,各種蛋白質(zhì)皆帶

5、負電荷 ,在電場中向正極移 動 ,因泳動速度不同而 被分離?！緦⒁恻c】 支持物的選擇一定要綜合各種因素 , 比如醋酸纖維素薄膜電泳 可把血清蛋白質(zhì)分離為蛋白 A, 、1 2、和 -球蛋白, 將蛋白質(zhì)染色后, 可按染色取代位置進行定性觀察 , 也可對各條色帶進 行定量測定?！?5】電壓 :電泳時 ,電壓應控制在 110140V,不能過高。若電壓太高 ,產(chǎn)熱太高,產(chǎn)熱量大 ,則蛋白質(zhì)標本會破壞。并且電壓高則帶點顆粒移動速度快 ,分離效果不理想?！緦⒁恻c】 電泳時 ,電壓應控制在 110140V,不能過高?！?】其他因素 :1. 醋酸纖維膜在電泳前 ,一定要在緩沖溶液中浸泡 ,否則有礙 電 泳分離 ,最好是浸泡過夜 ,效果最佳。2. 點樣時樣品一定要點在無光澤面 ,否則很難吸入 ,點樣量 不宜過多。其原因是 醋酸