D二聚體及其測(cè)定方法探析

1、d二聚體及其測(cè)定方法探析【摘要】d二聚體(d dimer)是纖維蛋白特異性降解 產(chǎn)物，可有效地標(biāo)志穩(wěn)定的纖維蛋白的出現(xiàn)，其檢測(cè)對(duì)血栓 性疾病的診斷及治療觀察具有重要應(yīng)用價(jià)值1, 2。本文 綜述了 d二聚體的形成及其主要的檢測(cè)方法：凝集法、 elisa法、及酶聯(lián)熒光分析法、免疫金標(biāo)法。隨著方法學(xué)的 發(fā)展及市場(chǎng)推廣，早已由科研項(xiàng)目轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｒ?guī)項(xiàng)目?！娟P(guān)鍵詞】d二聚體；檢測(cè)方法；纖溶纖溶酶(pl)可降解纖維蛋白原、纖維蛋白單體、交聯(lián) 性纖維蛋白。纖維蛋白原在凝血活酶作用下形成纖維蛋白單 體，纖維蛋白單體由xhia作用下通過r'r'鍵變成網(wǎng)狀的多聚體，形成交聯(lián)纖維蛋白。與此同時(shí)，在pl作

2、用下 產(chǎn)生各種大小不同片段的纖維蛋白降解產(chǎn)物。d二聚體則 是含r' h鍵的片段，是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn) 物。所以血漿中檢測(cè)d二聚體有助于血栓性疾病的早期診 斷及對(duì)溶栓藥物治療的療程監(jiān)測(cè)和療效考核3。本文就d 二聚體的形成特性以及主要測(cè)定方法作一簡(jiǎn)單敘述。1 d二聚體的生成及特性1. 1 d二聚體的形成 纖維蛋白原在凝血酶作用下轉(zhuǎn) 變?yōu)槔w維蛋白，并最終形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊。凝血酶生 成后即與纖維蛋白原的底物部位作用，首先裂解纖維蛋白原 分子中的2條aa鏈的氨基端精氨酸16甘氨酸17鍵，釋 放出一對(duì)纖維蛋白肽a（fpa）,由此產(chǎn)生a鏈新的氨基末端 （甘氨酸一脯氨酸一精氨酸），生成纖

3、維蛋白單體i;然后凝 血酶再裂解纖維蛋白單體i分子中2條鏈的氨基端精氨 酸14甘氨酸15鍵，釋放出一對(duì)纖維蛋白肽b（fpb）,由此 產(chǎn)生b鏈新的氨基末端（甘氨酸一組氨酸一精氨酸），生成 纖維蛋白單體ii;纖維蛋白單體i與ii生成后即開始自發(fā)性 聚合。fpa和fpb的釋放分別出纖維蛋白單體中央e區(qū)的兩 種“聚合部位” o 一個(gè)纖維蛋白單體中央e區(qū)的“聚合部位”可與另一個(gè)纖維蛋白單體外周d區(qū)的“互補(bǔ)部位”以非共價(jià)結(jié)合，這樣兩個(gè)纖維蛋白單體即會(huì)形成一部分重疊而又 不穩(wěn)定的非共價(jià)復(fù)合物，第三個(gè)纖維蛋白單體加入后能以同 樣方式與其中之一纖維蛋白單體相連，而由此形成的聚合體 中，兩個(gè)相鄰單體的d區(qū)將發(fā)生端

4、 端聚合作用。如此纖維 蛋白單體通過分子間e d區(qū)和d d區(qū)的相互作用形成可溶 性纖維蛋白單體復(fù)合物。在因子xhia作用下（需ca2+參與）， 相鄰纖維蛋白單體的y鏈可通過一條y鏈的398或399位 上的谷胺酰胺與另一纖維蛋白單體上y鏈的406位賴氨酸之間形成£ （谷氨酰）賴氨酸鍵而快速共價(jià)交聯(lián)，形成 e （ y glu） lys no纖維蛋白交聯(lián)后將形成穩(wěn)定的纖 維蛋白凝塊。形成的r' r'連結(jié)鍵是原來纖維蛋白單體 所不具備的46。pl對(duì)纖維蛋白(原)形成過程中的各個(gè) 階段均有降解作用，對(duì)纖維蛋白原，pl通過對(duì)精氨酸一賴氨 酸的降解作用，先從纖維蛋白原bb鏈上裂解下

5、來一個(gè)小肽 段bb1 42,在aa上裂解下來一種極附屬物。極附屬物由 碎片a、c和h組成，留下的片段稱為x片段。后者在纖 溶酶作用下，裂解為d片段和y片段，y片段再進(jìn)一步裂解 為終產(chǎn)物d片段和e片段。纖溶酶對(duì)可溶性纖維蛋白單體復(fù) 合物的降解作用，除形成x'、y'、d、e'、片段和aa極附 屬物外，還從bb鏈上裂解下bb 15 42小肽，統(tǒng)稱為纖維 蛋白降解產(chǎn)物(fgdps) o而交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶作用下， 除形成x，、y d、e，片段外，還形成d d、y y二聚 體、aa極附屬物及復(fù)合物1 (dd/e)、復(fù)合物2(dy/dy)、復(fù) 合物3 (yy/dxd)和yxd/d

6、xy等，統(tǒng)稱為纖維蛋白降解產(chǎn)物 (fbdps) o d二聚體則是含r' r'鍵的片段，是交聯(lián)纖 維蛋白的特異性降解產(chǎn)物46。1.2 d二聚體的特性d二聚體的分子量為190 000,等電點(diǎn)(pi)為4. 95. 3,經(jīng)b 硫基乙醇還原后出現(xiàn) 相當(dāng)于81 000個(gè)r' r'交聯(lián)鍵。d 二聚體在280 nm 下克分子消光系數(shù)為17. 8o d二聚體在體內(nèi)的半衰期&gt； 3 h,主要通過腎臟排泄。正常人血漿中的d二聚體&lt；400 ug/l,隨檢測(cè)方法不同略有差異。將一定濃度的d二聚體 與人幼稚單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(nomo 1),發(fā)現(xiàn)d三聚體 可刺

7、激nomo 1分泌尿激酶型纖溶酶原激活劑(u pa)和纖 溶酶原激活劑抑制物2(pai 2),引起nomo 1表面組織因 子(tf)表達(dá)活性增強(qiáng)。此外d二聚體還可促使nomo 1生 成超氧陰離子，促進(jìn)白細(xì)胞介素la (il la )和白細(xì)胞介 素1b(il ib)的釋放。d d的生成反映機(jī)體凝血和纖溶 系統(tǒng)的激活，在各種血栓形成性疾病以及生理性高凝狀態(tài)時(shí) 均有升高。特別是對(duì)靜脈血栓形成(venous thromboembolism, vte)髙度敏感，在vte的排除診斷中具有 重要價(jià)值。另外，d d在心血管疾病、dic、惡性腫瘤等疾 病時(shí)，也有明顯變化，可反映疾病的嚴(yán)重程度、發(fā)展變化、 以及療

8、效和頂后的有用指標(biāo)4, 5。2 d二聚體檢測(cè)方法d二聚體的檢測(cè)方法很多，本文按照被檢測(cè)物質(zhì)的 性質(zhì)不同h與抗原 抗體復(fù)合物相結(jié)合的物質(zhì)性質(zhì)不同i介 紹幾種主要的測(cè)定方法，其中包括：與紅細(xì)胞結(jié)合的方法、 與乳膠顆粒結(jié)合的方法、與酶結(jié)合的方法、在與熒光染料結(jié) 合的方法及與膠體金結(jié)合的方法4。2. 1自身紅細(xì)胞凝集法 采用分別針對(duì)d d和紅細(xì)胞 上表位的雙抗體，當(dāng)血中d d水平升高時(shí)，抗原 抗體結(jié) 合的增多而導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，2 min內(nèi)可以判斷結(jié)果，為半 定量的自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)是可在全血中檢測(cè)，省 去了離心制備血漿的麻煩。對(duì)vte的敏感性和npv分別為 100%和97%100%o如果僅對(duì)近

9、端dvt而言，simplired的 敏感性和npv也可達(dá)100%,特異性和ppv分別為58%和70%, 它是一種有價(jià)值的篩選高危性近端dvt的方法7。2.2乳膠凝集法1983年rylat t等將分離純化的d 聚體作抗原，按常規(guī)方法篩選，最后獲得一株dd 3b6/22 的抗d聚體的單克隆抗體。1986年elms將此單克隆抗體 共價(jià)吸附在乳膠顆粒上，用于定性或根據(jù)其稀釋度半定量測(cè) 定標(biāo)本中的d二聚體的含量。標(biāo)本可采用肝素edta或構(gòu)椽 酸鈉抗凝血漿，室溫下可穩(wěn)定3d,4 £可保存2周ohillyard 用該法測(cè)定了 515例未經(jīng)選擇的健康志愿者枸椽酸鈉抗凝血 漿。97. 7%均為陰性與e

10、lisa比較顯著相關(guān)，認(rèn)為該法快速、 特異、操作簡(jiǎn)單。不需特殊設(shè)備，特別適用于急診測(cè)定4, 7o2.3酶聯(lián)免疫吸附法(elisa) 1983年rylatt和 elms建立了雙抗夾心的elisa法檢測(cè)血漿中的d二聚體。 其包被抗體和酶標(biāo)抗體均采用分離純化后篩選出來的 mcab(dd3b6/22)該mcab能特異性地針對(duì)d 二聚體中的 r' r'連結(jié)鍵。該法靈敏度10 u g/l,正常范圍&lt； 300 ug/l 4。2.4基于酶免疫法的熒光抗體檢測(cè)法vidas dd在 vidas免疫分析儀上進(jìn)行，它在酶免疫法基礎(chǔ)上與熒光檢測(cè) 相結(jié)合。利用現(xiàn)成的單劑量試劑和分析儀中儲(chǔ)存的

11、校準(zhǔn)系 統(tǒng)，對(duì)單份樣本進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)成試劑由包被了鼠抗d d單 抗的固相移液裝置和一試劑條組成，后者包含了其他所需試 劑：結(jié)合劑(堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗d d單抗)、洗滌劑、 樣品稀釋劑和底物。將200卩1血漿吸入試劑條后，所有步 驟由分析儀完成。除需將血樣常規(guī)離心15 min外，結(jié)果可 在35 min內(nèi)得到。結(jié)果以纖維蛋白原等價(jià)單位表示，其檢測(cè)上限為1 000 u g/l,下限為50 p g/l,低于正常參考值 下限(68 ug/l494 u g/l) o對(duì)dvt的敏感性和npv分別 為96%99%和95%99%。vidas dd是目前研究最多的一種 檢測(cè)方法，敏感性很高，與經(jīng)典elisa法有很

12、好的一致性， 最有希望取代經(jīng)典elisa法而成為dvt診斷的首選篩選試驗(yàn)7 。2. 5免疫金標(biāo)法gogstad用膠體金標(biāo)記d二聚體的 單克隆抗體，建立了免疫過濾金標(biāo)染色測(cè)定法。本法將單抗吸附在多孔薄膜并粘放在有多層吸收墊的塑料盤上，被檢標(biāo) 本加入后即與該抗體相結(jié)合，然后加入膠體金標(biāo)記的抗體, 在薄膜上產(chǎn)生紅色斑點(diǎn)。通過肉眼觀察或用折射儀讀數(shù)，與 提供的標(biāo)準(zhǔn)色價(jià)或者測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的折射讀數(shù)，可計(jì)算出標(biāo)本 中d二聚體的含量。該法即具有膠乳凝集法的操作簡(jiǎn)單、 快速，適用于急診測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)，又具有elisa能夠準(zhǔn)確定量 的特點(diǎn)，線性范圍達(dá)到10 mg/l,與elisa比較具有顯著的 相關(guān)性，不受膽紅素,hb

13、、纖維蛋白原、可溶性的纖維蛋白 及fdp等干擾，但類風(fēng)濕因子、肝素及脂血等有一定的干擾。 批內(nèi)cv 8%12%,批間cv 13%20%,參考范圍0. 2 mg/l 0. 47 mg/l 4, 7。3總結(jié)以上介紹了 d d的生成以及幾種主要的d d檢測(cè)方 法，除了經(jīng)典的膠乳法和elisa法外，現(xiàn)已發(fā)展了 10多種 快速的d d的檢測(cè)方法。這些新方法分別鑒于不同的原理, 但與經(jīng)典方法相比，都具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，更適 合于急診患者的使用。有些新方法已經(jīng)經(jīng)過了大量的臨床研 究評(píng)估，得到了公認(rèn)，在臨床已廣泛使用。還有一些新方法 正在進(jìn)行臨床評(píng)估，方法的可靠性尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。 迄今,d d的

14、最大臨床意義是在排除診斷可疑vte中的作用。 d d對(duì)vte高度敏感，如果患者的d d低于臨界值水平， ?？膳懦齰te。d d對(duì)血栓形成性疾病如彌漫性血管內(nèi)凝血 (dic)、肺栓塞(pe)、深部靜脈栓塞(dvt)、急性心肌梗死 (ami)、先兆子病等有早期快速診斷價(jià)值。對(duì)嚴(yán)重肝病，惡 性腫瘤，鐮刀紅細(xì)胞疾病的觀察也具重要價(jià)值。此外，d 二聚體的檢測(cè)還可用于溶栓藥物治療的療程監(jiān)測(cè)和療效考 核812。相信隨著科學(xué)的不斷進(jìn)步，更多更好的檢測(cè)d 二聚體的方法將會(huì)不斷出現(xiàn)，從而為廣大醫(yī)務(wù)工作者提供更 多便利?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 王鴻利，王學(xué)鋒.d二聚體檢測(cè)的方法及其 臨床應(yīng)用j 中華醫(yī)學(xué)雜志，2004,84

15、(2):171173.2 趙林漁，劉志偉.血漿d二聚體定量測(cè)定的臨 床價(jià)值探討j.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2005,23(1):88.3 侯振江.d二聚體測(cè)定的臨床應(yīng)用j.臨床 檢驗(yàn)雜志，1997,15(1):63 64.4 周永列.d二聚體的測(cè)定及其臨床意義j 國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，1996,17(1):4 6.5 郭雪梅，王鴻利.快速d二聚體檢測(cè)在診斷靜脈血栓形成中的應(yīng)用進(jìn)展j.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2000,4(1):4143.6 李家增，賀石林.血栓病學(xué)m 北京：科學(xué)出版社,1998:5152.7 董雷鳴，衛(wèi)蓿文.d二聚體檢測(cè)方法及其在診斷血栓栓塞疾病中的應(yīng)用j.診斷學(xué)理論與實(shí)踐， 2004,3(1):5254.8 莊昱洲，王學(xué)文血液惡性疾病患者d二聚體 測(cè)定及其臨床意