血清成分分析

1、血清成分分析摘要：血清由許多化學(xué)成分組成，包括白蛋白、1、2、-球蛋白,甘油三酯,總膽固醇,谷丙轉(zhuǎn)氨酶等。本次實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)血清成分進(jìn)行分析，如用鄰苯二甲醛法測(cè)定血清總膽固醇；用鹽析、濃縮分離蛋白質(zhì)并用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定；用紙層折法觀察肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT的轉(zhuǎn)氨作用；用分光光度法測(cè)定血清丙轉(zhuǎn)氨酶的活力。在掌握各種鑒定方法之外，為應(yīng)用與生活提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：血清、家雞、烏雞、膽固醇、清蛋白、-球蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶前言：血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長(zhǎng)因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和

2、伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。膽固醇在血液中存在于脂蛋白中，在血中存在的膽固醇絕大多數(shù)都是和脂肪酸結(jié)合的膽固醇酯，僅有10%不到的膽固醇是以游離態(tài)存在的。通過(guò)對(duì)血液中膽固醇含量的測(cè)定，能夠判斷身體健康狀況，從而來(lái)調(diào)整飲食。谷丙轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中。肝細(xì)胞或某些組織損傷或壞死，都會(huì)使血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高。我們通過(guò)對(duì)血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定，可以來(lái)判斷肝功能。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)血清總膽固醇含量測(cè)定，分離蛋白質(zhì)并鑒定；觀察肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT的轉(zhuǎn)氨作用；測(cè)定血清丙轉(zhuǎn)氨酶的活力，對(duì)應(yīng)用與醫(yī)學(xué)生理的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的探究。并提升生化實(shí)驗(yàn)技能。1實(shí)驗(yàn)材料和

3、方法：1.1實(shí)驗(yàn)材料：烏雞和家雞血清及肝臟1.2 實(shí)驗(yàn)方法：1.2.1血清膽固醇的定量測(cè)定（鄰苯二甲醛法） 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取清潔干燥試管5支，編號(hào)，按表2加入試劑。表2 鄰苯二甲醛法測(cè)定血清總膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制編號(hào)試劑編號(hào)編號(hào)編號(hào)編號(hào)編號(hào)01234標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液/mL00.10.20.30.4醋酸/mL0.40.30.20.10鄰苯二甲醛試劑/mL0.20.20.20.20.2蒸餾水/mL0.010.010.010.010.01混合酸/mL4.04.04.04.04.0100mL血清中總膽固醇含量/mg0100200300400A550nm加畢，混勻，靜置10min，以550nm波長(zhǎng)比

4、色測(cè)定，以吸光度值為縱坐標(biāo)，膽固醇含量為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定取2支清潔干燥試管，編號(hào)后，按表3加入試劑。表3 鄰苯二甲醛法測(cè)定血清總膽固醇樣品的測(cè)定試管試劑對(duì)照樣品醋酸/mL0.40.4血清/mL0.010.01鄰苯二甲醛試劑/mL00.2無(wú)水乙醇/mL0.20混合酸/mL*4.04.0*硫酸含量的高低對(duì)顯色有影響，故混合酸的配制和測(cè)定過(guò)程中的加量都應(yīng)準(zhǔn)確。顯色時(shí)要避免高溫，采用混合酸液反應(yīng)時(shí)溫度不會(huì)升得太高，一般在432時(shí)，顏色能穩(wěn)定2h。加畢，混勻，靜置10min，于550nm波長(zhǎng)比色，以對(duì)照管校零點(diǎn)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即知100mL樣品中總膽固醇含量（mg）。1.2.2血清清蛋白

5、與-球蛋白的分離與鑒定 1.2.2.1血清清蛋白與-球蛋白的鹽析血清清蛋白與-球蛋白的鹽析實(shí)驗(yàn)步驟取離心管一支，加入2mL血清加入2mLPBS（稀釋血清），搖勻逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，邊加邊搖靜止30min，離心20min（v=3000rpm）上清液（主要含有清蛋白）沉  淀（主要含有-球蛋白）加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液飽和加1mLPBS溶解靜止30min逐滴加入飽和（NH4）2SO4溶液0.5mL（相當(dāng)于33%飽和（NH4）2SO4溶液）離心、沉淀加1mLPBS溶解沉淀放置30min放入透析袋離心20min（v=3000rpm）*放棄離

6、心后的上清液（主要是、球蛋白），沉淀即為初步純化的-球蛋白1.2.2.2血清清蛋白與-球蛋白的透析與濃縮1. 取玻璃紙（15cm×15cm）兩張，折成袋狀。將前面第一次鹽析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分別倒入兩個(gè)透析袋中，用線繩系緊上口。2. 用玻璃棒懸掛在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯中，使透析袋下半部浸入水中，將燒杯放在微量振蕩器上振蕩1h（中間換水1-2次）。3. 將透析袋取下，小心將線繩解開(kāi)，用滴管吸收袋內(nèi)的液體放入干凈的試管中。4. 用雙縮脲法分別檢查袋內(nèi)外液體蛋白質(zhì)。在用BaCl溶液檢查燒液體的NH4+和SO42-。記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，觀察透析法除鹽的結(jié)果。5. 將兩透析

7、袋取出，埋入蔗糖中濃縮。 1.2.2.3血清清蛋白與-球蛋白的鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)步驟浸泡  將醋酸纖維素薄膜在緩沖溶液中浸泡20min，取出識(shí)別光面和麻面。點(diǎn)樣  用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體，用鉛筆在薄膜麻面一端2cm處畫(huà)一細(xì)線，利用載玻片一側(cè)蘸取樣品，于細(xì)線處點(diǎn)樣。電泳  將薄膜麻面朝下，平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，點(diǎn)樣一端靠近負(fù)極；通電后先使U=80V，待10min后，使U=120V電泳40min。染色  將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑重，染色10min。漂洗&

8、#160; 將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至無(wú)蛋白區(qū)無(wú)藍(lán)黑色。 1.2.3谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的鑒定及活力單位的測(cè)定 1.2.3.1谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的鑒定（紙層析法） 1.2.3.1.1谷丙轉(zhuǎn)氨酶提取液制備谷丙轉(zhuǎn)氨酶提取液制備方法2g肝臟+0.9%NaCl6mL+海砂200mg在低溫下，研磨成漿用脫脂棉過(guò)濾，得提取液（濾液不清）1.2.3.1.2轉(zhuǎn)氨作用試    劑對(duì)照管測(cè)試管0.1moL/L谷氨酸0.500.500.1moL/L丙酮酸鈉0.500.500.1%KHCO30.500.500.025%一溴乙酸0.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.50

9、加脫脂棉塞，45水浴，1.5h，時(shí)時(shí)振蕩內(nèi)容物2%乙酸6滴6滴沸水浴2min，使蛋白質(zhì)完全沉下，過(guò)濾，作層析1.2.3.1.3紙層析紙層析方法取圓形層析濾紙1張，在圓心處用圓規(guī)繪出直徑為3cm的同心圓通過(guò)中心將濾紙繪成四等分扇形，用毛細(xì)管點(diǎn)樣2-4次（直徑不超過(guò)2mm）在濾紙的圓心上剪一小孔，直徑約1-2mm取一小濾紙條，將下端剪成刷狀，在卷成燈芯插入圓形小孔，不能使燈芯突出紙面將圓形濾紙平放在盛有層析液（水飽和酚）培養(yǎng)皿上，使燈芯向下與溶劑接觸用大小相同的培養(yǎng)皿蓋在濾紙上溶劑通過(guò)燈芯上升到濾紙上向四周展層，直到溶劑前沿移至距濾紙邊緣約1cm處時(shí)停止（展層時(shí)間為1h）80-100烘箱干燥，噴灑

10、水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100顯色1.2.3.2血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位測(cè)定 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試     劑試管號(hào)012345丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基質(zhì)液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸緩沖液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分搖勻后，置于37水浴，保溫10min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50充分搖勻后，置于37水浴，保溫20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.

11、005.00充分搖勻，室溫靜置30min后，以0號(hào)管為空白，520nm波長(zhǎng)下比色A520nm值各管所含丙酮酸量（mol）0.100.200.300.400.50各管相當(dāng)GPT單位數(shù)100200300400500以酶的活力單位數(shù)為橫坐標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制A520nm與對(duì)應(yīng)的酶活力單位數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液mL數(shù)×摩爾濃度（2mol/mL）；（2）GPT活力單位為：每mL血清在37與pH=7.4的基質(zhì)液作用60min，生成1mol丙酮酸為一個(gè)單位（U）。本實(shí)驗(yàn)（臨床檢驗(yàn)）取血清量為0.1mL，報(bào)告數(shù)據(jù)以100mL血清計(jì)算，因此將實(shí)際測(cè)得結(jié)果×1000即可。2

12、、酶活力的測(cè)定試         劑測(cè)定管對(duì)照管10GPT基質(zhì)液（mL）0.500.5037水浴，預(yù)溫10min血清（mL）0.10PH7.4磷酸緩沖液（mL）0.10充分搖勻后，置于37水浴，保溫60min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.50充分搖勻后，置于37水浴，保溫20min0.4mol/L NaOH（mL）5.005.00充分搖勻后，室溫靜置30min后，520nm波長(zhǎng)下比色A520nm值   相當(dāng)于GPT單位（mL）2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1血清膽固醇的定量測(cè)定100ml血清中總膽固醇含

13、量/mg0100200300400A55000.1690.4560.6420.880由標(biāo)準(zhǔn)曲線得：項(xiàng)目種類(lèi)家雞烏雞吸光度0.0950.072100ml血清中總膽固醇含量/mg43.1832.732.2血清清蛋白與-球蛋白的分離與鑒定清蛋白全血清 -球蛋白2.3谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的鑒定及活力單位的測(cè)定 2.3.1谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的鑒定 紙層析結(jié)果：丙氨酸對(duì)照 谷氨酸 烏雞 由于谷氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸為可逆反應(yīng)，所以烏雞組有兩條帶，分別為谷氨酸和丙氨酸，對(duì)照組有一條帶為谷氨酸，標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸和丙氨酸也為一條帶，分別為自身。 2.3.2血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位測(cè)定酶活力單位數(shù)0100 200300400500A52

14、000.0900.2110.3030.4230.522項(xiàng)目種類(lèi)家雞烏雞吸光度0.0650.080100ml血清中酶活力單位數(shù)62773分析與討論 3.1膽固醇含量測(cè)定結(jié)果表明：家雞血清中總膽固醇含量略高于家雞。生活中，可以通過(guò)不同種類(lèi)雞蛋的選擇來(lái)控制膽固醇的攝入量。 3.2醋酸纖維素薄膜電泳總體效果尚可。-球蛋白由于點(diǎn)樣與電泳時(shí)間間隔較長(zhǎng)，電泳效果不太理想，條帶不連貫。全血清電泳應(yīng)該有4條帶，但結(jié)果只有3條，分析原因可能是：(1)搭橋時(shí)，薄膜未繃直，中間塌陷，導(dǎo)致中間兩條帶分離不明顯。(2)電泳時(shí)間不夠長(zhǎng)。在漂洗環(huán)節(jié)，由于漂洗液不夠，導(dǎo)致漂洗效果較差。 3.3從紙層析結(jié)果看谷氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸的效果不理想?？赡苁遣僮鲿r(shí)手指接觸濾紙，干擾最后的顯色，或者是點(diǎn)樣不夠均勻。 3.4谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定結(jié)果表明：烏雞血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力高于家雞，說(shuō)明烏雞體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝更加旺盛。分光光度計(jì)存在一定誤差，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)最后的數(shù)據(jù)有一些影響。參考文獻(xiàn)： 1.酸菜中降膽固醇功能植物乳桿菌的體外篩選-食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)-2011年 第3期 (30)2.地溝油中膽固醇的LCMSMS定性定量檢測(cè)-重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)-2011年 第12