水產(chǎn)品中27種性激素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法（征求意見稿）

1、中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國家市場監(jiān)督管理總局食品安全國家標準水產(chǎn)品中27種性激素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法Determination of 27 sex hormones residues in fishery products by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric（征求意見稿）xxxx-xx-xx實施xxxx-xx-xx發(fā)布GBxxxx20xx中華人民共和國國家標準 發(fā)布GBxxxxxxxx前 言 本標準按照 GB/T 1.12020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則

2、的規(guī)則起草。本標準系首次發(fā)布。I食品安全國家標準水產(chǎn)品中27種性激素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法1 范圍本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中27種性激素殘留量檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。本標準適用于魚、蝦和蟹可食部分中己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龍、諾龍、雄烯二酮、勃地酮、睪酮、炔諾酮、美雄酮、甲基睪酮、康力龍、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮、孕酮、21-羥基孕酮、17-羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮和左炔諾孕酮殘留量的測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適

3、用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T 30891 水產(chǎn)品抽樣規(guī)范3 原理試樣中殘留的性激素用乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶劑和乙酸乙酯依次提取，提取液經(jīng)濃縮、C18固相萃取柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定，內(nèi)標法定量。4 試劑與材料以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。4.1 試劑4.1.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。4.1.2 正己烷（C6H14）：色譜純。4.1.3 甲基叔丁基醚（C5H12O）：色譜純。4.1.4 乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純

4、。4.1.5 冰乙酸（CH3COOH）。4.1.6 三水乙酸鈉（C2H3NaO2.3H2O）。4.1.7 氨水（NH3·H2O）。4.2 溶液配制4.2.1 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：取三水乙酸鈉21.5 g、冰乙酸2.6 mL，加水適量使溶解并稀釋至500ml，混勻。4.2.2 0.02%氨水：取氨水100 L于500 mL水中，混勻。臨用前配制。4.2.3 乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液：取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等體積混合。4.3 標準品4.3.1 性激素：己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龍、諾龍、雄烯二酮、勃地酮、睪酮、炔諾酮、美雄酮、甲

5、基睪酮、康力龍、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮、孕酮、21-羥基孕酮、17-羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮和左炔諾孕酮:含量97%，具體見附錄A。4.3.2 內(nèi)標：己烯雌酚-D8、雌酮-D2、雌二醇-13C2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、左炔諾孕酮-D6和甲羥孕酮-D3:含量97%，具體見附錄A。4.4 標準溶液制備4.4.1 標準儲備液：取性激素類標準品各10mg，精密稱定，分別用甲醇適量使溶解并定容于100 mL棕色容量瓶，配制成濃度均為 100 µg/mL 的標準儲備液。-18以下保存，有效期1年。4.4.2 混合標準中間液：準確量取各標準儲備液適量，于10

6、0 mL棕色容量瓶，用甲醇稀釋配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龍、諾龍、雄烯二酮、勃地酮、睪酮、美雄酮、甲基睪酮、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮、孕酮、21-羥基孕酮、17-羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羥孕酮濃度均為1 g/mL；己烷雌酚、雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、苯甲酸雌二醇和康力龍濃度均為2 g/mL；雌三醇和炔雌醇濃度均為4 g/mL的混合標準中間液。-18以下保存，有效期6個月。4.4.3 混合標準工作液：準確量取混合標準中間液10 mL ，于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龍、諾龍、雄烯二酮、勃地酮、睪酮、美雄酮

7、、甲基睪酮、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮、孕酮、21-羥基孕酮、17-羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羥孕酮濃度均為0.2 g/mL；己烷雌酚、雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、苯甲酸雌二醇和康力龍濃度均為0.4 g/mL；雌三醇和炔雌醇濃度均為0.8 g/mL的混合標準工作液。-18以下保存，有效期3個月。4.4.4 內(nèi)標標準儲備液：取同位素內(nèi)標物各10 mg，精密稱定，分別用甲醇適量使溶解并定容于50 mL棕色容量瓶，配制成濃度為 200 µg/mL的內(nèi)標單標儲備溶液。-18以下保存，有效期1年。4.4.5 混合內(nèi)標工作液：分別準確量取內(nèi)標儲備液適量，于100 mL棕色容

8、量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成雌二醇-13C2 濃度為2 g/mL；己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、甲羥孕酮-D3和左炔諾孕酮-D6濃度均為1 g/mL的混合內(nèi)標工作液。-18以下保存，有效期6個月。4.5 材料4.5.1 C18固相萃取柱：500 mg/3 mL，或相當者。4.5.2 微孔尼龍濾膜：0.22 m。5 儀器和設備5.1 高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。5.2 分析天平：感量0.000 01 g和0.01 g。5.3 高速離心機：1000 0 rpm/min。5.4 渦旋混合器。5.5 均質機。5.6 旋轉蒸發(fā)儀。5.7 固相萃取裝置

9、。5.8 梨形瓶：100 mL。5.9 超聲波清洗器。5.10 塑料離心管：10 mL和50 mL。6 試料的制備與保存6.1 試料的制備按GB/T 30891附錄B的要求制樣。取均質的供試樣品，作為供試試料。取均質的空白樣品，作為空白試料。取均質的空白樣品，添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試料。6.2 試料的保存-18°C以下保存。7 測定步驟7.1 提取取試料5 g（準確至±0.05 g ），于50 mL離心管中，準確加入30 L混合內(nèi)標工作液和乙酸-乙酸鈉緩沖液10 mL，渦旋30 s，加乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液10 mL，渦旋1 min，超聲10 min，渦旋

10、混合1 min，于8 000 r/min離心8 min，取上層有機相于100 mL梨形瓶；殘渣用乙酸乙酯10 mL重復提取一次，有機相合并至梨形瓶中，于35水浴旋轉蒸發(fā)至干。對蒸干后有油脂殘留的樣品，用氮氣或空氣將殘留在油脂中的乙酸乙酯吹除干凈。加入正己烷7mL溶解殘留物，備用。7.2 凈化取C18固相萃取柱，依次用甲醇、正己烷各5 mL活化。取備用液，過柱，控制流速不超過1滴/秒；用正己烷10 mL淋洗，吹干；用甲醇10 mL洗脫，收集洗脫液，于40水浴旋轉蒸發(fā)至干。準確加入甲醇0.85 mL，渦旋混合1 min，再準確加入水0.15 mL，混合30 s，8000 r/min，離心6 min

11、，上清液用0.22 m尼龍濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。7.3 基質匹配標準工作曲線的制備分別取10 L、25 L、50 L、100L 、250 L、500 L混合標準工作溶液于5 mL玻璃離心管中，分別加混合內(nèi)標工作液30 L，吹干，加入經(jīng)7.1和7.2步驟處理所得的基質空白溶液1.0mL，混合1 min，配制成激素濃度為2 ng/ mL400 ng/mL系列基質匹配標準工作液，上機測定。以標準物質特征離子色譜峰的峰面積與內(nèi)標物特征離子色譜峰的峰面積比值為縱坐標，相應的濃度為橫坐標，繪制基質標準工作曲線；求回歸方程和相關系數(shù)。7.4 測定7.4.1液相色譜參考條件a）色譜柱：XBrid

12、ge Shield RP18柱（4.6 mm×150 mm，5 m），或相當者；b）流速：0.4 mL/min；c）進樣量：20 L；d）柱溫：25；e）流動相A：甲醇；流動相；B：0.02%氨水，梯度洗脫程序見表1。表1 梯度洗脫條件時間，min甲醇，%0.02%氨水，%0.085158.0901015.0901015.197320.097320.1851525.085157.4.2質譜參考條件a）離子源：ESI；b）噴霧電壓：3.0 kv；c）離子傳輸管溫度：350；d）鞘氣流速：13.3 L/min；e）輔助氣流速：3.3 L/min；f）碰撞氣壓：1.5 mTorr；g）檢測

13、方式：多反應監(jiān)測（MRM），27種激素及內(nèi)標物多反應監(jiān)測母離子、子離子、碰撞能量和掃描方式見表2。表2 27種性激素及內(nèi)標物母離子、子離子、碰撞能量和掃描方式序號化合物名稱掃描方式母離子/（m/z）錐孔電壓子離子/（m/z）碰撞能量/（ev）內(nèi)標物1己二烯雌酚ESI-264.987236.129己烯雌酚-D8249.1*292己烯雌酚ESI-266.987237.130251.1*283己烷雌酚ESI-269.287134.119雌酮-D2119.1*484雌酮ESI-268.987183.145145.1*405雌二醇ESI-271.287183.2*42雌二醇-13C2145.1436雌三

14、醇ESI-287.187145.146171.1*407炔雌醇ESI-295.187159.135145.1*488苯甲酸雌二醇ESI+377.2126135.110甲羥孕酮-D3105.1*28917- 羥基孕酮ESI+331.2126109.12397.1*231021- 羥基孕酮ESI+331.2126109.12397.1*2311醋酸甲羥孕酮ESI+387.2126123.129327.3*1112醋酸氯地孕酮ESI+405.2126309.314301.2*1913醋酸甲地孕酮ESI+385.2126267.218224.2*2314甲羥孕酮ESI+345.312697.12912

15、3.1*2315炔諾酮ESI+299.287231.217109.1*2616康力龍ESI+329.4126121.13681.1*4317孕酮ESI+315.087109.128孕酮-D997.1*2218左炔諾孕酮ESI+313.287109.130左炔諾孕酮-D6245.2*1819諾龍ESI+275.287257.213甲基睪酮-D3239.2*1620苯丙酸諾龍ESI+407.2126257.2*16105.22821睪酮ESI+289.28797.220109.1*2722勃地酮ESI+287.287121.122135.2*1323群勃龍ESI+271.187199.118253

16、.2*2324甲基睪酮ESI+303.187109.12697.1*2825雄烯二酮ESI+287.287109.12497.1*2026美雄酮ESI+301.287149.212121.1*2327丙酸睪酮ESI+345.2126109.12997.1*3028甲基睪酮-D3ESI+306.287109.2*30 29孕酮-D9ESI+324.2126100.2*2730己烯雌酚-D8ESI-275.287259.4*2831雌酮-D2ESI-271.287147.1*4432左炔諾孕酮-D6ESI+319.2126251.2*1733甲羥孕酮-D3ESI+348.2126126.2*273

17、4雌二醇-13C2ESI-272.987147.143注：*為定量離子7.5 測定法a）定性測定在同樣的測試條件下，試料溶液中激素類藥物的保留時間與標準工作液中激素類藥物的保留時間之比偏差在±2.5以內(nèi)；且檢測到的離子的相對豐度，應當與濃度相當?shù)男Ｕ龢藴嗜芤旱碾x子相對豐度一致。其允許偏差應符合表3的要求。表3 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度，%允許偏差，%>50±202050±251020±3010±50b）定量測定取試料溶液和基質匹配標準工作液，作單點或多點校準，按內(nèi)標法定量。基質匹配標準工作液及試料溶液中目標物的響應

18、值均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。在上述色譜-質譜條件下，標準溶液特征離子質量色譜圖見附錄B。7.6 空白試驗取空白試料，除不加藥物外，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。8 結果計算和表述試料中待測藥物的殘留量按標準曲線或式（1）計算：（1）式中： X試料中待測物的殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；A試料溶液中待測物的峰面積；Ais試料溶液中內(nèi)標的峰面積；As標準溶液中待測物的峰面積；Ais標準溶液中內(nèi)標的峰面積；Cis試料溶液中內(nèi)標濃度，單位為微克每升（g/L）；Cs標準溶液中待測物濃度，單位為微克每升（g/L）；Cis標準溶液中內(nèi)標濃度，單位為微克每升（g/L）；V定容體積，單位為毫升（

19、mL）；m供試試料的質量，單位為克（g）；注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9 方法靈敏度、準確度和精密度9.1 靈敏度本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龍、諾龍、雄烯二酮、勃地酮、睪酮、美雄酮、甲基睪酮、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮、孕酮、21-羥基孕酮、17-羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羥孕酮檢出限為0.5 µg /kg，定量限為1.0 µg/kg；己烷雌酚、雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、苯甲酸雌二醇和康力龍的檢出限為1.0 µg/kg，定量限為2.0 µg/kg；雌三醇和炔雌醇的檢出

20、限為2.0 µg/kg，定量限為4.0 µg/kg。9.2 準確度本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龍、諾龍、雄烯二酮、勃地酮、睪酮、美雄酮、甲基睪酮、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮、孕酮、21-羥基孕酮、17-羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羥孕酮在1.0 µg/kg20 µg/kg添加濃度范圍內(nèi)回收率為60%120%，己烷雌酚、雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、苯甲酸雌二醇和康力龍在2.0 µg/kg40 µg/kg添加濃度范圍內(nèi)回收率為50%120%，雌三醇和炔雌醇在4.0 µg/kg80 µg/k

21、g添加濃度范圍內(nèi)回收率為60%120%。9.3 精密度本方法的批內(nèi)相對標準偏差20%，批間相對標準偏差20%。附錄A（資料性附錄）藥物中英文名稱、化學式和CAS號表A.1 性激素類藥物中英文名稱、化學式和CAS號中文名稱英文名稱化學式CAS號己二烯雌酚DienestrolC18H18O284-17-3己烯雌酚DiethylstilbestrolC18H20O256-53-1己烷雌酚HexestrolC18H22O284-16-2雌酮EstroneC18H22O253-16-7雌二醇-EstradiolC18H24O250-28-2雌三醇EstriolC18H24O350-27-1炔雌醇Ethi

22、nyl EstradiolC20H24O257-63-6苯甲酸雌二醇-Estradiol 3-benzoateC25H28O350-50-017- 羥基孕酮17A-acetoxyprogesteroneC23H32O4302-23-821-羥基孕酮DesoxycorticosteroneC21H30O364-85-7醋酸甲羥孕酮Medroxyprogesterone AcetateC24H34O471-58-9醋酸氯地孕酮Chlormadinone AcetateC23H29CLO4302-22-7醋酸甲地孕酮Megestrol AcetateC24H32O451154-23-5 左炔諾孕酮LevonorgestreC21H28O2797-63-7甲羥孕酮MedroxyprogesteroneC22H32O3520-85-4諾龍NandroloneC18H2