《肽與蛋白質(zhì)》備課材料1

1、肽與蛋白質(zhì)備課材料楊 旭2000年9月3日于北京開始準(zhǔn)備第一章：緒論（2學(xué)時(shí)）l 關(guān)于我們的教材和教學(xué)大綱- 本書蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)是高等教育出版社出版的大學(xué)教材。專供生化專業(yè)和分子生物學(xué)專業(yè)的本科學(xué)生使用。- 我們現(xiàn)在拿到手的是第二版第二次印刷本（1999年11月）。是目前國內(nèi)可以找到的最新版本的該課教材。目前北京大學(xué)生化本科學(xué)生也在使用本教材。- 該教材由北京大學(xué)生命科學(xué)院茹炳根教授（國家教委任命的本書主審）親自推薦，茹教授是我國“蛋白質(zhì)與肽”領(lǐng)域的學(xué)科帶頭人。- 我們采用的教學(xué)大綱也是茹教授所編寫的。一、 蛋白質(zhì)的重要地位（pp1-1）l 組成生命的最基本的物質(zhì)：水、蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、糖類

2、、無機(jī)鹽。生物體是靠蛋白質(zhì)來進(jìn)行和完成生物功能的l 蛋白質(zhì)和肽領(lǐng)的研究是生命科學(xué)的重要組成部分之一，是生命科學(xué)的前沿。人類基因組研究計(jì)劃（Human Genome Project, HGP）以趨完成，后人類基因組研究計(jì)劃將包括（谷志遠(yuǎn)，第173頁）：- 基因克隆計(jì)劃；- 基因組多樣性計(jì)劃；- cDNA（互補(bǔ)DNA）計(jì)劃； 以上三項(xiàng)都是HPG計(jì)劃的延伸- 蛋白質(zhì)計(jì)劃：從基因圖譜轉(zhuǎn)化出蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（信息的-電腦；物質(zhì)的-體外翻譯），大規(guī)模地研究基因產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)與功能；- 細(xì)胞計(jì)劃：以信號(hào)傳遞為主線，闡明發(fā)生在細(xì)胞中的生命現(xiàn)象的奧秘。蛋白質(zhì)計(jì)劃、細(xì)胞計(jì)劃則比前三項(xiàng)更具有開創(chuàng)性。二、 蛋

3、白質(zhì)的組成（pp1-7）18l 氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：氨基酸的共同特點(diǎn)是：與羧基相鄰的-碳原子都有一個(gè)氨基，故稱-氨基酸，結(jié)構(gòu)通式如下。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈基團(tuán)（R-基團(tuán)）不同。l 氨基酸分類：- 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸：共20種，都是L-構(gòu)型的-氨基酸；- 氨基酸衍生物：共5種：L-胱氨酸、L-羥脯氨酸、L-羥賴氨酸、L-甲狀腺素、鎖鏈素；- 非蛋白質(zhì)氨基酸：200多種，常見的如表1-4所示。l 按構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按側(cè)鏈基團(tuán)的物理性質(zhì)分類：見表1-1- 脂肪族類：甘氨酸G、丙氨酸A、纈氨酸V、亮氨酸L、異亮氨酸I；- 羥基類：絲氨酸S、蘇氨酸T；（OH）- 酸性氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E；（

4、2個(gè)羧基：COO）- 堿性氨基酸：組氨酸H、賴氨酸K、精氨酸R；（含氨基或胺基）- 酰胺類：天冬酰胺N、谷氨酰胺Q；（酰胺基）- 含硫類：半胱氨酸C、甲硫氨酸（蛋氨酸）M；（含硫）- 芳香族類：苯丙氨酸F、酪氨酸Y、色氨酸W；（含苯環(huán)）- 亞氨基酸：脯氨酸P（唯一不符合通式的氨基酸）。l 按構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按側(cè)鏈基團(tuán)的疏水性分類：- 疏水氨基酸：丙氨酸A、纈氨酸V、亮氨酸L、異亮氨酸I、甲硫氨酸M、脯氨酸P 、苯丙氨酸F、色氨酸W（gt 0.5）；- 強(qiáng)親水氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E 、組氨酸H、賴氨酸K、精氨酸R（酸性堿性氨基酸）（gt < -2.5）。- 弱親水氨基酸：所有其它氨

5、基酸（gt -0.3 0.4）。l 按構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按側(cè)鏈基團(tuán)的帶電荷情況分類：- 不帶電荷：絲氨酸S、蘇氨酸T 、天冬酰胺N、谷氨酰胺Q、半胱氨酸C、酪氨酸Y（羥基類、酰胺類等）；- 中性溶液帶負(fù)電荷：天冬氨酸D、谷氨酸E（酸性氨基酸）；- 中性溶液帶正電荷：組氨酸H、賴氨酸K、精氨酸R（堿性氨基酸）。三、 蛋白質(zhì)的分類（pp7-8）l 按蛋白質(zhì)化學(xué)組成分類：簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)、結(jié)合蛋白質(zhì)l 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)進(jìn)一步分為七小類（根據(jù)溶解性質(zhì)的不同）：- 清蛋白類（albumins）：又稱為白蛋白，營養(yǎng)成份；- 球蛋白類（globulins）：例如：免疫球蛋白；- 組蛋白類（histones）；存在于染色

6、體中；- 精蛋白類（protamines）：存在于精子中；- 谷蛋白類（glutelins）：存在于禾本植物種子；- 醇溶蛋白類（prolamines）；溶于乙醇；- 硬蛋白類（scleroproteins）：角蛋白、膠原蛋白、絲心蛋白。l 結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)一步分為七小類（根據(jù)非蛋白質(zhì)成分的不同）：- 糖蛋白類（glycoproteins）：與糖類結(jié)合；- 核蛋白類（nucleoproteins）：與核酸結(jié)合；- 脂蛋白類（lipoproteins）：與脂類結(jié)合；- 磷蛋白類（phosphoproteins）：與磷酸共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)；- 金屬蛋白類（metalloproteins）：與金屬離子直接

7、結(jié)合的蛋白質(zhì)；- 血紅素蛋白類（hemoproteins）：與血紅素結(jié)合的蛋白質(zhì)；- 黃素蛋白質(zhì)（flavoproteins）：與黃素核苷酸結(jié)合的蛋白質(zhì)。其他分類：按功能分類、按蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分類。L-：是D-構(gòu)型氨基酸的立體異構(gòu)體，蛋白質(zhì)中都是L-構(gòu)型氨基酸（具有L旋光性）。-碳原子：聯(lián)接氨基酸四個(gè)取代基（羧基、氨基、氫原子、側(cè)鏈(R-)基團(tuán)的碳原子。pK：解離常數(shù)。pI = 1/2 (pK1+pK2) ；pI：等電位點(diǎn)，蛋白質(zhì)在溶液不向正或負(fù)極移動(dòng)。四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介：肽鍵（peptide bond）：是一分子的氨基酸的-羧基與另一分子氨基酸的-氨基脫水縮合而成的酰胺鍵（-COOH + -

8、NH2 = -CO-NH- + H2O）。多肽鏈（polypeptide chain）、氨基末端（amino terminal）、羧基末端（carboxyl terminal）：許多氨基酸借助肽鍵連接成的長(zhǎng)鏈稱為多肽鏈。多肽鏈的兩端的-氨基和-羧基都是游離的，一般將多肽鏈游離的-氨基（寫在分子式左邊）稱為氨基末端或N端；游離的-羧基（寫在分子式右邊）稱為羧基末端或C端。肽（peptide）、多肽（polypeptide）、蛋白質(zhì)（protein）：由氨基酸脫水縮合的化合物稱為肽（或稱縮氨酸）；通常將10個(gè)以上氨基酸組成的肽稱為多肽；分子量大于5000（約4050個(gè)氨基酸殘基）且具有穩(wěn)定的高級(jí)構(gòu)

9、象（空間結(jié)構(gòu)）的稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure）：又稱化學(xué)結(jié)構(gòu)，指的是蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序，包括組成一個(gè)蛋白質(zhì)分子的多肽鏈的數(shù)目和多肽鏈中氨基酸的精確序列兩個(gè)重要方面。二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）：指的是多肽鏈主鏈骨架中若干肽段各自沿著某個(gè)軸盤旋或折疊，并以氫鍵維持，從而形成有規(guī)律的構(gòu)象（空間結(jié)構(gòu)）。如-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角等。超二級(jí)結(jié)構(gòu)（super secondary structure）：指的是蛋白質(zhì)分子中的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，在空間進(jìn)一步聚集、組合在一起，形成的一種

10、高于二級(jí)低于三級(jí)結(jié)構(gòu)的新的空間層次。常見的超二級(jí)結(jié)構(gòu)有、T、等。結(jié)構(gòu)域（domain）：指的是由超二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的緊密、穩(wěn)定，而且在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象上明顯可分的區(qū)域。一般由50-400個(gè)氨基酸組成，它們分別擔(dān)負(fù)蛋白質(zhì)分子的不同功能，是蛋白質(zhì)分子的生物功能實(shí)體。三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）：指的是一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由于其順序相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的互相作用（氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵、配位鍵、二硫鍵），而進(jìn)行范圍廣泛盤旋和折疊，從而產(chǎn)生特定的不規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)（quarternary structure）：指的是各個(gè)亞基（亞單位）在多聚蛋白中的空間排布及

11、亞基的互相作用。第三章：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定（7學(xué)時(shí)）第一節(jié)：蛋白質(zhì)序列測(cè)定的基本戰(zhàn)略和步驟（pp86-88）一、 序列測(cè)定的基本戰(zhàn)略（pp86-87）1S. Moore基本戰(zhàn)略（又稱兩種或兩種以上的特異性裂解）這種戰(zhàn)略由美國科學(xué)家S. Moore于50年首創(chuàng)，且至今仍在沿用。它的要點(diǎn)是：用兩種方法分別將蛋白質(zhì)的肽鏈專一性的切斷，各自得到一系列的肽段；將這些肽段分離純化，測(cè)出它們的序列；將兩套肽序列的結(jié)果對(duì)在一起，得到蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。原則上，只要兩套斷鏈的切點(diǎn)都不同，就能解出一級(jí)結(jié)構(gòu)。（圖3-1A）由于此法所用的試劑易得，所以現(xiàn)在仍然被廣泛使用。（參見111頁，圖3-15）特異性裂解，根據(jù)裂解

12、的方法可以分為兩類：l 酶法裂解：產(chǎn)生的肽較小（5-20個(gè)殘基），適用于手工序列分析；l 化學(xué)法裂解：產(chǎn)生的肽較大（50-100個(gè)殘基），適用于序列機(jī)分析。2 逐級(jí)特異性裂解戰(zhàn)略（見圖3-1B）是70年代后提出的方案。此法優(yōu)點(diǎn)是：可以防止盲目性，有利于以后肽鏈的重排，也可以使分離純化簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)是：所需的斷裂試劑種類多，選擇合適的斷裂試劑很難。3 選擇測(cè)序戰(zhàn)略的主要依據(jù)l 所掌握和具備的肽鏈裂解方法；l 所具備的分離純化條件；l 尋找接頭肽（重疊肽）。二、 序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作及測(cè)定的一般步驟（pp87-88）、序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作1 蛋白質(zhì)制劑的提純和純度要求：蛋白質(zhì)制劑的提純方法詳見第二章。

13、一般要求其純度在97 %以上，如果雜蛋白含量超過了5 %時(shí)便很難測(cè)定序列，蛋白質(zhì)制劑中的雜質(zhì)蛋白含量達(dá)到一定程度時(shí)，一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果將是沒有意義的。2 蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定：這個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)于確定蛋白質(zhì)肽鏈的組成是很重要的。測(cè)定分子量的目的主要是為了估計(jì)序列工作量的大小。對(duì)分子量測(cè)定的準(zhǔn)確性要求不高，誤差在10%左右就足夠了。常用的方法有：l 凝膠層析法：包括“凝膠柱層析測(cè)定法”和“凝膠薄板層析法”。第一版103-106頁l SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：第一版106頁；第二版57-59頁l 沉降分析法：包括“沉降速度法”和“沉降平衡法”第一版101-103頁3 確定組成蛋白質(zhì)的多肽鏈（亞基）的數(shù)目、種

14、類和大?。簂 亞基的數(shù)目：采取亞基拆離處理之后，如果蛋白質(zhì)的分子量變小了，就說明蛋白質(zhì)是由多條肽鏈組成。測(cè)量每分子蛋白質(zhì)所含的N-末端殘基數(shù)目，或者SDS凝膠電泳帶的數(shù)目，都可以確定亞基的數(shù)目。拆離處理的方法根據(jù)亞基間交聯(lián)的化學(xué)鍵的種類有所不同：如非共價(jià)交聯(lián)，可用高濃度變性劑（如8mol/L尿素）拆離；二硫鍵共價(jià)交聯(lián)，可用過甲酸氧化法和還原-羧甲基化法拆離。l 亞基的種類：組成蛋白質(zhì)的亞基可能是相同的，也可能是不同的。是否相同，可以用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、N-末端測(cè)定法和高壓液相色譜法（HPLC）來確定。如果相同，則不需要分離處理；如果不相同，就要進(jìn)行分離和提純處理，并制備供分析用的足夠

15、的樣品。l 亞基的分子量：測(cè)量方法與蛋白質(zhì)的相同。序列測(cè)定的一般步驟其工作內(nèi)容包括：1 蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析2 末端氨基酸的測(cè)定3 肽鏈的專一性水解和肽段的分離純化4 肽段的序列測(cè)定5 由已知序列肽段建立蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)以下各個(gè)步驟作詳細(xì)的介紹。第二節(jié)：蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析（pp88-92）氨基酸組成成分分析是蛋白質(zhì)化學(xué)的重要內(nèi)容之一，也是序列測(cè)定的重要組成部分。要測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成，首先要把蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸的混合物。一、 蛋白質(zhì)的水解（pp88-89）常見的有：鹽酸水解法、磺酸水解法、酶水解法，以下分別介紹：1 鹽酸水解法：本法是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法。方法較為簡(jiǎn)便，而

16、且，除了能夠較滿意的得到除色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）之外的所有氨基酸。方法：使用重蒸5.7mol/L鹽酸（恒沸點(diǎn)鹽酸），在密閉的水解管中，加熱至105110進(jìn)行蛋白質(zhì)水解。持續(xù)2472小時(shí)。注意：色氨酸（Trp）基本上全部被破壞，必需用其它的方法測(cè)定；含硫類的半胱氨酸（Cys）可被部分破壞和氧化，最好是在氧化成穩(wěn)定的磺基丙氨酸后再測(cè)定其含量。 羥基類的絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）分解緩慢。要準(zhǔn)確測(cè)定，需要做幾個(gè)水解時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，然后測(cè)定的氨基酸含量，再外推到分解時(shí)間為零時(shí)的含量。含有脂肪族的纈氨酸（Val）和異亮氨酸（Ile）由于支鏈的空間障礙，而水解緩慢，所以水解的時(shí)間要比較長(zhǎng)

17、。酰胺類的天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）在酸水解時(shí)，會(huì)脫酰胺，全部變?yōu)樘於彼幔ˋsp）和谷氨酸（Glu）?？梢岳妹擋０窌r(shí)放出的氨氣的數(shù)量來測(cè)定它們的總量。含硫類的甲硫氨酸（Met）鹽酸水解時(shí)，易被氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼犴浚瑩p失20%左右。可以用這一數(shù)值來進(jìn)行校正。如果在水解時(shí)加入0.11.0 % 巰基乙酸和0.050.1%的苯酚，可以使絲氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）回收率明顯提高，甲硫氨酸（Met）也不破壞。2 磺酸水解法：磺酸是非氧化性強(qiáng)酸，用它來代替鹽酸有許多優(yōu)點(diǎn)，近年已被廣泛使用。方法：用4mol/L甲基磺酸，內(nèi)含0.2 % -吲哚基乙胺（色胺）作水解劑。在密閉的水解管中，

18、加熱至105110進(jìn)行蛋白質(zhì)水解。持續(xù)2472小時(shí)。優(yōu)點(diǎn)：水解液是中性的，水解后可以直接上機(jī)分析；本法可使色氨酸（Trp）的回收率達(dá)到90%以上；使羥基類的絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）回收率接近定量值。注意：注意細(xì)心地用堿將水解液中和至中性，這一點(diǎn)較難掌握；局限性：當(dāng)水解液中存在碳水化合物時(shí)，色氨酸（Trp）容易被破壞，因此對(duì)糖蛋白分子，不能用本法測(cè)定色氨酸。半胱氨酸（Cys）的測(cè)定較為復(fù)雜：待水解結(jié)束后，加入二硫蘇糖醇還原水解液中的胱氨酸，然后用過量的連四硫酸鈉氧化，得到S-磺基半胱氨酸，加以測(cè)定。3 酶水解法：方法：選用專一性低，水解活力高的蛋白酶水解。缺點(diǎn)：酶水解法最大的問題是水解

19、不徹底，回收率不夠高。優(yōu)點(diǎn)：在鹽酸水解法中容易破壞的色氨酸（Try）、天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）等都可以用酶水解法直接得到。二、 氨基酸的分離和定量測(cè)定（pp89-90）氨基酸的分離和定量測(cè)定采用的是“氨基酸自動(dòng)分析儀”。1 分離原理：為離子交換層析，使用的柱材料為磺酸型聚苯乙烯陽離子交換樹脂。在pH 2.0的條件下，全部氨基酸都能牢固地結(jié)合在樹脂上。不斷地提高pH值和離子強(qiáng)度，可以將氨基酸依次洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。2 定量原理：洗脫下來的氨基酸與茚三酮起反應(yīng)，生成紫色化合物（Ruheman紫），可用分光光度計(jì)于570nm比色處測(cè)定（見89頁式3-2）。僅僅脯氨酸（結(jié)構(gòu)不符

20、合通式）例外，與茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物，于440nm處比色測(cè)定。根據(jù)每種氨基酸的峰高或峰面積，分析儀自動(dòng)計(jì)算出各氨基酸摩爾濃度（作為分子）、被測(cè)蛋白質(zhì)的摩爾濃度（作為分母）和某氨基酸的殘基數(shù)（商）。目前，氨基酸自動(dòng)分析儀已經(jīng)達(dá)到了很高的技術(shù)水平，充分體現(xiàn)了快速、微量和自動(dòng)化（見90頁，圖3-2）。三、 特殊氨基酸的測(cè)定（pp90-92）1 色氨酸（Trp）的測(cè)定：由于在鹽酸水解過程中，色氨酸幾乎全部被破壞，所以測(cè)定色氨酸要用其他的方法。除了改良的水解法之外，還有兩種光吸收法：紫外吸收法：方法：先將蛋白質(zhì)樣品溶于6mol/L鹽酸胍溶液中，然后采用紫外分光光度計(jì)分別在280nm和288nm處蛋白

21、質(zhì)溶液的光吸收值A(chǔ)280和A288。原理：由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）在280nm和288nm的紫外區(qū)有光吸收，因此可用完整的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行色氨酸的測(cè)量。色氨酸在280nm和288nm的摩爾消光系數(shù)分別是4815和5690；酪氨酸在280nm和288nm的摩爾消光系數(shù)分別是358和1280。根據(jù)測(cè)定混合物中兩種物質(zhì)的比爾定律，可以得到（酪氨酸的摩爾濃度是已知的）：2 對(duì)-二甲基氨基苯甲醛法：色氨酸的吲哚核在強(qiáng)酸條件下與醛反應(yīng)生成帶色產(chǎn)物。在這個(gè)反應(yīng)中，含有色氨酸的蛋白質(zhì)的堿性水解液加入對(duì)-二甲基氨基苯甲醛的濃硫酸溶液（10%），再加入亞硝酸納溶液，經(jīng)一定時(shí)間之后，生成藍(lán)顏色，顏色的深

22、淺與色氨酸含量成直線關(guān)系。該帶色物質(zhì)的最大吸收峰位在590nm處。該法已經(jīng)廣泛采用，結(jié)果可靠。2 巰基測(cè)定：測(cè)定巰基常用下列兩種比色法：DTNB法：DTNB（即5.5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸，表達(dá)為ESSE），與巰基反應(yīng)后生成CNT（即4-硝基-3-羥基硫酚，表達(dá)為ES-），在412nm處的摩爾消光系數(shù)為11400 L/mol.cm。Protein-S-（蛋白質(zhì)）ßESSE（即：DTNB）Protein-SSE + ES-ßProtein-S-（蛋白質(zhì)）Protein-SS-Protein + ES-萘醌測(cè)定法：萘醌與巰基有當(dāng)量加成關(guān)系，加成物在420 nm左右

23、有吸收峰，標(biāo)準(zhǔn)物和未知物在相同條件下測(cè)定，光密度增值與巰基濃度成正比。3 二硫鍵的測(cè)定：Ellman試劑法：Protein-SS-Proteinß Protein-S- + 2 ESSE3 Protein-SSE+ ES- （pH10.5之前測(cè)得的ES-數(shù)）ßpH=10.53 Protein-S-+ 3 ES-（pH10.5之后測(cè)得的ES-數(shù)）二硫鍵的數(shù)目=(pH10.5之后測(cè)得的ES-數(shù))-2(pH10.5之前測(cè)得的ES-數(shù))¸2上式中二硫鍵的數(shù)目=（4）-2（1） ¸2 = 1NTSB法：NTSB（即2-硝基-5-硫代苯磺酸，表達(dá)為ESSO3-）Pr

24、otein-SS-Proteinß SO32-（過量亞硫酸鹽）Protein-S- + Protein-SSO3-ßESSO3- （NTSB）Protein-SSO3-+ ES-二硫鍵的數(shù)目= ES-的數(shù)目。RS- 在412nm處的摩爾消光系數(shù)為11400 L/mol.cm。4 氨基的測(cè)定：測(cè)定蛋白質(zhì)和肽中的氨基酸常用NTBS法、熒光胺法和鄰苯二醛-2-巰基乙醇法。三種方法的特點(diǎn)如下：NTBS法：NTBS（即 2,4,6-三硝基苯磺酸），此法比較靈敏。在溫和條件下試劑即能與伯胺定量反應(yīng)，產(chǎn)物可以用分光光度法測(cè)定。熒光胺法：熒光胺能與伯胺反應(yīng)，生成熒光團(tuán)，熒光團(tuán)可在390nm

25、被激發(fā)，在475nm發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與伯胺濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)是：游離氨的干擾極低；靈敏度可達(dá)到pmole數(shù)量級(jí)。鄰苯二醛-2-巰基乙醇法：鄰苯二醛在2-巰基乙醇存在的條件下，與伯胺生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，可在340nm被激發(fā)，在455nm測(cè)量熒光。優(yōu)點(diǎn)是：在水緩沖液中可溶而且穩(wěn)定；靈敏度比熒光胺還高5-10倍。第三節(jié)：末端氨基酸的測(cè)定（pp92-98）末端分析可分為N末端的測(cè)定和C末端的測(cè)定兩個(gè)方面。一、 N末端的測(cè)定（pp92-96）組成蛋白質(zhì)每條多肽鏈的第一個(gè)氨基酸與內(nèi)部的氨基酸不同，它具有-氨基，這正是進(jìn)行末端氨基酸測(cè)定的基礎(chǔ)。N末端測(cè)定法的共同原理是在N末端引入某種標(biāo)記基團(tuán)，這些基團(tuán)或具有顏色

26、，或具有熒光、紫外吸收等特性。酸水解多肽，獲得氨基酸混合物。然后分離鑒定具有這些基團(tuán)的氨基酸衍生物。1 DNFB法：（傳統(tǒng)的方法）原理：DNFB（即2,4-二硝基氟苯）在溫和的條件下（pH8.0-9.0，室溫）與肽鏈的N端氨基作用，形成二硝基肽鏈（簡(jiǎn)稱DNP-Peptide）。這個(gè)鍵結(jié)合很牢固，經(jīng)鹽酸水解仍然不斷裂，水解后形成的DNP-氨基酸（黃色），可以用乙醚抽提出來，進(jìn)行層析，根據(jù)斑點(diǎn)的位置作定性鑒定；或用溫?zé)岬?%NaHCO3洗脫后，測(cè)360nm波長(zhǎng)的吸收作定量測(cè)定。反應(yīng)過程：H2N-Peptide-COOHß DNFB，室溫，pH8-9DNP-HN-Peptide-COOH

27、+ HFß H+ 水解，105DNP-氨基酸 + 氨基酸（2n）注意：DNP-氨基酸見光易分解，所以操作應(yīng)在暗處進(jìn)行；DNFB不僅與N端的-氨基起反應(yīng)，也與側(cè)鏈上的-氨基、巰基、酚羥基和咪唑基反應(yīng)，但因水解產(chǎn)物極性較強(qiáng)，不被乙醚抽提，故不干擾N端測(cè)定。有些DNP-氨基酸：-DNP-His、DNP-Arg、DNP-Cys、O-DNP-Tyr等均溶于水，不被乙醚抽提，故應(yīng)將水蒸干，分別鑒定。如果檢測(cè)不出DNP-氨基酸，則可能有以下原因： 被分析的肽鏈N端是封閉的，例如：焦谷氨酰基、乙?；?； N端為纈氨酸（Val）和異亮氨酸（Ile），其肽鍵耐酸，要延長(zhǎng)水解； N端為脯氨酸（Pro）和甘

28、氨酸（Gly），兩者易破壞，需縮短水解。2 丹磺酰氯分析法：（廣泛使用的方法）原理和方法：二甲基萘磺酰氯（DNS-CL）是一種熒光試劑，能專一地與N端的-氨基起反應(yīng)，生成氨磺酰衍生物DNS-Peptide，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液移至水解管中，真空干燥，然后加鹽酸水解18小時(shí)。經(jīng)鹽酸水解后，得到DNS-氨基酸（強(qiáng)烈熒光）和其它的游離氨基酸，水解液真空干燥后用無水乙醇溶解，可以直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定，（參見圖3-3）。反應(yīng)過程：H2N-Peptide-COOHß DNS-Cl，pH8-9DNS-HN-Peptide-COOH + HClß H+，105，18hDNS-氨基酸 +

29、氨基酸（2n）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比二硝基氟苯高100倍，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10-9-10-10摩爾；操作簡(jiǎn)便，水解產(chǎn)物不需提取，直接電泳或?qū)游?；雖然組氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cyr）的巰基、酪氨酸（Tyr）的酚基和-氨基酸也能和試劑反應(yīng)，但不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。其他的N末端測(cè)定方法有：異硫氰酸苯酯法、DABITC法等，將在第五節(jié)介紹。3 焦谷氨酰殘基的降解：谷氨酰胺（Gln）發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成焦谷酰胺環(huán)化衍生物是封閉N末端最常見的情況之一（見95頁，式3-14）。目前降解N末端焦谷酰胺殘基有兩種方法：酶解法：用市售的焦谷酰胺肽酶，可以將焦谷酰胺從肽鏈上酶解下來。化學(xué)降解法：（96頁式3-16是

30、錯(cuò)誤的）寫信問過再講。二、 C末端的測(cè)定（pp96-98）1 肼解法：此法是目前測(cè)定C末端殘基最主要的方法之一。原理和方法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與無水肼在100反應(yīng)5-10小時(shí)之后，除了C端氨基酸之外，所有其他氨基酸都轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氨基酸酰肼，C端氨基酸以游離氨基酸釋放出來，借助DNFB試劑和分級(jí)抽提的方法，再用層析技術(shù)可鑒定出種類和數(shù)目。反應(yīng)過程：（見96頁，式3-17）注意：肽的C端為半胱氨酸（Cys）和胱氨酸時(shí)，兩者在肼解時(shí)會(huì)分解，必須先氧化或烷基化后再肼解、才可測(cè)量。2 C末端選擇性氚標(biāo)記法：反應(yīng)過程：（見97頁，圖3-4）：用醋酸酐處理多肽，形成C端酮環(huán)；在氚水存在的情況下，堿催化惡唑環(huán)消旋反應(yīng)，

31、將氚引入惡唑環(huán)；打開惡唑酮環(huán)，重新形成C端氨基酸，此時(shí)C端氨基酸的-碳原子已經(jīng)被氚（3H）標(biāo)記；經(jīng)水解之后，分離鑒定氚標(biāo)記的氨基酸。注意：此法不適于脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）的測(cè)定。3 羧肽酶法：此法也是目前測(cè)定C末端殘基最主要的方法之一原理：羧肽酶是一類外切酶，能專一地從肽鏈的C末端開始逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸。釋放出來的氨基酸數(shù)目和種類隨時(shí)間變化，可用自動(dòng)氨基酸分析儀作定性和定量測(cè)定（見98頁，圖3-5、圖3-6）。反應(yīng)過程：（見97頁，式3-19）AA1AAn-2-AAn-1-AAnß 羧肽酶AA1AAn-2-AAn-1 + AAnß 羧肽酶AA1AAn-

32、2+ AAn-1ß 羧肽酶優(yōu)點(diǎn)：一次就能從C端釋放出一至數(shù)個(gè)氨基酸殘基。注意：變性劑的使用：使用SDS或6mol/L脲，既不影響羧肽酶的活性，又可以破壞蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，使一級(jí)結(jié)構(gòu)不同的C末端氨基酸的釋放速度趨于相近（甘氨酸、脯氨酸很慢；亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸很快）。足夠的酸化：可以穩(wěn)定羧肽酶的活性，提高測(cè)定效率；同時(shí)足以抑制羧基上的正電荷，加快釋放速度。選擇合適的羧肽酶：見98頁，表3-1。4 減數(shù)C末端測(cè)定：（僅適用于小肽）原理和反應(yīng)過程：將肽的N端固定在多孔玻璃球上；用二-P-硝基苯磷酸迭氮物處理，使-COOH轉(zhuǎn)為-CON3（酰迭氮化物）；加熱，使-CON3熱解成-NCO

33、（異氰鹽）；產(chǎn)物經(jīng)酸水解后，使C末端殘基破壞；通過反應(yīng)前后的氨基酸的組成變化確定C末端的氨基酸。玻璃球-peptide-AA-COOHß二-P-硝基苯磷酸迭氮化合物玻璃球-peptide-AA-CON3ß加熱玻璃球-peptide-AA-NCOß酸水解玻璃球-peptide5 還原法：是很老的方法，現(xiàn)在一般不用。第四節(jié)：肽鏈的專一性水解和肽段的分離純化（pp98-105）一、 肽鏈的專一性水解（pp98-104）通常用降解法測(cè)肽鏈的氨基酸序列，一次只能連續(xù)降解10個(gè)殘基；用手工方法測(cè)序，一次最多能測(cè)20多個(gè)殘基。所以必須將大肽先裂解為小肽，然后再分別測(cè)定各個(gè)肽段的

34、序列，最后才能解讀出整個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。方法分為兩類：化學(xué)法裂解和酶法裂解。裂解前必須注意三個(gè)問題：使用酶法時(shí)，需考慮：是讓蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下裂解？還是先變性，后裂解？裂解時(shí)，是否想完整保留二硫鍵？在裂解和提純的過程中，是否出現(xiàn)了原來并不存在的二硫鍵？1、 蛋白質(zhì)的化學(xué)法裂解特點(diǎn)：化學(xué)法裂解的肽段一般較大，適合于用自動(dòng)序列分析儀測(cè)定，同時(shí)有利于肽段的吻合，特別適合分析分子量較大的蛋白質(zhì)。1 溴化氰（CNBr）裂解：原理：溴化氰能與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸（Met）R側(cè)鏈中的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯。此產(chǎn)物與水進(jìn)一步反應(yīng)，將肽鍵斷裂。N端一側(cè)的C端成為高絲氨酸內(nèi)酯，C端一側(cè)的N端不改變。因?yàn)榈?/p>

35、白質(zhì)一般含甲硫氨酸較少，所以能夠得到較大的肽段。反應(yīng)過程：反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)-Met-NH-AA-ß BrCN-Br-+Met-CN-NH-AA-ß-溴化亞氨內(nèi)酯= N+H-AA- +CH3-S-CNß H2O, H+-高絲氨酸內(nèi)酯 + +H3N-AA-+ Br-ß H2O, OH（右側(cè)小肽的N端）-高絲氨酸（左側(cè)小肽的C端）方法說明：防止氧化：甲硫氨酸如果被氧化為砜和亞砜，則不能發(fā)生裂解反應(yīng)，所以整個(gè)反應(yīng)要在氮?dú)馊萜髦羞M(jìn)行；溴化氰對(duì)甲硫氨酸要過量50-100倍（摩爾比）；反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)；CNBr裂解采用酸性條件，可引起Asp-Pro（天冬-脯）鍵的斷裂

36、，如果某一序列含有這個(gè)鍵，所得的肽段數(shù)目就比根據(jù)甲硫氨酸預(yù)計(jì)的數(shù)目多。注意：當(dāng)溴化氰裂解含Met-X肽鍵時(shí)，X的性質(zhì)可以影響裂解速度；當(dāng)X為羥基類絲氨酸或蘇氨酸時(shí)，可以使甲硫氨酸變成高絲氨酸，因而不能裂解肽鍵（見100頁，圖3-7），解決方法為增加CNBr的使用量。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)率高（85%）、專一性強(qiáng)、切點(diǎn)少，使用廣泛。2 BNPS-Skatole法：原理：BNPS-Skatole是一種溫和的氧化劑和溴化劑，可以對(duì)芳香族的色氨酸（Trp）有專一性裂解能力。它可以色氨酸的殘基的右側(cè)（C末端一側(cè)）裂解肽鍵。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)一般含色氨酸極少，所以能夠得到大的肽段，成為很有用的裂解方法。反應(yīng)過程：（見101頁，

37、圖3-8）注意：由于試劑對(duì)光敏感，不穩(wěn)定，所以反應(yīng)要在暗處進(jìn)行；甲硫氨酸（Met）可以與試劑發(fā)生作用，反應(yīng)結(jié)束后可以使用巰基乙醇消除影響；酪氨酸（Tyr）也可以與試劑發(fā)生反應(yīng)，如果加入過量的酪氨酸則可以這種反應(yīng)的發(fā)生。3 亞碘?；郊姿崃呀夥ǎ涸砗头椒ǎ捍嗽噭┛稍谙喈?dāng)溫和的條件下裂解Trp-X（色-X）肽鍵，其機(jī)理也是氧化吲哚環(huán)。產(chǎn)率高達(dá)70-100%。蛋白質(zhì)溶解于4mol/L鹽酸胍（用80%醋酸液配置）中，再加適量甲酚。于室溫、暗處反應(yīng)24小時(shí)。過量試劑用DTT破壞。反應(yīng)過程：（見101頁，圖3-9）注意：要用純化的亞碘?；郊姿?，因?yàn)殡s質(zhì)碘?；郊姿峥梢栽贖is-X鍵上裂解。甲酚的功能就

38、是清除殘余的碘酰基苯甲酸，改善裂解的選擇性。4 X-Cys（X-半胱）鍵的裂解：有兩種試劑可以在半胱氨酸N端側(cè)專一性裂解肽鏈，裂解產(chǎn)率90大于%：NTCB, 即2-硝基-5-硫氰苯甲酸；Cyssor, 即（2-甲基）-N-1-苯磺酰胺。反應(yīng)過程見102頁，圖3-105 羥胺裂解法：羥胺能夠?qū)Ｒ恍粤呀釧sn-Gly（天冬酰胺-甘氨酸）之間的肽鍵，因?yàn)槌霈F(xiàn)的幾率很低，所以此法降解的肽段都很大，對(duì)分子量大的蛋白質(zhì)測(cè)序十分有用。原理：通過羥胺作用，先形成琥珀酰亞胺環(huán)狀物，最后導(dǎo)致Asn-Gly鍵裂解。方法：先制備含6mol/L胍的2mpl/L羥胺溶液，用NaOH調(diào)pH至9.0；加入蛋白質(zhì)（濃度為4-5

39、mg/ml）；反應(yīng)條件為：pH9.0、45 、4-5小時(shí)；加0.1體積的醋酸終止反應(yīng)。反應(yīng)過程：Peptide-Asn-Gly-PeptideßPeptide -環(huán)亞酰胺-Gly- Peptideß NH2OH（羥胺）Peptide -Asp-羥胺 + Gly-PeptidePeptide -Asp-羥胺6 Asp-Pro鍵的裂解（部分酸水解法）：老方法，專一性不好。2、 蛋白質(zhì)的酶法裂解1優(yōu)點(diǎn)： 專一性強(qiáng)； 降解后的肽段容易純化； 裂解產(chǎn)率較高； 副反應(yīng)少，在酸水解中容易被破壞的Gln、Asn 和Trp等在酶解時(shí)不受影響。2影響因素： 合適的pH值； 合適的反應(yīng)溫度； 恰

40、當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)與酶的比率； 選擇相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間； 待裂解蛋白質(zhì)的物理狀態(tài)。注意實(shí)驗(yàn)前做好預(yù)實(shí)驗(yàn)。3常用的內(nèi)切酶：胰蛋白酶：高度專一性，只切堿性的Lys（賴）和Arg（精）的右側(cè)，常用；胰凝乳蛋白酶：專一性寬，芳香族氨基酸的右側(cè)；胃蛋白酶：專一性更寬，芳香族氨基酸和Leu（亮）；枯草桿菌蛋白酶：專一性差，裂解出足夠小的肽段；木瓜蛋白酶：專一性差，但對(duì)Lys（賴）和Arg（精）的右側(cè)敏感；嗜熱菌蛋白酶：耐熱，所有疏水氨基酸的的左側(cè)，很常用；新近發(fā)現(xiàn)的高專一性蛋白水解酶：Glu蛋白酶（谷右）：來自金黃色葡萄球菌，又稱（V8蛋白水解酶）； Arg蛋白酶（精右）：又稱Clostripain，已廣泛用于蛋白質(zhì)

41、序列分析； Lys蛋白酶（半左）：來自A. mellea菌， Pro蛋白酶（脯右）：來自小羊的腎細(xì)胞。二、 肽段的分離純化及純度鑒定（pp104-105）1、 肽段的分離純化原因：肽鍵裂解后得到各種不同大小肽段的混合物，在序列測(cè)定之前一定要分離歸類，每種肽段都要純化（工作量非常大）。原理：根據(jù)肽段的理化特征，包括：分子的大小、電荷、極性、溶解度、以及與特殊的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵結(jié)合等特性進(jìn)行分離和純化。方法：凝膠過濾法、離子交換法、薄層層析法、薄層電泳法、毛細(xì)管電泳法等。1 對(duì)角線法：（一種獨(dú)特的傳統(tǒng)方法）不改變肽段性質(zhì)：在雙向電泳或者雙向?qū)游鲋?，若兩個(gè)向上的電泳或?qū)游龆荚谙嗤臈l件下完成，結(jié)果會(huì)

42、得到對(duì)角線圖譜，即所有的組分（肽段）的斑點(diǎn)都分布在一條對(duì)角線上。改變某些肽段的性質(zhì)：如果有些肽段在第一向和第二向的遷移率不同，則它們就不會(huì)分布在對(duì)角線上，因此，可以被表征、分離。要使肽段在兩向上的遷移率不同，就要在第一向分離后，改變某個(gè)肽段的性質(zhì)。被改變性質(zhì)的肽段在第二向分離后，就可以離開對(duì)角線。舉例：如果某個(gè)肽段含有二硫鍵，則可以在第一向之后，將二硫鍵還原，這時(shí)含有二硫鍵的肽段會(huì)裂解為兩個(gè)更小的肽段，再進(jìn)行第二向分離，它們就會(huì)離開對(duì)角線，得到分離。適用范圍：含巰基、甲硫氨酸、賴氨酸的肽段，和胰蛋白酶降解后的C端肽段。2 高壓液相色譜法：（廣泛使用的方法）特點(diǎn)：收率高：一般大于90%，有時(shí)高達(dá)

43、100%；分離快速：傳統(tǒng)方法要幾天完成的任務(wù)，HPLC只需要1小時(shí)；靈敏度高、分辨率高：很微量（10ng）的肽段也能分離；2、 肽段定量檢測(cè)方法：1 紫外吸收法：肽鍵在200-210nm處有強(qiáng)吸收，是最方便的定量方法；2 茚三酮比色法：570nm處比色。常用，但靈敏度低；3 鄰苯二醛熒光法：激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm。靈敏度高出茚三酮法1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。（紫外線：400nm；可見光：>400nm）3、 肽段純度鑒定：在肽混合物分離過程中，常常要鑒定個(gè)別分離物的純度，以便決定是否需要進(jìn)一步提純。雖然層析和電泳中只有一條帶（一個(gè)斑）即可能是純肽。但是一般說，鑒定肽是否純的唯一標(biāo)準(zhǔn)是

44、：純肽只有一個(gè)N端。這是因?yàn)?，如果有二硫鍵的存在，可能使兩條肽段連在一起，雖然層析和電泳時(shí)只有一條帶或一個(gè)斑；但是出現(xiàn)了2個(gè)N端，這表明不是純肽。第五節(jié)：肽段的序列測(cè)定（pp105-111）一、 手工序列測(cè)定技術(shù)（pp105-110）包括：化學(xué)法、酶學(xué)法1、 Edman化學(xué)降解法：迄今仍然是最基本和有效的方法。原理：蛋白質(zhì)或多肽的自由-氨基與異硫氰酸苯酯（PITC）耦聯(lián)之后，與其緊鄰的第二個(gè)氨基酸殘基的鍵合力大大減弱，很易斷裂，所以在無水酸作用下，僅切下自由-氨基的殘基，切下的氨基酸被抽提，并被鑒定。當(dāng)切下N端這個(gè)殘基后，緊鄰的那個(gè)殘基（第二個(gè)）便暴露出來，成為了新的自由-氨基酸，又可與PIT

45、C進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)，再切下第二個(gè)殘基，以此循環(huán)。至多可以測(cè)定60-70個(gè)殘基。反應(yīng)過程：（見106頁，式3-13）提前去教室畫圖1 耦聯(lián)反應(yīng)：肽的自由-氨基與異硫氰酸苯酯（PITC）在堿性條件下發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)，生成異硫氰酸苯酯肽（PTC-肽）。2 斷裂反應(yīng)：在強(qiáng)酸作用下，PTC-肽的近N端肽鍵斷裂，產(chǎn)生2-苯胺基-5-噻唑啉酮衍生物（PTZ），同時(shí)形成少了一個(gè)氨基酸的新肽，新肽的N端仍然是自由的，可以進(jìn)一步與PITC反應(yīng)，進(jìn)行第二次降解。3 轉(zhuǎn)化反應(yīng)：斷裂產(chǎn)物PTZ不穩(wěn)定，為了隨后的N端氨基酸分析測(cè)定，將PTZ轉(zhuǎn)化為3-苯基-2-乙內(nèi)酰脲（PTH-AA）。分析方法：每一次循環(huán)之后，可用乙酸乙酯抽提生

46、成的PTH-AA。PTH-AA非常穩(wěn)定，抽提后可以用薄層層析、氣相色譜、高壓液相色譜法、回水解法（指的是：用酸水解PTH-AA，使其轉(zhuǎn)化為游離氨基酸，再用氨基酸分析儀分析）分析，確定這一輪是某種氨基酸。反應(yīng)的限制因素：關(guān)鍵是肽轉(zhuǎn)變成PTC-肽，及隨后降解反應(yīng)的產(chǎn)率。如果這兩步的總產(chǎn)率是95%，則可以連續(xù)測(cè)定15個(gè)殘基（總產(chǎn)率約45%）；如果這兩步的總產(chǎn)率是99%，則可以連續(xù)測(cè)定60-70個(gè)殘基（總產(chǎn)率約50%）。2、 減數(shù)Edman序列分析法：這是一種改良Edman降解技術(shù)。每一種反應(yīng)階段之后，將未反應(yīng)的肽水解，并進(jìn)行氨基酸組成的全分析，可用氨基酸自動(dòng)分析儀或紙電泳的方法。依據(jù)氨基酸減少的情況

47、，可以推斷出N端氨基酸的排列順序。對(duì)于小肽來說，此法更快、更準(zhǔn)確，只要一臺(tái)氨基酸自動(dòng)分析儀就夠了。少于10-15個(gè)殘基的小肽可用本法來測(cè)定。3、 DNS-Edman序列分析法：這也是一種改良Edman降解技術(shù)。此法將高靈敏度的丹磺酰氯技術(shù)（DNS-Cl，參見94頁）與能連續(xù)降解的Edman降解反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來。原理： DNS的作用：降解、標(biāo)定、檢測(cè)末端氨基酸：由于水解后的生成物是帶熒光的DNS-AA，其檢出的靈敏度比Edman法高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。 PITC的作用：降解、清掃剩余的末端氨基酸，為下一步的測(cè)序清除障礙。缺點(diǎn)：在與DNS-Cl的反應(yīng)中，谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）誤讀為谷氨

48、酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），而且不能檢出色氨酸（Trp）。反應(yīng)過程（見107頁，式3-14）：提前去教室畫圖4、 DABITC/PITC雙耦合法：一種改良Edman法，靈敏度非常高。原理：與DNS-Edman法類似。 DABITC的作用：降解、標(biāo)定、檢測(cè)末端氨基酸。層析出的DABTH-AA，經(jīng)鹽酸蒸氣熏，能顯示紅色的斑點(diǎn)，而雜質(zhì)和試劑的反應(yīng)物顯藍(lán)色或紫色斑點(diǎn)，極大地提高靈敏度，只需微量的樣品即可，靈敏度達(dá)到p mol的數(shù)量級(jí)。 PITC的作用：降解、清掃剩余的末端氨基酸，為下一步的測(cè)序清除障礙。由于DABITC（4-N,N-二甲基氨基偶氮苯-4-異硫氰酸酯）耦合的反應(yīng)產(chǎn)率低，一般不到50

49、%，故用PITC（異硫氰酸苯酯）作再次耦合、降解，其到清掃剩余的末端氨基酸，提高反應(yīng)產(chǎn)率的作用。反應(yīng)過程：見108頁式3-21（DABITC的作用）。5、 酶學(xué)降解測(cè)定肽序列（了解一下，實(shí)際中困難很多）1 氨肽酶法：氨肽酶是專一性從N端逐個(gè)降解多肽的一類外肽酶。種類很多。2 羧肽酶法：特點(diǎn)是能從C端專一性逐個(gè)降解多肽，和化學(xué)法及氨肽酶法不同。3 外肽二肽酶法：每隔兩個(gè)殘基切一次。分二肽氨肽酶和二肽羧肽酶兩類。二、 自動(dòng)序列分析（pp110-111）有三類蛋白質(zhì)序列儀：液相序列儀、固相序列儀、氣相序列儀?；驹硐嗤?，都是采用Edman反應(yīng)，逐個(gè)降解N端殘基，然后自動(dòng)檢出殘基性質(zhì)和數(shù)量，最后自動(dòng)

50、報(bào)告肽鏈的氨基酸序列。1 液相序列儀：優(yōu)點(diǎn)：收率高，可達(dá)97%；可以連續(xù)測(cè)定20-50殘基。缺點(diǎn)：不適合于小肽的測(cè)定（易從反應(yīng)杯中洗出）。2 固相序列儀：優(yōu)點(diǎn)：可以測(cè)定小肽；可以測(cè)定疏水性肽。缺點(diǎn)：收率低（結(jié)合到了固相上），有時(shí)僅20-30%。3 氣（液固）相序列儀：靈敏度高，可以測(cè)定5 p mol水平樣品；試劑和溶劑消耗低，約為液相的1/10；速度快，最多一次可以測(cè)定55個(gè)殘基；收率高，重復(fù)收率可以達(dá)到98%。缺點(diǎn)：非常昂貴，非一般實(shí)驗(yàn)室所能設(shè)置。第六節(jié)：由已知序列肽段建立蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（pp111-113）一、 重疊肽（接頭肽）（pp111-111）尋找重疊肽，是S. Moore基本戰(zhàn)略的

51、關(guān)鍵之一。1 S. Moore基本戰(zhàn)略的原理：必須使用至少兩套切肽鏈的方法，得到兩套以上的肽段氨基酸排列順序。而且，每套斷鏈的方法沒有相同的切點(diǎn)，這樣就出現(xiàn)了下圖的情況。因此，可以借助重疊肽，建立蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。原始肽鏈 NC 1 2 3第一套肽 N C（共7段） 第二套肽 N -C（共4段） 1' 2' 3'2 重疊肽的概念：第一套肽段較小，有數(shù)個(gè)肽段（1, 2n）正好跨過了第二套肽的相應(yīng)的缺口（1', 2'n'）。在第一套肽段中，那些可以跨過第二套肽段缺口的片段被稱為重疊肽，通過對(duì)比氨基酸殘基排列順序的方法，它們所具有將第二套肽正確對(duì)接和排列

52、的功能。二、 二硫鍵位置的確定（pp112-112）原理：我們知道，二硫鍵是構(gòu)成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力之一。它在一級(jí)結(jié)構(gòu)中的物質(zhì)基礎(chǔ)是半胱氨酸（Cys）。為了測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，肽鏈中的二硫鍵都被還原成為半胱氨酸，并用烷基化法保護(hù)。在一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定完畢之后，就可以確定二硫鍵的位置了。方法：1 酶切法：用酶來水解原蛋白質(zhì)，可以保留二硫鍵的完整性。再找出含有二硫鍵的肽段，將這個(gè)肽的二硫鍵拆開，分別測(cè)定拆開后的兩條肽段的序列，將這兩條肽段的氨基酸殘基排列順序與原來的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比，就能找出相應(yīng)的二硫鍵的位置。2 14C-碘乙酰胺封閉法：若二硫鍵在一條肽鏈中存在，而且該肽鏈內(nèi)還有另一個(gè)半胱

53、氨酸（Cys），則在二硫鍵未被拆開之前，將獨(dú)立的半胱氨酸用14C-碘乙酰胺封閉和標(biāo)記。這樣就可以確定那兩個(gè)Cys組成了二硫鍵。3 雙酶切法：如果一條肽鏈內(nèi)含有兩個(gè)二硫鍵，用胰蛋白酶水解又得不到含有一個(gè)二硫鍵的肽段時(shí)，可以進(jìn)一步用胰凝乳蛋白酶水解，或用其它方法水解，直到得到含有一個(gè)二硫鍵的肽段，然后按前述的方法確定二硫鍵的位置。三、 酰胺基位置的確定（pp112-112）原理：在蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析時(shí)（第二節(jié)、一、蛋白質(zhì)的水解），如果發(fā)現(xiàn)有酰胺基存在，則在本階段一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中就要確定酰胺鍵的確切的位置。多肽鏈中的側(cè)鏈和C端的羧基（即Glx或Asx）：有可能以-COOH形式存在（谷氨酸Glu或者天冬氨酸Asp），也可能以-CONH3形式存在（谷氨酰