葡枝根霉木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)開(kāi)題報(bào)告

1、.安徽工程大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）材料之二（2）本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)開(kāi)題報(bào)告題目：葡枝根霉木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究 課 題 類(lèi) 型： 設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)研究 論文 學(xué) 生 姓 名： 鄒軍 學(xué) 號(hào)： 3112106128 專(zhuān) 業(yè) 班 級(jí)： 生物工程2111學(xué) 院： 機(jī)電學(xué)院指 導(dǎo) 教 師： 張慶慶（教授）開(kāi) 題 時(shí) 間： 2015年3月 日2015年 3月 日開(kāi)題報(bào)告內(nèi)容與要求一、本課題的研究意義、研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)（文獻(xiàn)綜述）二、研究方案及工作計(jì)劃（含工作重點(diǎn)與難點(diǎn)及擬采用的途徑）三、閱讀的主要參考文獻(xiàn)（不少于10篇，期刊類(lèi)文獻(xiàn)不少于7篇，應(yīng)有一定數(shù)量的外文文獻(xiàn)，至少附一篇引用的外文文獻(xiàn)

2、（3個(gè)頁(yè)面以上）及其譯文）四、指導(dǎo)教師意見(jiàn)（簽名）2015年3月 日第1章 研究?jī)?nèi)容及研究意義1.1 研究意義木聚糖（xylan）存在于各種陸生植物的幾乎所有部位，是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中含量?jī)H次于纖維素。木聚糖是一種雜合多聚分子，主鏈由多個(gè)吡喃木糖基通過(guò)-1，4-糖苷鍵相連，側(cè)鏈上連著多種不同的取代基：O-乙酞基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸殘基、L-阿拉伯糖殘基等。這些側(cè)鏈與植物細(xì)胞中其他幾種結(jié)構(gòu)性多糖（如木質(zhì)素、纖維素、果膠、葡聚糖等）以共價(jià)或非共價(jià)鍵連接，組成細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)-細(xì)胞壁。木聚糖主要存在于次生細(xì)胞壁中，處于木質(zhì)素及其他多聚糖之間，

3、起著連接作用。也正是由于這些側(cè)鏈的不同，使得木聚糖的結(jié)構(gòu)變化范圍很大。自然界中的木聚糖多為異聚多糖，主鏈和側(cè)鏈糖基上有多種取代基團(tuán)，主要是乙?；?、葡萄糖醛?；桶⒗酋；?，可進(jìn)一步與香豆酸、阿魏酸等酚酸相連，使得木聚糖以共價(jià)鍵與木質(zhì)素相連。木聚糖同其他碳水化合物的結(jié)合除通過(guò)化學(xué)鍵連接之外，還可能通過(guò)其他相互作用如氫鍵等相互連接。同型木聚多糖分布很少，僅見(jiàn)于茅草、煙草和某些種子的外殼中。一般將木聚糖分為硬木（針葉）木聚糖和軟木（闊葉）木聚糖兩種。硬木木聚糖由O-乙酰-4-O-甲基葡萄糖醛縣木糖聚合而成，含70個(gè)以上的吡喃型木糖殘基，以-1，4-葡萄糖苷鍵相連，聚合度（degree of pol

4、ymerization,DP;多聚物中所含單體數(shù)）為150-200.每隔10個(gè)木糖殘基就有1個(gè)4-O-甲基葡萄糖酰酸基團(tuán)位于C2位。硬木木聚糖高度乙?；?，每2mol木糖殘基就含有1mol的乙?；?，乙酰基團(tuán)的存在與木聚糖的部分溶解性有關(guān)。通常情況下，乙?；饕l(fā)生在木糖殘基的C3位上，在C2位取代的情況很少，也有兩個(gè)位置均被乙酰化的，三者之間的比例為4:2:1:2:2:1或3：3：1。在提取木聚糖的過(guò)程中，乙?；鶊F(tuán)能夠在C2位和C3位之間轉(zhuǎn)移，在堿性抽提條件下很容易被除去。木聚糖是半纖維素（地球上位居第二的可再生資源）的一種，主要存在于植物體內(nèi)，將木質(zhì)素和纖維素連接起來(lái)起到了穩(wěn)定植物組織結(jié)構(gòu)的重

5、要作用!同時(shí)，木聚糖也是除纖維素以外的自然界中最為豐富的多糖，結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，單體為ZU木糖，主鏈和側(cè)鏈上都連接有大小不同的取代基團(tuán)!在化石能源越來(lái)越緊缺"環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重的。當(dāng)代，科研工作者們廣泛關(guān)注可再生資源的合理利用，因此，木聚糖的充分利用吸引了很多眼球，但因?yàn)槟揪厶腔瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，要想完全將木聚糖降解必須借助于一套復(fù)雜的,具有不同功能和作用方式的水解酶系!這一套負(fù)載的木聚糖降解酶系主要有ß-1.4-內(nèi)切木聚糖酶,ß-1.4-木 糖苷酶,麹呋喃阿拉伯糖苷酶,葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等，研究表明這些完整的酶系在微生物中廣泛存在ß-1.4-內(nèi)切木

6、聚糖酶是木聚糖水解過(guò)程中最要的一種酶類(lèi)，其特異性作用于木聚糖主鏈上的ß-1.4-D-木糖苷鍵的糖苷鍵，將木聚糖徹底水解為木糖,木二糖及木二糖以上的木寡糖。第2章 研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)2.1匍枝根霉概述匍枝根霉（拉丁名：Rhizopus stolonifer）亦稱(chēng)黑面包霉，是一種常見(jiàn)的霉菌，由土壤或空氣中都很容易分離得到，是接合菌綱、毛霉目、毛霉科、匍枝根霉屬。它即是根霉屬中具代表性的種類(lèi)。這屬真菌的特征是具有細(xì)長(zhǎng)菌絲，不分隔，呈多核狀態(tài)。無(wú)性生殖藉形成孢子繁殖，有性生殖則形成厚壁之接合孢子。分布很廣，全世界均可見(jiàn)，長(zhǎng)在各種有機(jī)物上，除面包、饅頭、米飯等淀粉質(zhì)外，也常長(zhǎng)在甜熟的水果上。最

7、常見(jiàn)的是匍枝根霉(R. stolonifer (Ehrenb.ex Fr.)Vuill)，又稱(chēng)黑根霉、面包霉。 多生于面包、饅頭和富含淀粉質(zhì)的食物上，使食物腐爛變質(zhì)。黑根霉由分枝、不具橫隔的白色菌絲組成。在基質(zhì)表面橫生的菌絲叫匍匐菌絲，匍匐菌絲膨大的地方向下生出假根，伸入基質(zhì)中以吸取營(yíng)養(yǎng)；向上生出數(shù)條直立的孢子囊梗，其頂端膨大形成孢子囊。孢子囊內(nèi)形成具多核的孢囊孢子。孢子囊成熟后破裂，黑色的孢子散出落于基質(zhì)上，在適宜的條件下，即可萌發(fā)成新的菌絲體。本菌種之生長(zhǎng)適溫可由2030，而以2530為最佳。菌叢于25下，在PDA（馬鈴薯培養(yǎng)基）上生長(zhǎng)快速，3天即長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿，起先白色，后變灰白色，一個(gè)

8、月以后則呈黑褐色。反面起先白色，后變灰白色。匍匐莖起先白色，后變褐色。假根分枝多，發(fā)育良好。孢子囊柄直立，不分枝，起初白色，后變褐色，1-5枝叢生成一簇，長(zhǎng)在假根對(duì)側(cè)，9002700微米（m）長(zhǎng)，直徑2232微米，無(wú)分隔，細(xì)胞壁平滑。孢子囊圓形，直徑173-235微米，未成熟時(shí)白色，成熟后黑色，孢子囊壁平滑，成熟時(shí)溶解。中軸圓形，直徑153-163微米，當(dāng)孢子散出后，中軸多數(shù)下陷成半圓形。孢子多數(shù)橄欖型或有稜角，表面有溝紋，灰色，7.5-9.6×4.3-7.5微米。雌雄異株，其接合孢子，為黑色而有厚壁，亞球形，直徑140-180微米，成熟時(shí)黑色，上有疣狀突起。木聚糖水解酶系(xyla

9、nolyticenzymesystems)是一類(lèi)降解木聚糖的酶系，包括-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、-木糖苷酶、-L-阿拉伯糖苷酶、-D-葡糖苷酸酶、乙?；揪厶敲负头铀狨ッ?，可降解自然界中大量存在的木聚糖類(lèi)半纖維素。在木聚糖水解酶系中，-1,4-內(nèi)切木聚糖酶是最關(guān)鍵的水解酶，它通過(guò)水解木聚糖分子的-1,4-糖苷鍵，將木聚糖水解為小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。-木糖苷酶通過(guò)水解低聚木糖的末端來(lái)催化釋放木糖殘基。另外，參與徹底降解木聚糖的還有-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶，以及能降解木聚糖中阿拉伯糖側(cè)鏈殘基與酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯鍵的酚酸酯酶等

10、側(cè)鏈水解酶，它們作用于木糖與側(cè)鏈取代基之問(wèn)的糖苷鍵，協(xié)同主鏈水解酶的作用，最終將木聚糖轉(zhuǎn)化為它的組成單糖 。2.2 研究現(xiàn)狀飼料工業(yè)是較早應(yīng)用木聚糖酶的領(lǐng)域。小麥、大麥、黑麥、燕麥等麥類(lèi)飼料中含有大量的木聚糖,木聚糖具有較強(qiáng)的持水性、小分子吸附活性和表面活性,造成麥類(lèi)基礎(chǔ)飼料對(duì)單胃或無(wú)胃動(dòng)物具有強(qiáng)烈的抗?fàn)I養(yǎng)作用。木聚糖酶作為飼料添加劑使用,可以有效解除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。  木聚糖酶可以破碎植物細(xì)胞壁,提高養(yǎng)分利用率。飼料中添加木聚糖酶可以把聚合度較高的木聚糖降解為聚合度較低的小分子片段,破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),將細(xì)胞壁束縛的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái),和動(dòng)物消化道內(nèi)的消化酶充分

11、接觸,從而提高各種養(yǎng)分的消化率。木聚糖酶可以降低食糜粘度,提高表觀代謝能。澳大利亞和歐美的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家指出,木聚糖酶的主要作用機(jī)制是降低消化道食糜粘度。木聚糖在降解時(shí)需要多種酶協(xié)同作用才能完成，主要包括以下幾種類(lèi)型的酶：1) 內(nèi)切-1，4-D-木聚糖酶（endo-1，4-D-xylanase）EC 3.2.1.8，又稱(chēng)木聚糖酶，降解木聚糖后生成木二糖和木三糖等寡糖，主要水解產(chǎn)物為低聚木糖和少量木糖。內(nèi)切-1，4-D-木聚糖酶作為木聚糖酶系中最重要的酶，主要用來(lái)降解木聚糖主鏈糖苷鍵，它也是目前木聚糖酶研究的重點(diǎn)；2) -D-木糖苷酶（-D-xylosidases）EC 3.2.1.37，是一種外

12、切酶，它主要對(duì)寡聚木糖的還原端起作用，降解并生成木糖；3) -L-呋喃阿拉伯糖苷酶-(L-arabinofuranosidases)，分為兩種類(lèi)型，一種是外切型的-L-呋喃阿拉伯糖苷酶EC3.2.1.55，作用于-硝基酚-呋喃型阿拉伯糖苷或者分支阿拉伯聚糖；另一種是內(nèi)切-1,5-L-阿拉伯聚糖酶EC 3.2.1.99，只對(duì)阿拉伯聚糖側(cè)鏈有活性；4) -D-葡萄糖醛酸苷酶(-D-glucuronidases)EC3.2.239，主要作用于4-O-甲基葡萄糖醛酸與木糖之間的-1,2-糖苷鍵，在木聚糖降解過(guò)程中與木聚糖酶相互促進(jìn)，促進(jìn)低聚木糖的產(chǎn)生；5) 乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan es

13、terases)EC 3.2.72，作用于木糖殘基的C-2和C-3位上的乙?；?；6) 酚酸酯酶(phenol aid esterases)主要包括阿魏酸酯酶(furulic acid esterases )EC 3.2.73和香豆酸酯酶(p-coumaric acid esterases) EC 3.2.-，前者可切除阿魏酸與阿拉伯糖殘基之間的酯鍵，后者則主要作用于香豆酸和阿拉伯糖殘基之間的酯鍵。 通常所說(shuō)的木聚糖酶即內(nèi)切-1，4-D-木聚糖酶，它主要負(fù)責(zé)木聚糖主鏈骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶，也是當(dāng)前木聚糖酶研究的重點(diǎn)。414近來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)木聚糖酶活力測(cè)定的主要研究為：1)

14、在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)木聚糖酶酶活測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，并在一定的條件下對(duì)各種方法進(jìn)行比較；2) 研究木聚糖酶活測(cè)定條件；3) 研究測(cè)定木聚糖酶單一酶活力和總酶活力；4) 研究影響木聚糖酶活測(cè)定的因素及空白試驗(yàn)對(duì)木聚糖酶活測(cè)定的影響；5) 研究測(cè)定不同酶源的木聚糖酶活力；通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì), 研制出符合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的木聚糖酶產(chǎn)品。影響木聚糖酶活性因素的研究 王丹丹等10利用正交實(shí)驗(yàn)法研究了Pichia pastoris G12（畢赤酵母）在搖瓶發(fā)酵條件下產(chǎn)木聚糖的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)pH、接種時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)酶活力具有顯著的影響。研究表明在pH5.5時(shí)酶活

15、力隨pH的增大而增大且在pH=5.5時(shí)達(dá)到最大值，pH超過(guò)5.5時(shí)酶活力開(kāi)始降低并趨于穩(wěn)定。將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中觀察時(shí)間對(duì)酶活的影響，發(fā)現(xiàn)酶活力從11h起開(kāi)始升高并在19h時(shí)達(dá)到最高，之后又下降。在發(fā)酵培養(yǎng)基接種前分別按一定比例加入甲醇觀察甲醇體積分?jǐn)?shù)的大小對(duì)酶活力的影響，得出在甲醇分?jǐn)?shù)低于1.50%時(shí)酶活力隨體積分?jǐn)?shù)增加而增加，并在1.50%時(shí)達(dá)到最高值，高于1.50%時(shí)酶活力逐漸下降。王丹丹等人還研究了甲醇誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響得出在誘導(dǎo)前期酶活力呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)上升趨勢(shì)，在120h后開(kāi)始趨于平緩，在168h達(dá)到最高酶活力水平，之后開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。2.3 發(fā)展趨勢(shì) 中國(guó)木聚糖酶

16、0;行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)分析與預(yù)測(cè)報(bào)告依托多年對(duì)木聚糖酶 行業(yè)的研究，結(jié)合木聚糖酶 行業(yè)歷年供需關(guān)系變化規(guī)律，立足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，兼顧全球市場(chǎng)環(huán)境，對(duì)木聚糖酶 行業(yè)內(nèi)企業(yè)群體進(jìn)行了深入的調(diào)查與研究。同時(shí)，中國(guó)木聚糖酶 行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)分析與預(yù)測(cè)報(bào)告也針對(duì)木聚糖酶 行業(yè)及其上下游行業(yè)的特點(diǎn)，從不同角度切入行業(yè)，為木聚糖酶 行業(yè)企業(yè)提供了強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支持與專(zhuān)業(yè)級(jí)的市場(chǎng)導(dǎo)向。并為企業(yè)制定發(fā)展戰(zhàn)略、進(jìn)行投資決策和企業(yè)經(jīng)營(yíng)管理提供權(quán)威、充分、可靠的決策參考。中國(guó)木聚糖酶 行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)分析與預(yù)測(cè)報(bào)告?zhèn)戎毓俜浇y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用定量及定性的科學(xué)研究方法撰寫(xiě)而成。因

17、此，在對(duì)木聚糖酶活力及性質(zhì)進(jìn)行描述時(shí)，必須清楚注明測(cè)定條件中所有參數(shù)，不同研究所獲得的結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，應(yīng)避免與采用不同底物、不同條件或不同測(cè)定方法所得的結(jié)果進(jìn)行比較。同時(shí)，還應(yīng)在測(cè)定過(guò)程中對(duì)所用方法和測(cè)定條件進(jìn)行嚴(yán)格限定，力求準(zhǔn)確、全面地反映木聚糖酶的性質(zhì)及作用機(jī)制。 第3章 研究方案及工作計(jì)劃3.1. 試驗(yàn)主要內(nèi)容 3.1.1 培養(yǎng)基的配置及各種試劑的配置配制PDA固體培養(yǎng)基，以及種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，并采用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌（121，20min）。 3.1.2葡枝根霉的培養(yǎng)及其形態(tài)的觀察（1） 將葡枝根霉菌絲接種在液體培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出菌種后，取菌絲在顯微鏡下觀察葡枝根霉的形狀；（2）

18、涂平板觀察菌落形態(tài)；（3） 接種斜面作為保藏用。 3.1.3 木聚糖酶活力的測(cè)定51） 配置DNS試劑及木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制；2） 取匍枝根霉發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)物制備粗酶液；3） 采用DNS法測(cè)定木聚糖酶活力；4） 酶活力定義：在規(guī)定條件下，每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1umol木糖所需要的木聚糖酶量為1個(gè)單位酶活力（U）。3.2. 實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)與難點(diǎn) （1）葡枝根霉極易染菌；防止染菌是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)難點(diǎn)問(wèn)題，在接種和倒平板的過(guò)程中要注意無(wú)菌操作，液體培養(yǎng)要講瓶口扎緊，接種后放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2） 配置適宜葡枝根霉發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)基組成，并對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其酶活；3.3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.3

19、.1 做好實(shí)驗(yàn)前期的準(zhǔn)備工作（1）實(shí)驗(yàn)之前查找、閱讀文獻(xiàn)，做好相關(guān)準(zhǔn)備工作（2）培養(yǎng)基的配制及滅菌，實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器及試劑的準(zhǔn)備 3.3.2 實(shí)驗(yàn)成果（1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中相關(guān)實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)之后的數(shù)據(jù)處理。（2）實(shí)驗(yàn)之后，將相關(guān)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成圖表的形式記錄。 3.3.3 實(shí)驗(yàn)總結(jié)（1）通過(guò)實(shí)驗(yàn)，了解、熟悉培養(yǎng)基的配制及滅菌的流程。（2）學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)室中各種儀器設(shè)備的使用，達(dá)到熟練使用的目的。（3）熟練掌握微生物的接種、培養(yǎng)，以及通過(guò)染色觀察其形態(tài)（4）學(xué)習(xí)并掌握微葡枝根霉活性的最佳測(cè)定。 3.4 工作計(jì)劃第01周3月2日-3月8日查文獻(xiàn)并閱讀文獻(xiàn)，英文翻譯及準(zhǔn)備工作第02-03周3月9日-3月22日翻譯外文文獻(xiàn)

20、及準(zhǔn)備工作，熟悉實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容。繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)第04周3月23日-3月29日完成開(kāi)題報(bào)告第05周3月30日-4月5日完成實(shí)驗(yàn)初期的準(zhǔn)備工作，熟悉微生物培養(yǎng)的各個(gè)操作第06-07周4月6日-4月20日測(cè)定相應(yīng)酶活曲線(xiàn)第08-09周4月21日-5月5日確定葡枝根霉木聚糖酶活最佳條件第10-11周5月6日-5月20日對(duì)酶活的酶促反應(yīng)時(shí)間、酶促反應(yīng)溫度、pH三個(gè)影響因素進(jìn)行了研究第12-13周5月21日-5月25日底物酶活的酶促反應(yīng)時(shí)間、酶促反應(yīng)溫度、pH三個(gè)影響因素進(jìn)行了研究第14-15周5月26日-6月08日整理數(shù)據(jù)，得出結(jié)論、查缺補(bǔ)漏，及撰寫(xiě)畢業(yè)論文第16-17周6月09日-6月22日提交論文初稿，準(zhǔn)備答辯主要參考文獻(xiàn)1方洛云，鄒曉庭，許梓榮木聚糖酶基岡的分子生物學(xué)與基因工程J中國(guó)飼料，2002, (7): 11-14.2 李雄彪，張金忠半纖維素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能植物學(xué)通報(bào)，1994, 1l(1): 27-33.3 木聚糖酶 1234 基因序列分析及表達(dá)載體構(gòu)建。常桂英，王俊玲，徐亞維，楊 闖，劉盼想( 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春) 4 謝建華，李小明，羅文華。高溫酸性木聚糖酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性研。東莞泛