第七章酶、細(xì)胞和原生質(zhì)體的固定化——1

1、第七章第七章 酶、細(xì)胞和原生質(zhì)體的酶、細(xì)胞和原生質(zhì)體的固定化固定化酶應(yīng)用過程中的一些不足酶應(yīng)用過程中的一些不足酶的穩(wěn)定性較差酶的穩(wěn)定性較差催化效率不夠高催化效率不夠高酶的一次性使用酶的一次性使用產(chǎn)物的分離純化較困難產(chǎn)物的分離純化較困難固定化技術(shù)固定化技術(shù)7.1 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù) 采用各種方法，將酶固定在水不溶性載體采用各種方法，將酶固定在水不溶性載體上，制備成固定化酶的過程稱為上，制備成固定化酶的過程稱為酶的固定酶的固定化化。 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行固定在載體上

2、并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶稱為催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶固定化酶。化學(xué)偶聯(lián)酶酶固定化固定化分批分批可溶可溶交聯(lián)包埋吸附分批分批連續(xù)連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶酶的固定化技術(shù)和固定化酶固定化酶：經(jīng)提取和分離純化后的酶 固定化菌體(死細(xì)胞)：含酶菌體或菌體碎片 固定化細(xì)胞：在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的細(xì)胞 優(yōu)點優(yōu)點：1.1.不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；2.2.可反復(fù)使用；可反復(fù)使用；3.3.可連續(xù)化生產(chǎn)；可連續(xù)化生產(chǎn)；4.4.穩(wěn)定性好。穩(wěn)定性好。 缺點：缺點：固定化過程中往往會引起酶的失活固定化過程中往往會引起酶的失活 固定化酶的研究從固定化酶的研究從50年代開

3、始，年代開始，1953年德國的年德國的 grubhofer和和schleith采用采用聚氨基苯乙烯樹脂聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、淀粉為載體與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶。酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶。 60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展起來。年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展起來。1969年，日本的年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用固定化氨基酰化酶從固定化氨基?；笍膁l-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)氨基酸連續(xù)生產(chǎn)l-氨基酸氨基酸，實現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。，實現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。 在在1971年召開的第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議

4、上，確定固定年召開的第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為化酶的統(tǒng)一英文名稱為immobilized enzyme。7.2 固定化酶的研究歷史 隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)固定化菌體固定化菌體 。1973年，日年，日本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)l-天門冬氨酸。天門冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌體的基礎(chǔ)上，在固定化酶和固定化菌體的基礎(chǔ)上，70年代后期出現(xiàn)了年代后期出現(xiàn)了固固定化細(xì)胞定化細(xì)胞技術(shù)。技術(shù)。 1976年，法國首次用固定化酵母細(xì)

5、胞生年，法國首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精，產(chǎn)啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶，年日本用固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶，開始了用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶的先例。開始了用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶的先例。 1982年，日本首次研究用年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸，取生產(chǎn)谷氨酸，取得進(jìn)展。固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁的障礙，更有得進(jìn)展。固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁的障礙，更有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，這為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，這為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提供了新的方向。供了新的方向。7.3固定化微生物細(xì)胞、原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶固定化微生物細(xì)胞、原生質(zhì)體發(fā)

6、酵產(chǎn)酶 固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點 提高產(chǎn)酶率提高產(chǎn)酶率 可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間 基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失 發(fā)酵穩(wěn)定性好發(fā)酵穩(wěn)定性好 縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率 產(chǎn)品易分離純化產(chǎn)品易分離純化 適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn) 工藝條件及其控制工藝條件及其控制 固定化酶的預(yù)培養(yǎng)固定化酶的預(yù)培養(yǎng) 溶解氧的供給溶解氧的供給 瓊脂瓊脂不利于氧氣擴(kuò)散，盡量不用或少用不利于氧氣擴(kuò)散，盡量不用或少用 在固定化載體凝膠中添加富集氧氣或利于氧傳在固定化載體凝膠中添加富

7、集氧氣或利于氧傳遞的物質(zhì)遞的物質(zhì) 過氧化氫酶與細(xì)胞共固定，另外過氧化氫以供過氧化氫酶與細(xì)胞共固定，另外過氧化氫以供氧氧 降低培養(yǎng)基濃度和黏度，有利于氧氣的傳遞降低培養(yǎng)基濃度和黏度，有利于氧氣的傳遞 溫度的控制溫度的控制 培養(yǎng)基組分的控制培養(yǎng)基組分的控制 固定化原生質(zhì)體特點固定化原生質(zhì)體特點 變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物 提高產(chǎn)酶率提高產(chǎn)酶率 穩(wěn)定性較好穩(wěn)定性較好 易于分離純化易于分離純化 工藝條件及其控制工藝條件及其控制 滲透壓的控制滲透壓的控制 防止細(xì)胞壁再生防止細(xì)胞壁再生 保證原生質(zhì)體濃度保證原生質(zhì)體濃度固定化酶操作的注意事項固定化酶操作的注意事項 必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是

8、活性中心的構(gòu)象必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象 酶與載體必須有一定的結(jié)合程度酶與載體必須有一定的結(jié)合程度 固定化應(yīng)有利于自動化、機(jī)械化操作固定化應(yīng)有利于自動化、機(jī)械化操作 固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻 固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性 固定化酶的成本適中固定化酶的成本適中7.4 酶固定化技術(shù) 活性中心活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定氨基酸基團(tuán)固有的高級結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行?；笗r，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。

9、 功能基團(tuán)功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時，要求羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結(jié)合不參與酶的固定化結(jié)合 酶的高級結(jié)構(gòu)酶的高級結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。 利用各種固體吸附劑

10、將酶或含酶菌體吸附在利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。其表面上，而使酶固定化的方法。 1、吸附法、吸附法常用的固體吸附劑有常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。等。 優(yōu)點：操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失優(yōu)點：操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復(fù)使用?；?，載體廉價易得，而且可反復(fù)使用。 缺點：由于靠物理吸附作用，缺點：由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱結(jié)合力較弱，酶與，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定載體結(jié)合不牢固而

11、容易脫落，所以使用受到一定的限制。的限制。 將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。定化的方法。 2、包埋法、包埋法 包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂、聚酰胺、火角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂、聚酰胺、火棉膠等。棉膠等。根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為：根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶

12、菌體。中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。半透膜包埋法（微囊包埋法）半透膜包埋法（微囊包埋法）：將酶包埋在由各種高分子：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用于制備固定化聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等 首先被采用包埋法的是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶enzyme+n,n-甲叉雙丙烯酰胺，丙烯酰胺，引發(fā)劑海藻酸鈣包埋法裝置海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（

13、常用其滴入凝固浴中（常用caclcacl2 2 溶溶液），使海藻酸鈉中的液），使海藻酸鈉中的nana+ +，部分，部分被被caca2+2+所取代而形成由多價離子交所取代而形成由多價離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。顆粒大小可實時監(jiān)控顆粒大小可實時監(jiān)控脂質(zhì)體包裹脂質(zhì)體包裹3、結(jié)合法、結(jié)合法 選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：離子鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子：通過離子鍵使酶與載體結(jié)

14、合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換不溶于水的離子交換劑劑。常用的有。常用的有deae-deae-纖維素纖維素、teae-teae-纖維素纖維素、deae-deae-葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠等。等。 共價鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價鍵結(jié)通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：合法。共價鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素纖維素、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠、葡聚糖葡聚糖凝膠凝膠、甲殼質(zhì)甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物甲基丙稀

15、醇共聚物等。等。優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，催化效率損失較少優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，催化效率損失較少缺點：結(jié)合力弱，結(jié)合不牢固，缺點：結(jié)合力弱，結(jié)合不牢固，ph或離子條件改變酶易脫落或離子條件改變酶易脫落重氮法重氮法疊氮法疊氮法酯化法酯化法第一個離子結(jié)合法固定化酶：第一個離子結(jié)合法固定化酶：deae-cellulosedeae-cellulose固定化過氧化氫酶固定化過氧化氫酶第一個工業(yè)化的固定化酶：第一個工業(yè)化的固定化酶：deae-sephadex a-50deae-sephadex a-50固定化氨基?；腹潭ɑ被；?優(yōu)點優(yōu)點 結(jié)合牢固，不脫落結(jié)合牢固，不脫落 可連續(xù)使用較長時間可連

16、續(xù)使用較長時間 缺點缺點 載體活化操作復(fù)雜載體活化操作復(fù)雜 共價鍵結(jié)合會影響酶空間構(gòu)象而影響活性共價鍵結(jié)合會影響酶空間構(gòu)象而影響活性借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法構(gòu)的固定化酶的方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。4、交聯(lián)法、交聯(lián)法戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成席夫（游離氨基反應(yīng)，形成席夫（

17、schiffschiff）堿，而使酶或菌）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。優(yōu)點優(yōu)點: :交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固結(jié)合牢固，可以長時間使用?？梢蚤L時間使用。缺點缺點: :交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個基團(tuán)被交聯(lián)，交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個基團(tuán)被交聯(lián)，致使致使酶活力損失較大酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的化菌體的顆粒較小顆粒較小，給使用帶來不便。，給使用帶來不便?？蓪⒔宦?lián)法與吸附法或包埋法可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補(bǔ)短聯(lián)合使

18、用，以取長補(bǔ)短。酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶7.57.5固定化酶的特性固定化酶的特性 固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于

19、分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用于工業(yè)生產(chǎn)。度較大，亦宜用于工業(yè)生產(chǎn)。一、固定化酶的形狀一、固定化酶的形狀 二、固定化酶的性質(zhì)二、固定化酶的性質(zhì) 酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在，但是固定酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在，但是固定后酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合于載體后酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合于載體的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。為此，的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。為此，在固定化酶的應(yīng)用過程中，必須了解固定化酶的在固定化酶的應(yīng)用過程中，必須了解固定化酶的性質(zhì)與游離酶之間的差別，并對操作條件加以適性質(zhì)與游離酶之間的差別，并對

20、操作條件加以適當(dāng)調(diào)整。當(dāng)調(diào)整。 由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。也有所不同。三、酶活力三、酶活力 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：低，其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合；體相結(jié)合； 當(dāng)酶與載體結(jié)合時，它的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變當(dāng)酶與載體結(jié)合時，它的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或化，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變；催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變； 酶被固定化后，雖

21、不失活，但酶與底物間的酶被固定化后，雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。相互作用受到空間位阻的影響。也有在個別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高，也有在個別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游離酶活力高。使得它反而比游離酶活力高。四、固定化酶的穩(wěn)定性四、固定化酶的穩(wěn)定性 游離酶的一個突出缺點是穩(wěn)定性差，而固定化酶的穩(wěn)定性游離酶的一個突出缺點是穩(wěn)定性差，而固定化酶的穩(wěn)定性一般都比游離酶提高得多，這對酶的應(yīng)用是非常有利的。一般都比游離酶提高得多，這對酶的應(yīng)用是非常有利的。其穩(wěn)定性增強(qiáng)主要表現(xiàn)在如下幾個方面：其

22、穩(wěn)定性增強(qiáng)主要表現(xiàn)在如下幾個方面： （1）操作穩(wěn)定性）操作穩(wěn)定性 酶的固定化方法不同，所得的固定酶的固定化方法不同，所得的固定化酶的操作穩(wěn)定性亦有差異。固定化酶在操作中可以化酶的操作穩(wěn)定性亦有差異。固定化酶在操作中可以長時間保留活力，一般情況下，半衰期在一個月以上，長時間保留活力，一般情況下，半衰期在一個月以上，即有工業(yè)應(yīng)用價值。即有工業(yè)應(yīng)用價值。 （2）貯藏穩(wěn)定性）貯藏穩(wěn)定性 固定化可延長酶的貯藏有效期。固定化可延長酶的貯藏有效期。但長期貯藏，活力也不免下降，最好能立即使用。但長期貯藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果貯藏條件比較好，亦可較長時間保持活力。如果貯藏條件比較好，亦可較長時間

23、保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/l磷酸緩沖磷酸緩沖液中，于液中，于20保存數(shù)月，活力尚不損失。保存數(shù)月，活力尚不損失。 （3）熱穩(wěn)定性）熱穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性對工業(yè)應(yīng)用非常重要。熱穩(wěn)定性對工業(yè)應(yīng)用非常重要。大多數(shù)酶在固定化之后，其熱穩(wěn)定性都有所提高，大多數(shù)酶在固定化之后，其熱穩(wěn)定性都有所提高，但也有一些酶的耐熱性反而下降。一般采用吸附但也有一些酶的耐熱性反而下降。一般采用吸附法來進(jìn)行酶的固定化時，有時會導(dǎo)致酶熱穩(wěn)定性法來進(jìn)行酶的固定化時，有時會導(dǎo)致酶熱穩(wěn)定性的降低。的降低。 （4）對蛋白酶的穩(wěn)定性）對蛋白酶的穩(wěn)定性 酶經(jīng)固定化后，其對蛋酶經(jīng)固定化后，其

24、對蛋白酶的抵抗力提高。這可能是因為蛋白酶是大分白酶的抵抗力提高。這可能是因為蛋白酶是大分子，由于受到子，由于受到空間位阻空間位阻的影響，不能有效接觸固的影響，不能有效接觸固定化酶。例如，千畑一郎發(fā)現(xiàn)，用尼龍或聚脲膜定化酶。例如，千畑一郎發(fā)現(xiàn)，用尼龍或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝膠包埋的固定化天門冬包埋，或用聚丙烯酰胺凝膠包埋的固定化天門冬酰胺酶，對蛋白酶極為穩(wěn)定，而在同一條件下，酰胺酶，對蛋白酶極為穩(wěn)定，而在同一條件下，游離酶幾乎全部失活。另外固定化后酶對有機(jī)試游離酶幾乎全部失活。另外固定化后酶對有機(jī)試劑和酶抑制劑的耐受性也得到了提高。劑和酶抑制劑的耐受性也得到了提高。 （5）酸堿穩(wěn)定性）酸堿

25、穩(wěn)定性 多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性高于游離酶，穩(wěn)定多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性高于游離酶，穩(wěn)定ph范圍變寬。范圍變寬。極少數(shù)酶固定化后穩(wěn)定性下降，可極少數(shù)酶固定化后穩(wěn)定性下降，可能是由于固定化過程使酶活性構(gòu)象的敏感區(qū)受到能是由于固定化過程使酶活性構(gòu)象的敏感區(qū)受到牽連而導(dǎo)致的。牽連而導(dǎo)致的。五、固定化酶的反應(yīng)特性五、固定化酶的反應(yīng)特性 固定化酶的反應(yīng)特性，例如，底物特異性、酶固定化酶的反應(yīng)特性，例如，底物特異性、酶反應(yīng)的最適反應(yīng)的最適ph、酶反應(yīng)的最適溫度、動力學(xué)、酶反應(yīng)的最適溫度、動力學(xué)常數(shù)、最大反應(yīng)速度等均與游離酶有所不同。常數(shù)、最大反應(yīng)速度等均與游離酶有所不同。 （1）底物特異性）底物特異性 固

26、定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關(guān)系。一般來說，當(dāng)酶的底物為小分子化合物定關(guān)系。一般來說，當(dāng)酶的底物為小分子化合物時，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生時，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。例如，氨基?；?、葡萄糖氧化酶、葡萄變化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶等，固定化前后的底物特異性沒有變化；糖異構(gòu)酶等，固定化前后的底物特異性沒有變化； （2）反應(yīng)的最適）反應(yīng)的最適ph 酶被固定后，其最適酶被固定后，其最適ph和和ph曲線常會發(fā)生偏移，曲線常會發(fā)生偏移，原因可能有以下三個方面：一是酶本身電荷在固定原因可能有以下

27、三個方面：一是酶本身電荷在固定化前后發(fā)生變化；二是由于載體電荷性質(zhì)的影響致化前后發(fā)生變化；二是由于載體電荷性質(zhì)的影響致使固定化酶分子內(nèi)外擴(kuò)散層的氫離子濃度產(chǎn)生差異；使固定化酶分子內(nèi)外擴(kuò)散層的氫離子濃度產(chǎn)生差異；三是由于酶催化反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致固定化酶分子內(nèi)部形三是由于酶催化反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致固定化酶分子內(nèi)部形成帶電荷微環(huán)境。成帶電荷微環(huán)境。 （3）反應(yīng)的最適溫度）反應(yīng)的最適溫度 固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，如固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，如色氨酸酶經(jīng)共價結(jié)合后最適溫度比固定前提高色氨酸酶經(jīng)共價結(jié)合后最適溫度比固定前提高515，但也有不變甚至降低的。固定化酶的，但也有不變甚至降低的。固定化

28、酶的作用最適溫度會受固定化方法以及固定化載體的作用最適溫度會受固定化方法以及固定化載體的影響。影響。 （4）米氏常數(shù)）米氏常數(shù) 米氏常數(shù)米氏常數(shù)km反映了酶與底物的親和力。反映了酶與底物的親和力。酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)的變化以及載酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)的變化以及載體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化。使用體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化。使用載體結(jié)合法制成的固定化酶載體結(jié)合法制成的固定化酶km有時變動的原因，主要有時變動的原因，主要是由于載體與底物間的靜電相互作用的緣故。是由于載體與底物間的靜電相互作用的緣故。 （5）最大反應(yīng)速度）最大反應(yīng)速度 固定化酶的最

29、大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。固定化酶的最大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。有些酶的最大反應(yīng)速度會因固定化方法的不同而有所有些酶的最大反應(yīng)速度會因固定化方法的不同而有所差異。差異。乙酰乙酰 -dl ala l ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -d alaaminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶7.6 7.6 固定化酶的應(yīng)用固定化酶的應(yīng)用世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。19691969年，日本田邊制藥公年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用deae-deae-葡聚糖凝葡聚糖凝膠膠為載

30、體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將l-l-乙酰氨基酸水解乙酰氨基酸水解生成生成l-l-氨基酸，用來拆分氨基酸，用來拆分dl-dl-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)l-l-氨基酸。氨基酸。剩余的剩余的d-d-乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成dl-dl-乙酰氨基酸，再進(jìn)行乙酰氨基酸，再進(jìn)行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的6060左右。左右。 泵泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)離心機(jī)消消旋旋反反應(yīng)應(yīng)器器固定化酶柱子晶體 l-alal-ala a-d-alaa-l-ala a-d-ala高果糖漿的生產(chǎn)高果糖漿

31、的生產(chǎn)淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液噴霧干燥氫化還原結(jié)晶異構(gòu)酶粉狀葡萄糖山梨醇結(jié)晶葡萄糖果葡糖漿果糖42%葡萄糖55%低聚糖分離混合高果糖漿果糖漿果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶的的放線菌細(xì)胞用放線菌細(xì)胞用6065熱處理熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，催化葡萄糖異構(gòu)化生成固定化酶，催化葡萄糖異構(gòu)化生成果糖，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。成果糖，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。 青霉素酰化酶轉(zhuǎn)化流程圖青霉素?；皋D(zhuǎn)化流程圖酶傳感器 酶傳感器是由固

32、定化酶與傳感元件兩酶傳感器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當(dāng)?shù)妮d體部分組成的，其中酶是與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成的不溶于水的固定化酶膜。結(jié)合形成的不溶于水的固定化酶膜。 最常用的酶傳感器是最常用的酶傳感器是酶電極酶電極，即將固，即將固定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當(dāng)酶定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當(dāng)酶膜與被測物發(fā)生催化反應(yīng)而生成電極膜與被測物發(fā)生催化反應(yīng)而生成電極活性物質(zhì)后，電極測定活性物質(zhì)并將活性物質(zhì)后，電極測定活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)換為電信號輸出。其轉(zhuǎn)換為電信號輸出。酶電極 酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。19621962年年

33、clarkclark和和lyonslyons提出模型，提出模型，19671967年年updikeupdike和和hickshicks首首先制造出酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。先制造出酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。 酶電極一般可根據(jù)電極檢測物理量的不同分為電流型和電酶電極一般可根據(jù)電極檢測物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、壓型，前者一般有氧電極、h h2 2o o2 2電極等，后者有電極等，后者有nhnh3 3、coco2 2、h h2 2電極等。電極等。 較典型的一種酶電極為較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極葡萄糖酶電極。葡萄糖醌h2o葡萄糖酸氫醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氫醌 醌2h2ept鉑電極葡萄糖酶電極結(jié)構(gòu)示意圖 葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（god），它被固定在聚乙烯酰胺凝膠），它被固定在聚乙烯酰胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發(fā)生氧化反上。在酶膜的作用下葡萄糖發(fā)生氧化反應(yīng)，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化應(yīng)，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化氫。通過用電極測量被消