生物化學(xué)技術(shù)2沉淀法

1、第二章第二章 沉沉 淀淀 法法 沉淀法是分離純化生命大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典沉淀法是分離純化生命大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典方法；其特點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，成本低廉方法；其特點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，成本低廉 常見(jiàn)的方法有常見(jiàn)的方法有鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、蛋白質(zhì)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、蛋白質(zhì)沉淀、peg沉淀、選擇性沉淀、結(jié)晶沉淀等沉淀、選擇性沉淀、結(jié)晶沉淀等掌握沉淀法的基本原理及影響因素掌握沉淀法的基本原理及影響因素掌握沉淀類型及其在制備蛋白質(zhì)、核酸中作用原理掌握沉淀類型及其在制備蛋白質(zhì)、核酸中作用原理熟悉沉淀法在制備蛋白質(zhì)和核酸過(guò)程中的實(shí)際運(yùn)用熟悉沉淀法在制備蛋白質(zhì)和核酸過(guò)程中的實(shí)際運(yùn)用 目目 的的第一節(jié)第一節(jié)

2、 基本原理與沉淀類型基本原理與沉淀類型一、基本原理一、基本原理 根據(jù)同一溶劑中有效成分與雜質(zhì)溶解度差異。選用某根據(jù)同一溶劑中有效成分與雜質(zhì)溶解度差異。選用某種溶液系統(tǒng)，使所需有效成分出現(xiàn)最大溶解度，而雜質(zhì)出種溶液系統(tǒng)，使所需有效成分出現(xiàn)最大溶解度，而雜質(zhì)出現(xiàn)最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式現(xiàn)最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式析出，達(dá)到有效成分與雜質(zhì)分離的目的析出，達(dá)到有效成分與雜質(zhì)分離的目的 根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)等方面的明顯根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)等方面的明顯差異，所以從生物材料中提取制備這兩類物質(zhì)，一般選用差異，所以從生物材料中提取制備這

3、兩類物質(zhì)，一般選用的試劑和操作方法也不完全相同的試劑和操作方法也不完全相同二、制備蛋白質(zhì)二、制備蛋白質(zhì)（一）鹽析法（一）鹽析法1.原理原理 蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度隨鹽濃度的增高而上升蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度隨鹽濃度的增高而上升（鹽溶）（鹽溶）；但當(dāng)鹽濃度增加到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度；但當(dāng)鹽濃度增加到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度有隨鹽濃度逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出有隨鹽濃度逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出（鹽析）（鹽析） 鹽析的內(nèi)因是當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定程度時(shí)，水的鹽析的內(nèi)因是當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定程度時(shí)，水的活度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子活度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷表面電荷中和，中和，水化膜水化膜相繼破壞，蛋白質(zhì)分子聚

4、集而析出沉淀相繼破壞，蛋白質(zhì)分子聚集而析出沉淀2.2.基本步驟基本步驟選擇一定濃度的鹽溶液，使部分雜質(zhì)選擇一定濃度的鹽溶液，使部分雜質(zhì)“鹽析鹽析”，有效成分，有效成分“鹽鹽溶溶”（0 025%25%的（的（nhnh4 4）2 2soso4 4）離心分離上清離心分離上清再調(diào)一定濃度鹽（再調(diào)一定濃度鹽（252560%60%飽和鹽溶液），使有效成分飽和鹽溶液），使有效成分“鹽析鹽析” ” 離心收集沉淀物，即為初步純化的有效成分離心收集沉淀物，即為初步純化的有效成分（1）鹽分級(jí)沉淀）鹽分級(jí)沉淀鹽的選擇：鹽的選擇：在蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，常選用的鹽是在蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，常選用的鹽是（nhnh4 4）2 2soso4

5、 4u（nhnh4 4）2 2soso4 4的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)：溶解度大；對(duì)溫度不敏感；分離效果溶解度大；對(duì)溫度不敏感；分離效果好（如有時(shí)一次可除去好（如有時(shí)一次可除去75%的雜蛋白）；的雜蛋白）； （nhnh4 4）2 2soso4 4本身本身有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；價(jià)格低廉；廢液還可作肥料有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；價(jià)格低廉；廢液還可作肥料u缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：與其他鹽一樣，若需進(jìn)一步純化，需脫鹽處理與其他鹽一樣，若需進(jìn)一步純化，需脫鹽處理 （nhnh4 4）2 2soso4 4鹽析鹽析 固體法固體法在大體積的粗提液中逐漸加入固體在大體積的粗提液中逐漸加入固體（nhnh4 4）2 2soso4 4，邊，邊

6、加邊攪拌，緩緩加入。在此過(guò)程中，溶液加邊攪拌，緩緩加入。在此過(guò)程中，溶液（nhnh4 4）2 2soso4 4的濃度不斷升高，水分子不斷與的濃度不斷升高，水分子不斷與（nhnh4 4）2 2soso4 4結(jié)合，結(jié)合，當(dāng)加入的（當(dāng)加入的（nhnh4 4）2 2soso4 4達(dá)到鹽析點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)沉達(dá)到鹽析點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)沉淀出來(lái)淀出來(lái)例：例：在尿素酶抽提液中加入在尿素酶抽提液中加入（nhnh4 4）2 2soso4 4，當(dāng)飽和度達(dá)為，當(dāng)飽和度達(dá)為35%時(shí)，尿素時(shí)，尿素酶基本留在溶液中；但當(dāng)飽和度達(dá)到酶基本留在溶液中；但當(dāng)飽和度達(dá)到55%時(shí)，尿素酶幾乎全部沉淀時(shí)，尿素酶幾乎全部沉淀 至于蛋白質(zhì)溶

7、液中加多少至于蛋白質(zhì)溶液中加多少（nhnh4 4）2 2soso4 4使其飽和度符合蛋白質(zhì)鹽析，使其飽和度符合蛋白質(zhì)鹽析，可查表可查表2-2，或用下列公式計(jì)算：，或用下列公式計(jì)算：2123 . 0100)(533sssg2123 . 0100)(541sssg（20）（25 ）g表示一升溶液中需加入的表示一升溶液中需加入的（nhnh4 4）2 2soso4 4的克數(shù)的克數(shù)硫硫 酸酸 銨銨 對(duì)對(duì) 尿尿 素素 酶酶 的的 沉沉 淀淀 作作 用用調(diào)調(diào) 整整 硫硫 酸酸 銨銨 溶溶 液液 飽飽 和和 度度 計(jì)計(jì) 算算 表表飽和溶液法飽和溶液法 在在pro溶液中加入預(yù)先調(diào)好的飽和溶液中加入預(yù)先調(diào)好的飽和

8、（nhnh4 4）2 2soso4 4溶溶液，不同的飽和度所需的液，不同的飽和度所需的（nhnh4 4）2 2soso4 4的量用下式的量用下式計(jì)算：計(jì)算：23120ssssvv1s0vv2s3s表示需加入表示需加入（nhnh4 4）2 2soso4 4溶液的體積（溶液的體積（ml）表示原來(lái)溶液的體積表示原來(lái)溶液的體積表示始、終鹽的飽和度表示始、終鹽的飽和度表示需加入表示需加入（nhnh4 4）2 2soso4 4溶液的飽和度溶液的飽和度 此法較固體法此法較固體法溫和溫和，但不宜用于大體積樣品；否則引，但不宜用于大體積樣品；否則引起樣品液體積增加，計(jì)算不準(zhǔn)確。不能達(dá)到預(yù)期的目的起樣品液體積增加

9、，計(jì)算不準(zhǔn)確。不能達(dá)到預(yù)期的目的透吸法透吸法 將裝有將裝有propro溶液的透吸袋放入一定濃度大體積鹽溶液中，溶液的透吸袋放入一定濃度大體積鹽溶液中，利用半透膜透吸改變利用半透膜透吸改變propro溶液中的鹽濃度溶液中的鹽濃度 由于此法的鹽濃度是以連續(xù)狀態(tài)變化的，可由于此法的鹽濃度是以連續(xù)狀態(tài)變化的，可避免避免局部鹽濃度過(guò)高局部鹽濃度過(guò)高而產(chǎn)生的不良影響；所以分離效果好而產(chǎn)生的不良影響；所以分離效果好 但透吸袋體積有限，鹽析速度緩慢，（但透吸袋體積有限，鹽析速度緩慢，（nhnh4 4）2 2soso4 4消耗多等原因，致使此法僅用于要求較精確、樣品體消耗多等原因，致使此法僅用于要求較精確、樣品

10、體積小的試驗(yàn)過(guò)程中，難于放大積小的試驗(yàn)過(guò)程中，難于放大（2 2）制作鹽析曲線）制作鹽析曲線 用鹽析法沉淀分離用鹽析法沉淀分離pro樣品是，樣品是，（nhnh4 4）2 2soso4 4的的“鹽析鹽析”濃度很關(guān)鍵，所需的濃度很關(guān)鍵，所需的濃度范圍要通過(guò)具體試驗(yàn)確定：濃度范圍要通過(guò)具體試驗(yàn)確定：u取一定體積已測(cè)含量的取一定體積已測(cè)含量的pro或酶的待分離溶液，調(diào)或酶的待分離溶液，調(diào)ph至穩(wěn)定范圍至穩(wěn)定范圍u分分610次加入不同量的次加入不同量的（nhnh4 4）2 2soso4 4至出現(xiàn)渾濁時(shí)，分離上清；如此反復(fù)至出現(xiàn)渾濁時(shí)，分離上清；如此反復(fù)610次，分別收集每次的沉淀次，分別收集每次的沉淀u根

11、據(jù)每次沉淀的根據(jù)每次沉淀的pro或酶的量和相應(yīng)的或酶的量和相應(yīng)的（nhnh4 4）2 2soso4 4濃度之間作圖，即得鹽析曲濃度之間作圖，即得鹽析曲線（如圖線（如圖2-1）u參照表參照表2-3的分級(jí)試驗(yàn)方法，再根據(jù)所用生物材料來(lái)源的難易程度，以及對(duì)有的分級(jí)試驗(yàn)方法，再根據(jù)所用生物材料來(lái)源的難易程度，以及對(duì)有效成分純度和得率的要求，先找出有利于提高純化倍數(shù)或得率的大致框架，然后效成分純度和得率的要求，先找出有利于提高純化倍數(shù)或得率的大致框架，然后經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)就能確定最佳鹽析范圍（即經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)就能確定最佳鹽析范圍（即（nhnh4 4）2 2soso4 4 的濃度范圍）的濃度范圍） 但若生物材料

12、來(lái)源容易，主要考慮提高純化倍數(shù)，得率高低可視為次要因數(shù)，但若生物材料來(lái)源容易，主要考慮提高純化倍數(shù)，得率高低可視為次要因數(shù)，若材料來(lái)源困難，則主要考慮得率若材料來(lái)源困難，則主要考慮得率 典典 型型 鹽鹽 析析 曲曲 線線 由表可知，若生物材料來(lái)源容易，主要是考慮提高純化倍由表可知，若生物材料來(lái)源容易，主要是考慮提高純化倍數(shù)時(shí)，選擇數(shù)時(shí)，選擇48%65%鹽飽和分級(jí)范圍，酶的純化倍數(shù)可達(dá)鹽飽和分級(jí)范圍，酶的純化倍數(shù)可達(dá)3.0，而得率僅為而得率僅為75%；若生物材料來(lái)源較困難，主要是考慮提高收得；若生物材料來(lái)源較困難，主要是考慮提高收得率時(shí)，則選擇率時(shí)，則選擇45%70%甚至甚至45%75%鹽飽和分

13、級(jí)范圍，酶的收鹽飽和分級(jí)范圍，酶的收得率可達(dá)得率可達(dá)80%以上，而純化倍數(shù)將以上，而純化倍數(shù)將2.4（3 3）影響鹽析的因素）影響鹽析的因素鹽析常數(shù)（鹽析常數(shù)（ks）每種每種pro在溶液中的溶解度和該溶液的鹽濃度之間存在如下關(guān)系在溶液中的溶解度和該溶液的鹽濃度之間存在如下關(guān)系 s表示有效成分在水中的溶解度表示有效成分在水中的溶解度; m表示摩爾濃度表示摩爾濃度; ks表示有效成分在特定條件下的恒定值表示有效成分在特定條件下的恒定值mksslg ks值越大值越大,則意味著有效成分溶解度降低的速度隨著鹽濃度則意味著有效成分溶解度降低的速度隨著鹽濃度的增加而快速降低的增加而快速降低;因此因此,對(duì)一種

14、有效成分而言對(duì)一種有效成分而言, ks值越大，分值越大，分級(jí)范圍就越窄，鹽析效果就越好。級(jí)范圍就越窄，鹽析效果就越好。 ks還受還受pro本身的性質(zhì)、本身的性質(zhì)、溶液的溶液的ph、溫度及鹽的種類等因素的影響、溫度及鹽的種類等因素的影響 在在ph7.0溶液中幾種蛋白質(zhì)的溶液中幾種蛋白質(zhì)的和和ks常數(shù)常數(shù)（溶解度（溶解度s以以mg/ml表示）表示）鹽分級(jí)范圍的差異性鹽分級(jí)范圍的差異性 在在pro分離過(guò)程中，若每一種分離過(guò)程中，若每一種pro的的ks都很大，分離效果都很大，分離效果不一定好。因?yàn)辂}析效果還與鹽析范圍的差異性有關(guān)不一定好。因?yàn)辂}析效果還與鹽析范圍的差異性有關(guān)各各pro的的ks大大 +

15、鹽析范圍差異明顯，則分離效果好；鹽析范圍差異明顯，則分離效果好； 如圖如圖2-2中中ac各各pro的的ks大大 + 鹽析范圍差異較小，則分離效果不好；如鹽析范圍差異較小，則分離效果不好；如圖圖2-2中中ab ph和鹽濃度和鹽濃度有效成分的溶解度會(huì)受到有效成分的溶解度會(huì)受到ph和鹽濃度的顯著影響和鹽濃度的顯著影響例：例：兔肌磷酸甘油醛脫氫酶（兔肌磷酸甘油醛脫氫酶（ pi約約8.5）可溶于）可溶于ph6.0，3.2mmol/l的的（nhnh4 4）soso4 4溶液中，但若調(diào)節(jié)溶液中，但若調(diào)節(jié)ph.，則立即，則立即產(chǎn)生沉淀這說(shuō)明選擇適當(dāng)產(chǎn)生沉淀這說(shuō)明選擇適當(dāng)ph的鹽溶液可提高鹽析的效果的鹽溶液可提

16、高鹽析的效果 一般來(lái)說(shuō)，在分級(jí)鹽析過(guò)程中，第一次鹽析時(shí)（除去雜質(zhì)），一般來(lái)說(shuō)，在分級(jí)鹽析過(guò)程中，第一次鹽析時(shí)（除去雜質(zhì)），ph應(yīng)偏離有效成分的應(yīng)偏離有效成分的pi值，而接近雜質(zhì)的值，而接近雜質(zhì)的pi值；而在第二次鹽析值；而在第二次鹽析時(shí)（沉淀有效成分），時(shí)（沉淀有效成分），ph應(yīng)調(diào)節(jié)至接近有效成分的應(yīng)調(diào)節(jié)至接近有效成分的pi值值蛋白質(zhì)的純度和濃度蛋白質(zhì)的純度和濃度 蛋白質(zhì)存在的形式（均一的還是混合的）和濃度不同，蛋白質(zhì)存在的形式（均一的還是混合的）和濃度不同，鹽析范圍和溶解度也不一樣。在混合的鹽析范圍和溶解度也不一樣。在混合的pro溶液中，不同溶液中，不同分子間的相互作用會(huì)發(fā)生共沉淀作用。分子

17、間的相互作用會(huì)發(fā)生共沉淀作用。 pro濃度越高，這濃度越高，這種現(xiàn)象越明顯，鹽析分離效果則越差；因此，一般控制樣種現(xiàn)象越明顯，鹽析分離效果則越差；因此，一般控制樣品液品液pro濃度在濃度在0.22%之間為宜之間為宜其他其他 在進(jìn)行鹽析沉淀時(shí)，有時(shí)需在溶液中加在進(jìn)行鹽析沉淀時(shí)，有時(shí)需在溶液中加1mmol/l的的edta-na2鹽，以除去沉淀劑中帶入的金屬離子。另外，鹽，以除去沉淀劑中帶入的金屬離子。另外，加加（nhnh4 4）2 2soso4 4沉淀的時(shí)間要控制好，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不宜，沉淀的時(shí)間要控制好，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不宜，一般控制在一般控制在2h左右左右（4）脫鹽）脫鹽常用方法：常用方法：凝膠過(guò)濾

18、法和透析法凝膠過(guò)濾法和透析法u透析操作的注意事項(xiàng)：透析操作的注意事項(xiàng)：透析袋處理透析袋處理：市售透析袋要：市售透析袋要d.w洗凈，檢查無(wú)漏洞時(shí)再用。洗凈，檢查無(wú)漏洞時(shí)再用。若用來(lái)去除某些易被金屬離子或水解酶破壞的樣品中的鹽若用來(lái)去除某些易被金屬離子或水解酶破壞的樣品中的鹽時(shí)，透析袋應(yīng)用含時(shí)，透析袋應(yīng)用含edta-na2的的nahco3溶液中煮沸溶液中煮沸10min；并經(jīng)；并經(jīng)d.w煮沸、漂洗后再用煮沸、漂洗后再用透析液的選擇透析液的選擇：透析液一般為低離子強(qiáng)度的中性緩沖液。：透析液一般為低離子強(qiáng)度的中性緩沖液。對(duì)含有輔基的酶透析時(shí)，宜在透析液中加入適量的輔基或?qū)休o基的酶透析時(shí)，宜在透析液中

19、加入適量的輔基或保護(hù)輔基的試劑。為防止微生物的生長(zhǎng)，透析應(yīng)在保護(hù)輔基的試劑。為防止微生物的生長(zhǎng)，透析應(yīng)在4進(jìn)行進(jìn)行或在透析液中添加或在透析液中添加0.02%的的nan3( (二二) )有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法1.原理原理與鹽溶液一樣具有脫水作用，使與鹽溶液一樣具有脫水作用，使pro表面的水化膜破壞表面的水化膜破壞降低溶劑系統(tǒng)的介電常數(shù)，即降低極性（而蛋白質(zhì)為水降低溶劑系統(tǒng)的介電常數(shù)，即降低極性（而蛋白質(zhì)為水溶性物質(zhì)）溶性物質(zhì)）2.常用有機(jī)溶劑：常用有機(jī)溶劑：meoh、etoh、me2co等等3.有機(jī)溶劑的使用量：有機(jī)溶劑的使用量： 2120scssvvv v表示加入有機(jī)溶劑的體積；表示加入

20、有機(jī)溶劑的體積； v v0 0表示蛋白溶液的原始體積表示蛋白溶液的原始體積s s1 1表示蛋白溶液中有機(jī)溶劑的濃度表示蛋白溶液中有機(jī)溶劑的濃度( (體積百分濃度體積百分濃度) )s s2 2表示蛋白溶液中欲達(dá)到的有機(jī)溶劑濃度表示蛋白溶液中欲達(dá)到的有機(jī)溶劑濃度( (體積百分濃度體積百分濃度) )c c表示有機(jī)溶劑的濃度（如無(wú)水表示有機(jī)溶劑的濃度（如無(wú)水etoh ，則，則c=100，95% etoh ，則，則c=95） 4.注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：中性鹽作用。即在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，加入適量中性鹽，一方中性鹽作用。即在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，加入適量中性鹽，一方面可增加面可增加pro在有機(jī)溶劑中的溶解度，另一方面

21、可防止在有機(jī)溶劑中的溶解度，另一方面可防止pro變性變性（0.05）；提高分級(jí)效果）；提高分級(jí)效果低溫下操作。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑加入水溶劑中會(huì)放熱，若不注意低溫下操作。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑加入水溶劑中會(huì)放熱，若不注意降溫，容易導(dǎo)致降溫，容易導(dǎo)致pro變性變性多價(jià)陽(yáng)離子作用。有些多價(jià)陽(yáng)離子作用。有些pro能和多價(jià)陽(yáng)離子（如能和多價(jià)陽(yáng)離子（如zn+、cu+等等）結(jié)合形成復(fù)合物，致使結(jié)合形成復(fù)合物，致使pro在有機(jī)溶劑中溶解度降低，這對(duì)在在有機(jī)溶劑中溶解度降低，這對(duì)在高濃度溶劑中才能沉淀的高濃度溶劑中才能沉淀的pro特別有益。如在某些特別有益。如在某些pro溶液中加溶液中加入入0.0050.02mmol/l的的z

22、n+，就可節(jié)省大量有機(jī)溶劑，就可節(jié)省大量有機(jī)溶劑， 使使pro有效得沉淀出來(lái)有效得沉淀出來(lái)（三）蛋白質(zhì)沉淀法（三）蛋白質(zhì)沉淀法1.堿性蛋白質(zhì)堿性蛋白質(zhì)（多價(jià)陽(yáng)離子的堿性蛋白質(zhì)）（多價(jià)陽(yáng)離子的堿性蛋白質(zhì)）如：魚(yú)精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀如：魚(yú)精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀prou應(yīng)用：應(yīng)用：魚(yú)精蛋白加入到部分純化的酵母魚(yú)精蛋白加入到部分純化的酵母pfk溶液時(shí)，溶液溶液時(shí)，溶液中的酶蛋白便會(huì)吸附到魚(yú)精蛋白中的酶蛋白便會(huì)吸附到魚(yú)精蛋白核酸沉淀物上；將沉淀物核酸沉淀物上；將沉淀物用用0.1mol/l磷酸緩沖液洗脫，收集的磷酸緩沖液洗脫，收集的pfk純度提高了純度提高了9倍倍 從深紅螺菌

23、中分離從深紅螺菌中分離pep羥基激酶時(shí)，加魚(yú)精蛋白處羥基激酶時(shí)，加魚(yú)精蛋白處理，可除去其中理，可除去其中3/4的雜蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中的雜蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中u缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：多價(jià)陽(yáng)離子的堿性蛋白質(zhì)不可再利用，且其水溶液多價(jià)陽(yáng)離子的堿性蛋白質(zhì)不可再利用，且其水溶液ph23，要小心調(diào)中性后才能應(yīng)用，要小心調(diào)中性后才能應(yīng)用2.凝集素凝集素 目前研究得比較清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，目前研究得比較清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一種特殊的蛋白質(zhì)，主要對(duì)糖蛋白糖鏈末端序列有特異、明它是一種特殊的蛋白質(zhì)，主要對(duì)糖蛋白糖鏈末端序列有特異、明顯的凝集力顯的凝集力例：例：伴

24、刀豆蛋白伴刀豆蛋白對(duì)含有對(duì)含有g(shù)、甘露糖、甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)生特異等分子的糖蛋白能發(fā)生特異凝集沉淀作用，通過(guò)離心可把糖蛋白與一般蛋白質(zhì)分離開(kāi)，獲得凝集沉淀作用，通過(guò)離心可把糖蛋白與一般蛋白質(zhì)分離開(kāi)，獲得的凝集素的凝集素-糖蛋白復(fù)合物用單糖作抑制劑即可解離糖蛋白復(fù)合物用單糖作抑制劑即可解離優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，專一性強(qiáng)條件溫和，專一性強(qiáng)3.重金屬重金屬 重金屬（重金屬（pbpb2+2+、hghg2+2+）也能與蛋白質(zhì)沉淀，純化）也能與蛋白質(zhì)沉淀，純化pro。但由于重。但由于重金屬易使金屬易使pro變性，故應(yīng)用時(shí)要控制在較溫和的條件下進(jìn)行，并變性，故應(yīng)用時(shí)要控制在較溫和的條件下進(jìn)行，并及時(shí)除

25、去重金屬及時(shí)除去重金屬(四四)pegpeg沉淀法沉淀法 此法應(yīng)用較廣此法應(yīng)用較廣,屬于非離子型聚合物引起的屬于非離子型聚合物引起的pro沉淀作用沉淀作用;沉淀?xiàng)l件溫和，不易引起沉淀?xiàng)l件溫和，不易引起pro變性，且沉淀較完全變性，且沉淀較完全 如用如用20%peg-6000或或57%peg-400可使可使-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶80%發(fā)生沉淀發(fā)生沉淀（五）選擇性沉淀（五）選擇性沉淀 利用目的利用目的pro與雜與雜pro在不同物理化學(xué)環(huán)境下的穩(wěn)定性在不同物理化學(xué)環(huán)境下的穩(wěn)定性不同（如溫度、酸堿度、有機(jī)溶劑等），用選擇性沉淀法，不同（如溫度、酸堿度、有機(jī)溶劑等），用選擇性沉淀法，使雜使雜pro變性沉淀

26、，而目的變性沉淀，而目的pro存在于溶液中或發(fā)生可逆性存在于溶液中或發(fā)生可逆性沉淀，從而使目的沉淀，從而使目的pro得到純化得到純化例：例：酵母干粉抽提液升溫至酵母干粉抽提液升溫至55，20min后迅速冷卻，后迅速冷卻，離心除去熱變性的離心除去熱變性的pro，上清液中為對(duì)熱穩(wěn)定的醇脫氫酶，上清液中為對(duì)熱穩(wěn)定的醇脫氫酶 假單胞菌培養(yǎng)液中加假單胞菌培養(yǎng)液中加 hcl 調(diào)調(diào)phph至至4.0，得到堿性脂酶，得到堿性脂酶的沉淀的沉淀（六）結(jié)晶沉淀法（六）結(jié)晶沉淀法操作：操作：將欲結(jié)晶的物質(zhì)溶解于適當(dāng)溶劑中，加入適量的鹽將欲結(jié)晶的物質(zhì)溶解于適當(dāng)溶劑中，加入適量的鹽（如（如202040% 40% （nhn

27、h4 4）2 2soso4 4 ）或有機(jī)溶劑（如）或有機(jī)溶劑（如etohetoh、meohmeoh等），使其溶解度降低至接近飽和的等），使其溶解度降低至接近飽和的臨界濃度或剛剛開(kāi)始出現(xiàn)沉淀臨界濃度或剛剛開(kāi)始出現(xiàn)沉淀調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)phph至等電點(diǎn)附近，控制溫度至等電點(diǎn)附近，控制溫度44左右，使溶解度進(jìn)一步降低左右，使溶解度進(jìn)一步降低放置一段時(shí)間（陳化），即可得到結(jié)晶沉淀放置一段時(shí)間（陳化），即可得到結(jié)晶沉淀 對(duì)于難結(jié)晶的物質(zhì)，有時(shí)采用加入少量對(duì)于難結(jié)晶的物質(zhì)，有時(shí)采用加入少量“晶種晶種”引子，或進(jìn)行適當(dāng)攪引子，或進(jìn)行適當(dāng)攪拌，或在容器拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速結(jié)晶壁上用玻棒磨檫等方法，

28、可加速結(jié)晶三、制備核酸三、制備核酸 從生物材料（如動(dòng)物組織、線粒體、葉綠體，以及微生從生物材料（如動(dòng)物組織、線粒體、葉綠體，以及微生物中的真菌、細(xì)菌和病毒等）中分離出的物中的真菌、細(xì)菌和病毒等）中分離出的dna或或rna，往往，往往是以是以dna- pro（dnp）或）或rna- pro（rnp）復(fù)合物的形）復(fù)合物的形式存在的，所以制備核酸樣品時(shí)，首先需使復(fù)合物解聚，釋式存在的，所以制備核酸樣品時(shí)，首先需使復(fù)合物解聚，釋放出核酸，除去放出核酸，除去pro，然后用沉淀法得到核酸，然后用沉淀法得到核酸（一）（一）dnp/rnpdnp/rnp復(fù)合物的解聚復(fù)合物的解聚在破細(xì)胞溶液中，加入適量的陰離子去

29、污劑在破細(xì)胞溶液中，加入適量的陰離子去污劑sds或十二烷或十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉doc、聚氧乙基十六烷基酚醚、聚氧乙基十六烷基酚醚、tween等，使等，使dnp/rnp解聚釋放出核酸解聚釋放出核酸加入適量醋酸鉀溶液沉淀加入適量醋酸鉀溶液沉淀sds-pro和和sds-k+等，然后離心等，然后離心除去沉淀除去沉淀分離上清，即為初步純化的核酸制品分離上清，即為初步純化的核酸制品1.加去污劑加去污劑2.加有機(jī)溶劑加有機(jī)溶劑 用有機(jī)溶劑反復(fù)處理抽提液，直至處理液經(jīng)離心后，用有機(jī)溶劑反復(fù)處理抽提液，直至處理液經(jīng)離心后，水相水相-有機(jī)相界面交接出無(wú)變性的有機(jī)相界面交接出無(wú)變性的p

30、ro為止為止 注意有機(jī)溶劑的祛除注意有機(jī)溶劑的祛除一般用乙醚提取，再在低一般用乙醚提取，再在低溫蒸餾除凈乙醚溫蒸餾除凈乙醚3.蛋白酶處理蛋白酶處理 用蛋白水解酶除去復(fù)合物中的用蛋白水解酶除去復(fù)合物中的pro組分，此法條件溫組分，此法條件溫和，一般不會(huì)造成對(duì)核酸的破壞和，一般不會(huì)造成對(duì)核酸的破壞 常用的常用的pro水解酶有：溶菌酶、蛋白酶水解酶有：溶菌酶、蛋白酶k、蛋白酶、蛋白酶e等等（二）消除多糖等雜質(zhì)（二）消除多糖等雜質(zhì)1.多糖多糖 抽提前用抽提前用“饑餓法饑餓法”可減少生物材料中可減少生物材料中貯存多糖貯存多糖（如淀粉、糖原等）的含量（如淀粉、糖原等）的含量 混雜于核酸提取液中的多糖類雜質(zhì)

31、，一般用異丙醇、混雜于核酸提取液中的多糖類雜質(zhì)，一般用異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（十六烷基三甲基溴化銨（ctab，適用于酸性多糖）等，適用于酸性多糖）等選擇性沉淀劑除去；此外，也可用等體積選擇性沉淀劑除去；此外，也可用等體積2.5mol/l磷磷酸緩沖液和等體積乙二醇甲醚處理，經(jīng)離心，多糖位于酸緩沖液和等體積乙二醇甲醚處理，經(jīng)離心，多糖位于中部，核酸位于上層乙二醇甲醚中中部，核酸位于上層乙二醇甲醚中2.dna與與rna的分離的分離鹽析法鹽析法 dna：易溶于：易溶于12mol/lnacl溶液，難溶于溶液，難溶于0.14 mol/lnacl溶液溶液原理原理 rna：易溶于：易溶于0.14 mol

32、/lnacl溶液，難溶于溶液，難溶于12mol/lnacl溶液溶液例：從小牛胸腺提取例：從小牛胸腺提取dna：用：用0.14 mol/lnacl溶液反復(fù)洗滌、絞碎、離心；溶液反復(fù)洗滌、絞碎、離心；結(jié)果結(jié)果rna存在于溶液，存在于溶液，dna存在于沉淀中存在于沉淀中酶水解法酶水解法在提取在提取dna時(shí)，用時(shí)，用rnase水解水解rna， rnase中混有的中混有的dnase用用100熱熱 處理處理15min在提取在提取rna時(shí)，用時(shí)，用dnase水解水解dna， dnase中混有的中混有的rnase，在，在ca2+存在存在條件下，加蛋白酶條件下，加蛋白酶k作用或加碘乙酸鈉處理，使作用或加碘乙酸鈉處理，使rnase破壞破壞（三）核酸沉淀（三）核酸沉淀 在核酸溶液中加入某些有機(jī)溶劑或非離子型聚在核酸溶液中加入某些有機(jī)溶劑或非離子型聚合物試劑時(shí)，核酸會(huì)被有效地沉淀合物試劑時(shí)，核酸會(huì)被有效地沉淀1.1.有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法乙醇乙醇鹽溶液鹽溶液操作：操作：在核酸溶液（在核酸溶液（0.1l/ml）中加入）中加入0.1mol/l nacl 和和2倍量體積（倍量體積（dna）或）或2.5倍體