免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)

1、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)來源：生物谷  2008-6-27   訪問量：9826 評(píng)論（0） 分享 一、免疫熒光的標(biāo)本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點(diǎn)如下：1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。4、免疫熒光在封片使用專用封片劑或甘油：0.01MPBS （1：1）。5、條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑中，標(biāo)本可以保存更久。6、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光。7、熒光抗體染色假陽性可能會(huì)多

2、，需要設(shè)定陽性和陰性對(duì)照。二、注意事項(xiàng)1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱。2、每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：（1） 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物（2） 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物（3） 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物 三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談1、選取primary antibodies時(shí)要來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。2、我的做法

3、是兩種primary antibodies同時(shí)孵育，然后兩種secondary antibodies同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間要認(rèn)真摸索，我感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較干凈。3、我的陽性對(duì)照采用的是陽性組織切片，陰性對(duì)照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。4、Block用的血清使secondary antibody來源動(dòng)物的血清，我的是10%正常donkey血清。5、其余同一般操作。 原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞：在骨發(fā)生形態(tài)蛋白誘導(dǎo)下，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(呈綠色熒光)和同源域蛋白Islet1(呈紅色熒光)共存于細(xì)

4、胞質(zhì)內(nèi)(激光掃描共聚焦顯微鏡觀察)     1一步雙染色法先將兩種熒光標(biāo)己抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接法進(jìn)行染色。     2二步雙染色法先用TRITC標(biāo)記的A抗體進(jìn)行免疫熒光染色，再用FITC標(biāo)記的B抗體染色，根據(jù)兩種抗體的動(dòng)物種屬不同，可用直接法也可用間接法，結(jié)果A抗原呈現(xiàn)橘紅色熒光，而B抗原呈現(xiàn)黃綠色熒光。在應(yīng)用中，常用的方法是免疫熒光組織化學(xué)中間接法和SABC-Cy3法相結(jié)合。例如，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗，相匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化

5、抗兔IgG。進(jìn)行雙重染色時(shí)，由于兩種一抗種屬來源不同，可把一抗混合使用。孵育結(jié)束后洗滌未結(jié)合的一抗，滴加二抗時(shí)，先加人生物素化抗兔IgG(二抗)孵育，洗滌后，滴加SABC-Cy3復(fù)合物，經(jīng)熒光顯微鏡下觀察已出現(xiàn)特異性熒光，再進(jìn)行FITC抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片觀察。其結(jié)果A抗原呈現(xiàn)綠色熒光，B抗原呈現(xiàn)紅色熒光。此法應(yīng)注意兩種一抗在混合稀釋時(shí)，抗體的終濃度應(yīng)為每一種抗體的工作濃度。換言之，混合后的液體要同時(shí)滿足兩種一抗的工作濃度。若兩種一抗種屬來源相同，必須分兩次進(jìn)行雙重染色，即先用第一種一抗和第一種熒光二抗對(duì)A抗原進(jìn)行染色，洗滌后，用第二種一抗和第二種熒光二抗對(duì)B抗原進(jìn)行染色，否則

6、會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)而使染色無特異性。雙重免疫熒光標(biāo)記法     在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測(cè)兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?。雙重免疫熒光標(biāo)記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。     (1)直接法雙重免疫熒光標(biāo)記：將標(biāo)記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，滴加在標(biāo)本上孵育，然后洗去未結(jié)合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察，即可對(duì)兩種抗原進(jìn)行定位和定量。直接法簡(jiǎn)便可靠，但靈敏度較低。     (2)間接法雙重免疫熒光標(biāo)記：用未標(biāo)記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細(xì)胞，洗去多余的第一抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記的第二抗體孵育組織或細(xì)胞，洗去多余的第二抗