免疫熒光雙標技術中操作要點和注意事項

1、免疫熒光雙標技術中操作要點和注意事項來源：生物谷  2008-6-27   訪問量：9826 評論（0） 分享 一、免疫熒光的標本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點如下：1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據(jù)抗體的工作濃度確定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。4、免疫熒光在封片使用專用封片劑或甘油：0.01MPBS （1：1）。5、條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑中，標本可以保存更久。6、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光。7、熒光抗體染色假陽性可能會多

2、，需要設定陽性和陰性對照。二、注意事項1、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4保存4h，時間過長，會使熒光減弱。2、每次試驗時，需設置以下三種對照：（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物 三、免疫熒光雙標的經(jīng)驗之談1、選取primary antibodies時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號標記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。2、我的做法

3、是兩種primary antibodies同時孵育，然后兩種secondary antibodies同時孵育?？贵w濃度、孵育時間要認真摸索，我感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較干凈。3、我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。4、Block用的血清使secondary antibody來源動物的血清，我的是10%正常donkey血清。5、其余同一般操作。 原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細胞：在骨發(fā)生形態(tài)蛋白誘導下，乙酰膽堿轉移酶(呈綠色熒光)和同源域蛋白Islet1(呈紅色熒光)共存于細

4、胞質內(激光掃描共聚焦顯微鏡觀察)     1一步雙染色法先將兩種熒光標己抗體按適當比例混合(A+B)，按直接法進行染色。     2二步雙染色法先用TRITC標記的A抗體進行免疫熒光染色，再用FITC標記的B抗體染色，根據(jù)兩種抗體的動物種屬不同，可用直接法也可用間接法，結果A抗原呈現(xiàn)橘紅色熒光，而B抗原呈現(xiàn)黃綠色熒光。在應用中，常用的方法是免疫熒光組織化學中間接法和SABC-Cy3法相結合。例如，在實驗設計時，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗，相匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化

5、抗兔IgG。進行雙重染色時，由于兩種一抗種屬來源不同，可把一抗混合使用。孵育結束后洗滌未結合的一抗，滴加二抗時，先加人生物素化抗兔IgG(二抗)孵育，洗滌后，滴加SABC-Cy3復合物，經(jīng)熒光顯微鏡下觀察已出現(xiàn)特異性熒光，再進行FITC抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片觀察。其結果A抗原呈現(xiàn)綠色熒光，B抗原呈現(xiàn)紅色熒光。此法應注意兩種一抗在混合稀釋時，抗體的終濃度應為每一種抗體的工作濃度。換言之，混合后的液體要同時滿足兩種一抗的工作濃度。若兩種一抗種屬來源相同，必須分兩次進行雙重染色，即先用第一種一抗和第一種熒光二抗對A抗原進行染色，洗滌后，用第二種一抗和第二種熒光二抗對B抗原進行染色，否則

6、會出現(xiàn)交叉反應而使染色無特異性。雙重免疫熒光標記法     在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。     (1)直接法雙重免疫熒光標記：將標記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合，滴加在標本上孵育，然后洗去未結合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀察，即可對兩種抗原進行定位和定量。直接法簡便可靠，但靈敏度較低。     (2)間接法雙重免疫熒光標記：用未標記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第一抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第二抗