SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 一一. . 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)sds-pagesds-page測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。的原理。 掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。 運(yùn)用運(yùn)用sds-pagesds-page測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。及染色鑒定。 二二 . .實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。象稱為電泳。 電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳。電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳。 區(qū)帶電泳是在半

2、固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中支持介質(zhì)中遷移遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機(jī)械干擾和由于。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。 區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹(shù)脂；以后淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹(shù)脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多

3、用聚有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（丙烯酰胺（pagepage）和瓊脂糖凝膠。）和瓊脂糖凝膠。 pagepage根據(jù)其有無(wú)根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)，分為，分為連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液中緩沖液phph值及凝膠濃度相同，帶電顆粒值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，phph，凝膠濃度及凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)

4、，分子篩粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。清晰度及分辨率均較前者佳。低電荷密度區(qū)濃縮膠 膠孔大小，電壓梯度電荷分布不均勻?qū)е碌碾妷禾荻茸兓?，快離子、慢離子分離膠ph=6.7ph=8.9電泳緩沖液由tris 、甘氨酸、cl-、sds組成,甘氨酸等電點(diǎn)=5.97u=irf=eq=u/d*q sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)引進(jìn)sdssds（十二烷基磺酸鈉），（十二烷基磺酸鈉）， sds sds能斷裂分子內(nèi)和分能斷裂分子內(nèi)和分

5、子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的還原劑的sdssds溶液中，與溶液中，與sdssds分子按比例結(jié)合，形成帶分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的負(fù)電荷的sds-sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的的sdssds，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或

6、消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于sdssds與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15kd15kd到到200kd200kd之間之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：式：logmw=k-bxlogmw=k-bx，式中：式中：mwmw為分子量，為分子量，x x為遷移率，為遷移率，k k、b b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移

7、率均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。線上求得分子量。 sdssds電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，特別電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，特別是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與sdssds的結(jié)合程度。的結(jié)合程度。影響它們結(jié)合的因素主要有三個(gè)：影響它們結(jié)合的因素主要有三個(gè)：1)1) 溶液中溶液中sdssds單體的濃度，當(dāng)單體濃度大于單體的濃度，當(dāng)單體濃度大于1mm

8、ol/l1mmol/l時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與sdssds結(jié)合的重量比結(jié)合的重量比為為1:1.41:1.4，如果單休濃度降到，如果單休濃度降到0.5 mmol/l0.5 mmol/l以下以下時(shí)，兩者的結(jié)合比僅為時(shí)，兩者的結(jié)合比僅為1: 0.41: 0.4這樣就不能消除蛋這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與sdssds的的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:41:4或或1:31:32)2) 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。sdssds電泳的樣品緩沖電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，通常是液離子強(qiáng)度較低，通常是

9、1010100mmol/l100mmol/l3)3) 二硫鍵是否完全被還原二硫鍵是否完全被還原 采用采用sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，只有完聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，只有完全打開(kāi)二硫鍵，全打開(kāi)二硫鍵， 蛋白質(zhì)分子才能被解聚，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，sdssds才能定量地結(jié)合才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。因此在到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。因此在用用sdssds處理樣品同時(shí)往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強(qiáng)處理樣品同時(shí)往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性還原

10、劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與蛋白質(zhì)溶解而與sdssds定量結(jié)合。定量結(jié)合。 有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)谀榈鞍酌福┙M成的，它們?cè)趕dssds和巰基乙醇作用下，解離成和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的或單條肽鏈的mwmw。 已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用sds-pagesds-page測(cè)定分子量。如電荷異常測(cè)定分子量。如電荷異?；驑?gòu)

11、象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。 一般至少采用兩種方法測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。一般至少采用兩種方法測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。三三. . 實(shí)驗(yàn)試劑和器材實(shí)驗(yàn)試劑和器材 1.材料：材料： 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒: 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶b mw=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 mw=66,200 兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白 mw=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 mw=31,000 胰蛋白

12、酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 mw=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 mw=14,400 根據(jù)說(shuō)明書(shū)處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白根據(jù)說(shuō)明書(shū)處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白 樣品：稱樣品：稱3mg樣品，加樣品，加2 ml蒸餾水溶解。蒸餾水溶解。2.實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 (1) 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（acr）：稱）：稱acr30g，甲叉雙丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺(交交 聯(lián)劑聯(lián)劑) （bis）0.8g，加蒸餾水至，加蒸餾水至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶，過(guò)濾后置棕色瓶 4貯存可用貯存可用1-2月。月。（2）10%sds（十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉）（3）1.5mol/l ph8.8 tris-hcl緩沖液：稱取緩沖液：稱取tris

13、18.2g， 加入加入50ml水，用水，用1mol/l鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)ph8.8， 最后用蒸餾最后用蒸餾 水定容至水定容至100ml。（4）1.0mol/lph6.8tris-hcl緩沖液：稱取緩沖液：稱取tris12.1g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)ph6.8， 最后用蒸餾水最后用蒸餾水 定容至定容至100ml。（5）0.05mol/lph8.0tris-hcl緩沖液：稱取緩沖液：稱取tris0.6g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)ph8.0，最后用蒸餾水定，最后用蒸餾水定 容至容至100ml。（7）10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨(ap)（催化劑，

14、引發(fā)劑）（催化劑，引發(fā)劑）（8）temed（四甲基乙二胺）（加速劑）（四甲基乙二胺）（加速劑）（9）樣品溶解液：）樣品溶解液：sds（100mg）+巰基乙醇（巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)（溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（甘油（2g） +0.05mol/l ph8.0tris- hcl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。（10）固定液：?。┕潭ㄒ海喝?0%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混勻。混勻。（11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)r250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液 250ml， 過(guò)濾后備用。過(guò)濾后備用。（12）脫色液：冰乙酸）脫色液：冰乙酸7

15、5ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸餾水定容至，加蒸餾水定容至1000ml。（13）電極緩沖液（內(nèi)含）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%sds，0.05mol/ltris- 0.384mol/l甘甘氨酸緩沖液氨酸緩沖液ph8.3）：稱）：稱tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸28.8g，加入，加入sds1g，加，加蒸餾水使其溶解后定容至蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。3. 實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材 垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置 直流穩(wěn)壓電源直流穩(wěn)壓電源 移液管移液管 濾紙濾紙 微量注射器微量注射器 大培養(yǎng)皿大培養(yǎng)皿分離膠分離膠(10%.10ml)濃縮膠濃縮膠(5%6ml)h2o5.2ml4.07mlacr30%,

16、 3.4ml30%, 1.0mlbuffer3.0mol/l ph=8.8 tris-hcl 1.2ml0.5mol/l ph=6.8 tris-hcl1.5mlsds已在緩沖液中加入已在緩沖液中加入（已在緩沖液里加入）（已在緩沖液里加入）10%ap0.10ml0.06mltemed10l8l各部分凝膠配制各部分凝膠配制四四. . 實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)驗(yàn)過(guò)程 1.1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準(zhǔn)備準(zhǔn)備2 2個(gè)干凈的個(gè)干凈的錐形瓶錐形瓶. .2.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好把玻璃板在灌膠支架上固定好. .固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均

17、勻，防止夾壞玻璃板壞玻璃板. .3.3.按比例配好分離膠按比例配好分離膠, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大約大約5 5厘米左右厘米左右, ,之后加少許蒸餾水之后加少許蒸餾水, ,靜置靜置4040分鐘分鐘. .凝膠配制過(guò)程要迅速凝膠配制過(guò)程要迅速, , 催化劑催化劑temedtemed要在注膠要在注膠前再加入前再加入, ,否則凝結(jié)無(wú)法注膠否則凝結(jié)無(wú)法注膠. .注膠過(guò)程最好一次注膠過(guò)程最好一次性完成性完成, ,避免產(chǎn)生氣泡避免產(chǎn)生氣泡. . 水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣空氣 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的凝膠聚合好的標(biāo)志

18、是膠與水層之間形成清晰的界面界面. .4.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干, ,按比例配好按比例配好濃縮膠濃縮膠, ,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm5mm處處, ,迅速迅速插入樣梳插入樣梳, ,靜置靜置4040分鐘分鐘. . 樣梳需一次平穩(wěn)插入樣梳需一次平穩(wěn)插入, ,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡, ,梳底梳底需水平需水平. .5.5. 在上槽內(nèi)加入緩沖液后在上槽內(nèi)加入緩沖液后, ,拔出樣梳拔出樣梳。 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出, ,否則會(huì)影響加樣效果否則會(huì)影響加樣效果. .6 6、加樣加樣（1）取取10l

19、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于ep管內(nèi)，再加入管內(nèi)，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量為倍樣品緩沖液，上樣量為10l。 （2）取取10l樣品溶液，再加入樣品溶液，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣倍樣品緩沖液，上樣量分別為量分別為5l和和3l。7.7.用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣, ,加樣前加樣前, ,樣品在樣品在 沸水中加熱沸水中加熱3 3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 注射器不可過(guò)低注射器不可過(guò)低, ,以防刺破膠體以防刺破膠體, ,也不可過(guò)高也不可過(guò)高, ,在樣下在樣下 沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散. . 為避免邊緣效應(yīng)為避免邊緣效應(yīng),

20、 ,最好選用中部的孔注樣最好選用中部的孔注樣. .8.8.電泳槽中加入緩沖液電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳接通電源，進(jìn)行電泳，開(kāi)始電流恒，開(kāi)始電流恒定在定在10ma，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20ma，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約約5mm時(shí)，停止電泳。時(shí)，停止電泳。 9.9.凝膠板剝離凝膠板剝離與與染色染色：電泳結(jié)束后，撬開(kāi)玻璃板，將凝膠板：電泳結(jié)束后，撬開(kāi)玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色1小時(shí)左右。小時(shí)左右。10.10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 剝膠時(shí)要小心剝膠時(shí)要小心, ,保持膠完好無(wú)損保持膠完好無(wú)損, ,染色要充分染色要充分.11.11.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。五五. .分析計(jì)算分析計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：按下式計(jì)算相對(duì)遷移率： 以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性