分子生物學(xué)輔導(dǎo)筆記

1、（前4章注意概念就行了，重點(diǎn)是轉(zhuǎn)座子，RNA編輯）Chapter1真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)本章應(yīng)掌握的基本概念 細(xì)胞核基因組的大??； C值矛盾； 重復(fù)序列； 基因家族； 真核基因的斷裂結(jié)構(gòu) 基因家族（gene family) 指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。假基因（pseudogene) 在多基因家族中有的成員并不能表達(dá)出有功能的產(chǎn)物。 1、核酸序列相同：即為多拷貝基因如rRNA基因家族，tRNA基因家族，組蛋白基因家族。 2、核酸序列高度同源：如人類生長(zhǎng)激素基因家族包括三種激素的基因，人生長(zhǎng)激素、人胎盤促乳素和催乳素，它們之間高度同源。 3、編碼產(chǎn)物有同源功能

2、：基因序列的相似性可能較低，但基因編碼的產(chǎn)物具有高度保守的功能區(qū)。如src癌基因家族 4、編碼產(chǎn)物具有小段保守基序：有些基因家族中各成員的DNA序列可能不明顯相關(guān)，而所編碼的產(chǎn)物卻有共同的功能特征，存在小段保守的氨基酸基序。基因超家族（gene superfamily) 指一組由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族，它們的結(jié)構(gòu)有不同的同源性，但功能并不一定相同。如免疫球蛋白基因超家族。真核基因的斷裂結(jié)構(gòu)斷裂基因（split gene) 基因與基因間的非編碼序列為間隔DNA（ spacer DNA).內(nèi)含子（intron）無編碼意義的DNA片段外顯子（extron）具有編碼意義的DNA片段Ch

3、apter2 葉綠體基因組 本章應(yīng)掌握的基本概念 葉綠體DNA的信息含量； 葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)； 葉綠體基因的組成；（記憶每個(gè)大標(biāo)題，了解就可以了） 葉綠體基因的一些結(jié)構(gòu)特征。 p33. RNA編輯Chapter3線粒體基因組 本章應(yīng)掌握的基本概念 線粒體基因組的大??； 線粒體基因組的組織結(jié)構(gòu)； 線粒體基因組的組成； 線粒體基因的一些特征； p44. RNA編輯；（注意概念，分類，意義） 遺傳信息在基因組之間的流動(dòng)。（適當(dāng)關(guān)注） Chapter4可移位遺傳因子 本章應(yīng)掌握的基本概念 可移位因子的類型； 轉(zhuǎn)座子； LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子； 無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子；轉(zhuǎn)位因子(transposable e

4、lement) 可移動(dòng)的基因成分，指能在一個(gè)DNA分子內(nèi)部或兩個(gè)DNA分子之間移動(dòng)的片段。在細(xì)菌中可指在質(zhì)粒和染色體之間或在質(zhì)粒和質(zhì)粒之間移動(dòng)的片段。 轉(zhuǎn)位因子的主要類型 插入序列（insertion sequence,IS) 轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn) 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retroposons or retro transposon ） 轉(zhuǎn)座的噬菌體（transposable phage )插入序列(Insertion sequence) 一類簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)位因子，長(zhǎng)度約7002000bp，由一個(gè)轉(zhuǎn)位酶基因及兩側(cè)的反向重復(fù)序列（inverted repeat sequence, IR)組成，不

5、帶任何其它基因。轉(zhuǎn)位時(shí)復(fù)制宿主靶位點(diǎn)一小段DNA（415bp）形成兩端的正向重復(fù)序列。轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn) 一類較大的可移動(dòng)成分。除有關(guān)轉(zhuǎn)座的基因外，至少帶有一個(gè)與轉(zhuǎn)座作用無關(guān)并決定宿主菌遺傳性狀的基因。轉(zhuǎn)座子中的轉(zhuǎn)位酶常稱為轉(zhuǎn)座酶，其功能是介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子插入到DNA的其它部位。轉(zhuǎn)座子與基因表達(dá)的關(guān)系：插入編碼區(qū)，插入5側(cè)向序列，可在不同植物中起作用1984年McClintock（巴巴拉麥克林托克）就提出轉(zhuǎn)座子在植物基因組的重建中起著很重要的作用。轉(zhuǎn)座子在調(diào)節(jié)和編碼區(qū)域的插入和切除都能改變基因的編碼功能和表達(dá)模式，但在抗病基因分子生物學(xué)的研究中，尚未有證據(jù)直接證明抗病基因座中新的專

6、化性抗性基因的產(chǎn)生是由轉(zhuǎn)座子的插入或切除所致。不過已有試驗(yàn)表明，由轉(zhuǎn)座子誘發(fā)的基因改變能引起抗病基因的失活和多樣化。轉(zhuǎn)座子通常會(huì)造成破壞，而在本例中，它們看來對(duì)寄主有利。加州大學(xué)戴維斯分校進(jìn)化遺傳學(xué)家 和同事 偶然間發(fā)現(xiàn)果蠅加州種群體內(nèi)有一條含萬個(gè)堿基對(duì)的染色體片段，所包含的全部基因不存在個(gè)體差異。原因可能是該相同區(qū)域中某個(gè)特別的等位基因迅速擴(kuò)散到了整個(gè)種群，同時(shí)捎帶上它附近的各等位基因基因，它與一個(gè)“跳躍基因”相連，負(fù)責(zé)清除殺蟲劑和其他毒物的毒性。試驗(yàn)表明，當(dāng)轉(zhuǎn)座子存在時(shí)，基因比較活躍，這可能是由于跳躍過程打開了某個(gè)“基因開關(guān)”，而基因通常是處于關(guān)閉狀態(tài)的。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retroposon

7、s or retrotransposon ）： 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又稱“反轉(zhuǎn)位子”。這些流動(dòng)的遺傳元素首先被轉(zhuǎn)錄成RNA，然后再被由該反轉(zhuǎn)位子本身產(chǎn)生的一種逆向轉(zhuǎn)錄酶重新轉(zhuǎn)變成DNA。該DNA版本可在任何位置結(jié)合進(jìn)基因組中。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 p58：在結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄特性和轉(zhuǎn)座機(jī)制上十分類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒，在其兩端具有長(zhǎng)的同相重復(fù)序列（LTRs）無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 p63：有與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類似的序列結(jié)構(gòu)，但兩端缺少長(zhǎng)的同相重復(fù)序列。典型的例子是長(zhǎng)散布元件（long interspersed element，LINE）轉(zhuǎn)座的噬菌體（transposable phage ) ：具有轉(zhuǎn)座功能的溶源性噬

8、菌體Chapter5 核酸的分子操作5.1 限制性內(nèi)切酶概念、分類、性質(zhì)（做一般性的了解）限制性內(nèi)切酶：一類能識(shí)別雙鏈DNA中短的特定堿基序列，并在序列內(nèi)或旁側(cè)一定距離內(nèi)特異切割雙鏈DNA的核酸水解酶。是體外剪切DNA的重要工具。分為I，II，III型同裂酶：兩種酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位點(diǎn)都相同，它的區(qū)別只是在于，當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種可以切割，而另一種不能切割。同尾酶：兩種酶的識(shí)別序列不完全相同，但是切割后產(chǎn)生的粘性末端是相同的。限制性內(nèi)切酶酶促反應(yīng)的條件（需要注意）1DNA的純度2DNA的甲基化程度3酶切的反應(yīng)溫度，一般為374DNA的分子結(jié)構(gòu)5溶液中的離子強(qiáng)度核種類6緩沖

9、液的ph值星活性（star act）：當(dāng)條件改變時(shí)，可能改變酶切識(shí)別序列的專一性，這種酶切特異性降低的現(xiàn)象稱為星活性或星號(hào)活性引起星活性的因素1. 甘油的濃度過高 >5%2. 酶過量 >100單位/ug3. 低離子強(qiáng)度 <25mM4. 高ph值 >8.05. 有機(jī)溶劑,如乙醇，乙二醇等6. 用其他陽離子代替Mg離子避免星活性的方法相應(yīng)有：減少酶的用量，降低甘油濃度，提高離子強(qiáng)度，保證反正體系中沒有有機(jī)溶劑，降低ph值，用Mg離子做二價(jià)陽離子。5.2 操作和標(biāo)記核酸的酶（了解）5.3 核酸分子雜交技術(shù)概念：具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過

10、程。核酸分子雜交的基本原理: DNA變性和復(fù)性或雜交(hybridization)影響雜交的因素1核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：濃度大，復(fù)性快；分子量大，復(fù)性慢2溫度3離子強(qiáng)度4雜交液中的甲酰胺5核酸分子的復(fù)雜性6非特異性雜交反應(yīng) 預(yù)雜交：封閉非特異性雜交位點(diǎn)，用鮭魚精子DNA分子雜交的基本方法1 Southern 印跡法：DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。2 Northern 印跡法：檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法3 斑點(diǎn)印跡雜交：將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品4 原位雜交：將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞

11、或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。5 Western 印跡法：檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法6 液相雜交Chapter6 分子克隆本章應(yīng)掌握作為受體細(xì)胞的大腸桿菌；由質(zhì)粒衍生的載體；由噬菌體衍生的載體；粘粒載體；單鏈絲狀噬菌體M13載體；外源DNA與載體重組；重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；陽性重組體的篩選和鑒定。 本章涉及的主要概念基因克隆: 利用重組DNA技術(shù)分離目的基因克隆: 動(dòng)詞：指從單一祖先產(chǎn)生同一的DNA分子群體或細(xì)胞群體的過程名詞：指從一個(gè)共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命

12、群體。基因文庫：由大量含有特定基因的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體，分為基因組文庫和cDNA文庫基因文庫的構(gòu)建：如果構(gòu)建基因組文庫，首先提取基因組DNA，隨機(jī)打斷，打斷的方法有物理和生物方法，物理方法是超聲波粉碎（主要使用的方法），生物方法是酶切，然后用這些片段構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化并表達(dá)于大腸桿菌，得到大量的克隆。再將得到的序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序完成后就建成了基因文庫。對(duì)于文庫中的每一個(gè)克隆它的序列都是已知的。cDNA文庫的構(gòu)建基本相似，先提取mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，打斷，裝入質(zhì)粒，大量表達(dá)，最后測(cè)序。載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞（host cell）的工具稱為載體載體應(yīng)具備以下特

13、點(diǎn)：1. 在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）；2. 必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制；3. 有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選；4. 有一定的拷貝數(shù)，便于制備。5. 附加因素：MSC，LacZ（-互補(bǔ)），ssDNA， phage，origin，Promoter以及cos位點(diǎn)等。載體的類型 質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體（phage）、粘粒載體（cosmid，又稱柯斯質(zhì)粒）、噬菌粒（phagemid）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（Plasmid vectors）一、質(zhì)粒的基本特性1概念: 染色體外的遺傳因子，能進(jìn)行自我復(fù)制(但依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)）;大多數(shù)為雙鏈、閉合環(huán)

14、壯DNA分子，少數(shù)為線性;大小1kb20kb，也有更大的（200kb)2質(zhì)粒的表型：抗抗菌素、抗重金屬、產(chǎn)生抗菌素、產(chǎn)生大腸桿菌素、產(chǎn)生溶血素、產(chǎn)生腸毒素、產(chǎn)生硫化氫、降解芳香族化合物、誘發(fā)植物腫瘤、糖發(fā)酵、產(chǎn)生限制酶和修飾酶3質(zhì)粒的拷貝數(shù)：嚴(yán)緊型：拷貝數(shù)有限，大約1幾個(gè)；松弛型：拷貝數(shù)較多，幾十至幾百4質(zhì)粒的不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時(shí)，不相容的質(zhì)粒一般為利用同一復(fù)制系統(tǒng)，質(zhì)粒分配到子細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，隨機(jī)挑選，微小差異，最終放大。5轉(zhuǎn)移性：在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。供體和受體細(xì)胞通過供體細(xì)胞

15、表面的纖毛接觸，然后一個(gè)質(zhì)?？截愅ㄟ^該纖毛進(jìn)入受體細(xì)胞F質(zhì)粒：又叫F因子，即致育因子（fertility factor)的簡(jiǎn)稱，為細(xì)菌的游離基因，在細(xì)菌的結(jié)合中使細(xì)菌能夠起雄性的作用。雄性細(xì)菌充當(dāng)一個(gè)DNA供體并產(chǎn)生F性須，通過F性須DNA被轉(zhuǎn)移到受體的雌性細(xì)胞。二、標(biāo)記基因 （做一般性了解）（1）氨芐青霉素抗性基因（AmpR ampr ampicillin）青霉素抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并抑制其活性。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr tetracycline）與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位（3）氯霉素抗性基因（chloramphenicol

16、, Cmr or Cat）Cm與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycinneomycin）可與核糖體成分相結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成的脫氧鏈霉胺氮基糖苷 -互補(bǔ)（complementation）p90. Lac Z基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。用做篩選標(biāo)記MCS（Multiple cloning sites）多克隆位點(diǎn)：人工構(gòu)建的，緊密排列的具有多種限制酶識(shí)別序列的一段DNA序列，可方便的用于外源DNA片段的插入。限制酶譜篩選1 轉(zhuǎn)化后挑取許多獨(dú)立的細(xì)菌菌落2 少量培養(yǎng)并提取質(zhì)粒3 根

17、據(jù)克隆片段和插入載體的位點(diǎn)，選擇合適的限制酶進(jìn)行酶切4 凝膠電泳分析限制酶圖譜，從而選出陽性克隆表達(dá)篩選1 構(gòu)建表達(dá)載體（含高效啟動(dòng)子）2 鑒定表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子大小3 還可利用抗體進(jìn)行篩選核酸探針篩選 根據(jù)核酸序列的同源性，利用核酸探針與轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒雜交，可篩選出重組的質(zhì)粒。這種方法多用于大量篩選天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性1分子量較大，不便于操作2拷貝數(shù)較低，不利于質(zhì)粒DNA的制備3抗菌素抗性基因少，不便于選擇4單一的限制性酶切位點(diǎn)少，且不集中，不利于基因克隆質(zhì)粒載體應(yīng)具備的基本條件 設(shè)法將一些克隆中常見的有用性狀組裝進(jìn)質(zhì)粒載體，將天然質(zhì)粒改造成理想的基因操作載體或適合于特定用

18、途的載體。1 具有復(fù)制起點(diǎn)2 具有抗菌素抗性基因3 具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)，且在其中插入適當(dāng)大小的外源DNA片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能4 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)復(fù)制子（replicon）：能夠自我復(fù)制，而且僅具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)的DNA分子三、質(zhì)粒載體的種類（一般了解）pBR322是最早人工構(gòu)建的質(zhì)粒1. 克隆載體：用于擴(kuò)增或保存DNA片段，為最簡(jiǎn)單的載體。如pBR322 2. 表達(dá)載體基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄、翻譯與翻譯后加工、分離純化等過程根據(jù)被表達(dá)的基因和表達(dá)基因所用的系統(tǒng)，可將表達(dá)分為：1) 原核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)2) 真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)3) 原核基因在真核細(xì)胞中

19、表達(dá)4) 真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)原核表達(dá)系統(tǒng)主要有：1) E.coli系統(tǒng)2) 枯草桿菌系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)主要有：1) 酵母細(xì)胞系統(tǒng)2) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)3) 昆蟲細(xì)胞（桿狀病毒）系統(tǒng)4) 高等植物系統(tǒng)克隆載體與表達(dá)載體的區(qū)別1 在原核克隆載體中通常都帶一個(gè)松馳型復(fù)制子、一個(gè)多克隆位點(diǎn)和一個(gè)篩選標(biāo)記，以便被克隆和篩選的DNA序列能夠大量增殖。2 原核表達(dá)載體除了上述因子外，還需要有強(qiáng)啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、翻譯起始密碼子和終止密碼子等一系列調(diào)控序列。 表達(dá)載體的選擇非常重要，選擇時(shí)主要應(yīng)考慮下列因素：1. 所表達(dá)的蛋白質(zhì)是融合蛋白還是天然蛋白。如果是天然蛋白，必須考

20、慮如何將目的基因準(zhǔn)確地與載體銜接。如果是融合蛋白，則可以用三種不同閱讀框架的載體使目的基因與載體序列吻合。2. 被表達(dá)的基因是原核基因還是真核基因。原核基因一般都帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，只需考慮它是否帶有強(qiáng)啟動(dòng)子。對(duì)真核基因除考慮該基因是否帶有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)外，還須考慮該基因是否會(huì)產(chǎn)生翻譯后加工，以后是否需要轉(zhuǎn)到真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)等。核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-bindingsite)又稱SD序列(Shine-Dalgarno sequence)，它是指mRNA分子中能與核糖體結(jié)合的序列，通常位于翻譯起始密碼子前面312個(gè)堿基，該序列與16S rRNA的3端互補(bǔ)。3. 表達(dá)蛋白是否分

21、泌到體外。如需要分泌，則必須帶有信號(hào)肽序列，故應(yīng)選擇帶適當(dāng)信號(hào)肽序列的載體。信號(hào)肽(signal peptide)又稱前導(dǎo)肽(1eader peptide)，這是一種位于分泌蛋白質(zhì)或輸出蛋白質(zhì)N端上長(zhǎng)約1530個(gè)氨基酸的序列，可被細(xì)胞的蛋白質(zhì)加工機(jī)制所識(shí)別，使蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜被分泌出來。4. 所產(chǎn)生的融合蛋白是否需要切割加工及如何切割加工。對(duì)需要切割的融合蛋白，在目的基因和載體序列間應(yīng)有適當(dāng)?shù)那懈钭R(shí)別序列。 5. 是否需要用強(qiáng)啟動(dòng)子提高表達(dá)水平。當(dāng)需要提高表達(dá)水平時(shí)，可選用強(qiáng)啟動(dòng)子。但在某些情況下，由于被表達(dá)蛋白質(zhì)對(duì)宿主有毒或其大量表達(dá)對(duì)宿主不利，可選用誘導(dǎo)型載體，只有經(jīng)誘導(dǎo)后，蛋白質(zhì)才能被表

22、達(dá)。表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)以E.coli基因與外源目的蛋白基因組成融合基因產(chǎn)生的融合蛋白，可用作抗原產(chǎn)生抗體，然后用這種抗體測(cè)定或分離天然的目的蛋白。融合蛋白有下列優(yōu)點(diǎn)：1. 轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從正常的E.coli序列開始，故通?？梢援a(chǎn)生高水平的融合蛋白。2. 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定。 3. 產(chǎn)生的融合蛋白較大，因此很容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出來。融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍干燥，磨成粉末后即可作為抗原。4. 有些融合蛋白帶有信號(hào)肽，可以分泌到細(xì)胞外，這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。真核基因的表達(dá)載體對(duì)表達(dá)真核基因，除了啟動(dòng)子外，還需要有一個(gè)有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)橹挥挟?dāng)被轉(zhuǎn)錄的m

23、RNA與核糖體結(jié)合后，mRNA才能被有效地翻譯。真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。因此需要用人工合成的轉(zhuǎn)接頭、人工合成的DNA引物或用DNA切割修補(bǔ)等方法使真核基因與載體的序列完全吻合。 分泌型表達(dá)載體有時(shí)為減少所需蛋白質(zhì)在宿主體內(nèi)被蛋白酶降解，或?yàn)槭沟鞍踪|(zhì)能夠在體外正確折疊和便于提純，經(jīng)常需要將被表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此要用分泌型載體。分泌型載體的優(yōu)點(diǎn)1一些在胞內(nèi)被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中很穩(wěn)定。2一些在胞內(nèi)無活性的蛋白質(zhì)在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白質(zhì)能夠正確折疊 。3產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沒有氨基末端甲硫氨酸，因?yàn)榍懈钗稽c(diǎn)在信號(hào)肽與編碼序列之間，甲硫

24、氨酸會(huì)影響許多蛋白質(zhì)的活性。分泌型載體的缺點(diǎn)1目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量往往很低，2信號(hào)肽不能被切除或切在錯(cuò)誤位置。提高原核細(xì)胞中外源基因表達(dá)效率的措施1以融合蛋白表達(dá)目的蛋白提高融合蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。 2使用強(qiáng)啟動(dòng)子提高mRNA產(chǎn)量，并在基因下游加入穩(wěn)定mRNA的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，防止轉(zhuǎn)錄過度。3調(diào)整SD序列與ATG間的距離。SD序列與ATG的距離過長(zhǎng)或過短都會(huì)影響目的基因的表達(dá)，有時(shí)由于這種距離的影響蛋白質(zhì)合成會(huì)相差2,000倍以上。應(yīng)該在目的基因ATG上游 100bp左右開始，用酶切形成不同長(zhǎng)度的片段，與帶啟動(dòng)子和SD序列的載體連接后，產(chǎn)生一系列重組DNA。從中選擇產(chǎn)生高水平天然目的蛋白的重組體。

25、4利用蛋白酶缺陷型的宿主，例如用lon營(yíng)養(yǎng)缺陷型減少外源蛋白的降解。5在宿主內(nèi)表達(dá)蛋白酶抑制產(chǎn)物，從而抑制蛋白酶活性。6使蛋白質(zhì)分泌到體外，減少反饋抑制或蛋白酶降解。7調(diào)整帶目的基因的表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，增加模板數(shù)。 8利用誘導(dǎo)物進(jìn)行表達(dá)。過早地大量表達(dá)外源基因往往影響宿主細(xì)胞的繁殖，因此當(dāng)不表達(dá)時(shí)，可使宿主細(xì)胞迅速繁殖生長(zhǎng)得到較大的生物量，然后利用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。9人工合成目的基因，在不改變蛋白質(zhì)氨基酸的前提下，根據(jù)簡(jiǎn)并性，利用宿主偏愛的密碼子改變部分堿基序列。10定點(diǎn)誘變，消除核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響翻譯起始效率。外源DNA與載體重組粘性末端連接：連接效率

26、高若DNA插入片段與適當(dāng)?shù)妮d體存在同源粘性末端，這將是最方便的克隆途徑。同源粘性末端包括相同內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端和不同的內(nèi)切酶產(chǎn)生的互補(bǔ)粘性末端。相同內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘末端連接得到的重組質(zhì)粒能夠保留接合處的限制酶切位點(diǎn)，因此可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。而不同酶產(chǎn)生的粘性末端連接得到的重組質(zhì)粒不能夠保留接合處的限制酶切位點(diǎn)，因此不可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。以上兩類粘性末端的連接方法都很重要。另外，當(dāng)用單酶切時(shí)，雖然產(chǎn)生了互補(bǔ)的粘性末端，但由于載體存在自連現(xiàn)象，也會(huì)降低正確插入的頻率。通過一些處理可以減少自連現(xiàn)象的發(fā)生。常用的方法是用小腸堿性磷酸酶

27、(CIP)去掉載體5¢-磷酸來達(dá)到抑制DNA片段的自身環(huán)化的目的。綜上所述，在進(jìn)行基因重組時(shí)，一般采用插入片段及載體兩端具有兩個(gè)相應(yīng)的能夠產(chǎn)生粘性末端的酶進(jìn)行酶切后重組，如插入片段和載體的一端為EcoR I ，另一端為BamH I，它們都能產(chǎn)生粘性末端，不僅易于連接，而且又不能互補(bǔ)，所以能夠得到較好的重組結(jié)果。平端連接：連接效率低待插入片段的平末端主要由兩方面來源，即由酶切后產(chǎn)生的平端和補(bǔ)平后產(chǎn)生的平端。一般由酶切產(chǎn)生的平端較易連接。但在試驗(yàn)過程中，往往會(huì)遇到插入片段和載體之間沒有互補(bǔ)的末端，這時(shí)，就需要將末端進(jìn)行“補(bǔ)平”或去除3¢突出端，然后再用T4噬菌體DNA連接酶連接

28、兩個(gè)平端。不過，平端連接的效率是比較低的，一般通過提高DNA的濃度或增加連接酶的用量可提高平端的連接效率，有時(shí)也可采取在平端加上合成的接頭的方法，產(chǎn)生粘性末端，也可以提高連接的效率 。一端是粘性末端，另一端是平末端連接不需要去磷酸化。作連接用的基因片段要純化，量大一點(diǎn)，感受態(tài)做好一點(diǎn)。 只是通常連接時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一點(diǎn)（過夜好一點(diǎn)），用比較濃的酶。 重組DNA導(dǎo)入宿主 要注意的幾個(gè)名詞：轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)染 感染 結(jié)合轉(zhuǎn)化（transformation）： 即一來自一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞(供體)DNA(片段)被另一個(gè)細(xì)胞(受體)所吸收(隨后同受體染色體一起進(jìn)行重組)感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）：能夠吸

29、收DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction)：由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程或者說由噬菌體將細(xì)菌基因由一個(gè)細(xì)菌(供體)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌(受體)的過程。轉(zhuǎn)染 (transfection)：感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)分離出來的噬菌體核酸感染,隨后能產(chǎn)生出正常噬菌體后代或者說真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。感染 (infection)：病原微生物在寄主組織內(nèi)立足的狀態(tài)目的基因的篩選和鑒定(screening/selection)1遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertion inactivation):抗藥性標(biāo)志選擇標(biāo)志補(bǔ)救：表達(dá)產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)。包括- 互補(bǔ)、藍(lán)白斑篩選

30、 2免疫學(xué)方法3分子雜交探針-原位雜交4PCR5 限制性酶切圖譜 第七章 DNA序列測(cè)定與分析測(cè)序策略Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學(xué)直讀法雜交測(cè)序與DNA芯片技術(shù)ESTDNA序列分析DNA序列測(cè)定的幾個(gè)支撐技術(shù)Sanger雙脫氧末端終止法；PCR技術(shù)；DNA自動(dòng)測(cè)序儀的發(fā)展；生物信息學(xué)分析軟硬件設(shè)施大規(guī)?；蚪M測(cè)序的兩種策略逐步克隆法（Clone by Clone）基因組DNABAC文庫根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC 或contig用于霰彈法測(cè)序的候選克隆用于霰彈法測(cè)序的亞克隆測(cè)序并組裝完整的基因組序列全基因組霰彈法（Whole Genome Shot-gun)又叫鳥槍

31、法基因組DNA霰彈法克隆測(cè)序并進(jìn)行全基因組序列組裝完整的基因組序列兩種大規(guī)?；蚪M測(cè)序策略的比較 項(xiàng) 目策 略全基因組霰彈法逐步克隆法遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖）譜）速度快慢費(fèi)用低高計(jì)算機(jī)性能高（以全基因組為單位進(jìn)行）拼接）低（以BAC為單位進(jìn)行拼接）適用范圍工作框架圖精細(xì)圖代表測(cè)序物種果蠅、擬南芥、水稻人、線蟲物理圖譜的構(gòu)建 （不是重點(diǎn)）大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測(cè)定及分析p120.需要掌握：1、什么是EST?2、EST的應(yīng)用 3、EST序列測(cè)定及分析過程ESTs（Expressed Sequence tags ）：是從已建好的cDNA庫中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5末端或3末端對(duì)插

32、入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。EST的應(yīng)用：1ESTs與基因識(shí)別ESTs已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于基因識(shí)別，因?yàn)镋STs的數(shù)目比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人員更容易在EST庫中搜尋到新的基因(Boguski et al., 1994). 在同一物種中搜尋基因家族的新成員(paralogs)。 在不同物種間搜尋功能相同的基因(orthologs)。 已知基因的不同剪切模式的搜尋。2ESTs與基因圖譜的繪制 EST可以借助于序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-tagged sites)用于基因圖譜的構(gòu)建. STS本身是從人類基因組中隨機(jī)選擇出

33、來的長(zhǎng)度在200-300bp左右的經(jīng)PCR檢測(cè)的基因組中唯一的一段序列。來自mRNA的3非翻譯區(qū)的ESTs更適合做為STSs，用于基因圖譜的繪制。其優(yōu)點(diǎn)主要包括： 由于沒有內(nèi)含子的存在，因此在cDNA及基因組模板中其PCR產(chǎn)物的大小相同； 與編碼區(qū)具有很強(qiáng)的保守性不同，3UTRs序列的保守性較差，因此很容易將單個(gè)基因與編碼序列關(guān)系非常緊密的相似基因家族成員分開。 （James Sikela等，1991年）3ESTs與基因預(yù)測(cè) 由于EST來源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫建立時(shí)所采樣品特定發(fā)育時(shí)期和生理狀態(tài)下的一個(gè)基因的部分序列。使用合適的比對(duì)參數(shù)，大于90的已經(jīng)注釋的基因都能在EST

34、庫中檢測(cè)到(Bailey et al., 1998)。ESTs可以做為其它基因預(yù)測(cè)算法的補(bǔ)充，因?yàn)樗鼈儗?duì)預(yù)測(cè)基因的交替剪切和3 非翻譯區(qū)很有效。4ESTs與SNPs來自不同個(gè)體的冗余的ESTs可用于發(fā)現(xiàn)基因組中轉(zhuǎn)錄區(qū)域存在的SNPs。最近的許多研究都證明對(duì)ESTs數(shù)據(jù)的分析可以發(fā)現(xiàn)基因相關(guān)的SNPs (Buetow et al., 1999;Garg et al., 1999; Marth et al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999) 。應(yīng)注意區(qū)別真正的SNPs和由于測(cè)序錯(cuò)誤( ESTs為單向測(cè)序得來，錯(cuò)誤率可達(dá)2)而引起的本身不存在的SNPs。解決這

35、一問題可以通過： 提高ESTs分析的準(zhǔn)確性。 對(duì)所發(fā)現(xiàn)的SNPs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。5利用ESTs大規(guī)模分析基因表達(dá)水平 因?yàn)镋ST序列是從某以特定的組織的cDNA文庫中隨機(jī)測(cè)序而得到，所以可以用利用未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和差減雜交的cDNA文庫EST分析特定組織的基因表達(dá)譜。標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫和經(jīng)過差減雜交的cDNA文庫則不能反應(yīng)基因表達(dá)的水平。ESTs數(shù)據(jù)的不足1ESTs很短，沒有給出完整的表達(dá)序列2低豐度表達(dá)基因不易獲得3由于只是一輪測(cè)序結(jié)果，出錯(cuò)率達(dá)2%-5%4有時(shí)有載體序列和核外mRNA來源的cDNA污染或是基因組DNA的污染5有時(shí)出現(xiàn)鑲嵌克隆6序列的冗余，導(dǎo)致所需要處理的數(shù)據(jù)量很大Chapter

36、8聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)本章應(yīng)掌握的內(nèi)容PCR的基本原理；PCR條件的優(yōu)化；由基本PCR拓展的相關(guān)技術(shù)及其應(yīng)用 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。PCR引物設(shè)計(jì)的重要性1 決定著擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增的效率。2 設(shè)計(jì)影響到后續(xù)載體構(gòu)建的效率3 設(shè)計(jì)影響到實(shí)驗(yàn)的成本引物設(shè)計(jì)原則：主要考慮長(zhǎng)度，順序，堿基組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)3-端的要求，對(duì)5-端的要求， Tm值PCR引物的寡核苷酸數(shù)（長(zhǎng)度）一般在1630個(gè)核苷酸（NT），至少為16個(gè)核苷酸，最好為2024個(gè)核苷酸 。（以上指與模板鏈完全配對(duì)的堿基數(shù)）太短

37、，特異性差；太長(zhǎng)，自身折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，Tm過高，不利于與模板穩(wěn)固配對(duì)，難以形成擴(kuò)增起始二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物順序應(yīng)是所要擴(kuò)增基因特異的順序，若要進(jìn)行個(gè)體間的比較，應(yīng)選擇保守同一的順序來設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)后用電腦DNA數(shù)據(jù)庫檢測(cè)同源性。 引物的堿基組成GC為4060，ATGC最好隨機(jī)分布。GC太少擴(kuò)增效果不佳，GC過多易出現(xiàn)非特異條帶，避免成串的嘌呤和嘧啶。引物中的二級(jí)結(jié)構(gòu)一對(duì)引物的順序不應(yīng)自身互補(bǔ)，特別要避免3-端的重疊，以免形成二聚體等特異的擴(kuò)增條帶。對(duì)3-端的要求3-端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格配對(duì)。若3端最末的堿基不肯定，可用次黃嘌呤核苷取代的引物，因?yàn)?I 可與ATGC配對(duì)，這樣

38、可避免因末端堿基不配對(duì)而造成PCR失敗。防止3-末端發(fā)卡結(jié)構(gòu) 、莖環(huán)結(jié)構(gòu) ！對(duì)5-端的要求5-端可附加一段與模板非互補(bǔ)的序列，可長(zhǎng)至45NT，而不影響擴(kuò)增，這點(diǎn)對(duì)研究基因結(jié)構(gòu)與功能很有用。一般在引物的5-端可加入限制酶位點(diǎn)序列，以便進(jìn)行克隆。在酶切位點(diǎn)5-端還應(yīng)加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基極（如GCGC和GGCC），以保證擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物克隆后能夠被酶切。設(shè)計(jì)5-端的RE位點(diǎn)序列是最費(fèi)時(shí)的！功能基因起始密碼（ATG）5-端前應(yīng)加入的序列（Kozak序列）。動(dòng)物功能基因前加入序列：CCACCATG；植物功能基因前加入序列：AACAATG引物的Tm值（擴(kuò)增特異基因，Tm一般選4060）1反應(yīng)體系對(duì)引物退火溫

39、度的影響。如酶的最適工作溫度對(duì)引物退火溫度的限制等。太低，引物與模板非特異結(jié)合，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增條帶。太高，引物與模板結(jié)合不牢固，無擴(kuò)增。2擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值。引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后，即可定下引物的長(zhǎng)度范圍PCR條件的優(yōu)化（常見問題分析與對(duì)策） 一、 假陰性：不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板： 模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸

40、變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。 酶失活： 需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物： 引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單 位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，

41、而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度： Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 反應(yīng)體積的改變： 通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床

42、檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因： 變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異： 如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 二、假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

43、 引物設(shè)計(jì)不合適： 選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染： 這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決： 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與

44、引物互補(bǔ)后，可擴(kuò) 增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變

45、性，65左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。Chapter 9 DNA分子標(biāo)記技術(shù) 大綱要求基于Southern雜交技術(shù)的分子標(biāo)記: RFLP，VNTRs基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記: 隨機(jī)引物分子標(biāo)記技術(shù)RAPD，AFLP，SSR/STR分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域 遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記主要分為形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA 分子標(biāo)記4 種類

46、型.理想的遺傳標(biāo)記應(yīng)具備多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、遺傳行為簡(jiǎn)單、能檢測(cè)整個(gè)基因組、不受內(nèi)外環(huán)境影響、操作經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單等基本特征. DNA 分子標(biāo)記： DNA 標(biāo)記是DNA 水平上遺傳變異的直接反映,最能穩(wěn)定遺傳且信息量大,許多多態(tài)性標(biāo)記在非編碼區(qū)表現(xiàn)選擇“中性”,不受內(nèi)外環(huán)境影響,與基因表達(dá)與否無關(guān),檢測(cè)迅速,操作也方便。由此可見,DNA 分子標(biāo)記是最理想的遺傳標(biāo)記。依多態(tài)性檢測(cè)手段可分為：以Southern 雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記和以PCR 技術(shù)為核心的分子標(biāo)記限制性片段多態(tài)性( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP)這是第一個(gè)被應(yīng)用于遺傳研究

47、的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)。 原理：限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割基因組DNA 分子中特定的位點(diǎn),如果因堿基的突變、插入或缺失,或者染色體結(jié)構(gòu)的變化而導(dǎo)致生物個(gè)體或種群間該酶切位點(diǎn)的消失或新的酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生,用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA 后,將產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限制性片段,這些片段經(jīng)電泳分離后,在聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)不同的帶狀分布,通過與克隆的DNA 探針進(jìn)行Sourthern 雜交和放射自顯影后,即可產(chǎn)生和獲得反映生物個(gè)體或群體特異性的RFLP 圖譜。 探針的來源主要是cDNA 克隆,其中cDNA探針保守性較強(qiáng),許多同科物種cDNA 探針都可以作為通用探針.RFLP 分析技術(shù)路線小分子DNA

48、 ,如細(xì)胞器基因,將純化的DNA 樣品用限制性內(nèi)切酶消化成長(zhǎng)度不等的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外光下直接觀察其多態(tài)性。大分子核DNA 需要借助分子雜交手段,用某一標(biāo)記DNA 片段的探針與被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上的DNA 片段進(jìn)行雜交,只有與探針有高度同源性的片段被檢測(cè)出來。RFLP 的優(yōu)點(diǎn) ：呈孟德爾遺傳;不受環(huán)境影響,是一種共顯性標(biāo)記, 結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好。共顯性（codominance）：在雜合子狀態(tài)下，兩個(gè)基因的作用都表現(xiàn)出來。缺點(diǎn)RFLP 需要大量的DNA ,樣品要求高。多態(tài)性頻率較低。判讀有一定困難。實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果比較有一定困難。制備放射性探針進(jìn)行Southe

49、rn 雜交,因而比較費(fèi)時(shí),對(duì)人體健康有影響,對(duì)環(huán)境有污染 RFLP應(yīng)用適用于構(gòu)建表達(dá)圖譜。分析群體內(nèi)和群體間遺傳變異度。群體間基因流評(píng)價(jià)和親緣關(guān)系時(shí)是強(qiáng)有利的評(píng)價(jià)。也可用于人類遺傳疾病的診斷。隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Random Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 1990 年由美國(guó)杜邦公司農(nóng)產(chǎn)品研究中心的Williams 等用任意順序的10 個(gè)堿基的寡核苷酸片斷作為引物,用未知序列的基因組DNA 為模板,通過PCR 擴(kuò)增獲得一組不連續(xù)的DNA 片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)DNA 序列多態(tài)性.并將此法命名為RAPD。 RAPD 技術(shù)與PCR 技術(shù)相比較 1 R

50、APD 反應(yīng)一般由1 個(gè)10寡核苷酸隨機(jī)引物,常規(guī)PCR 需用2 個(gè)20 bp 左右的特定設(shè)計(jì)引物; 2 RAPD 反應(yīng)退火溫度低,一般是36 左右,一方面保證引物與模板DNA 的穩(wěn)定配對(duì),同時(shí)允許適當(dāng)錯(cuò)誤配對(duì),提高多態(tài)性檢出率; 3 常規(guī)PCR 為特異擴(kuò)增,而RAPD 產(chǎn)物為隨機(jī)擴(kuò)增. RAPD 技術(shù)路線 采用隨機(jī)序列10個(gè)核苷酸引物對(duì)基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,非特異引物可結(jié)合模板DNA 的多個(gè)位點(diǎn),產(chǎn)生多個(gè)條帶,經(jīng)電泳分離,或EB 染色,可直接檢測(cè)DNA多態(tài)性,并用于DNA 指紋分析. RAPD 的優(yōu)點(diǎn) 1引物設(shè)計(jì)是隨機(jī)的, 故可在對(duì)各種生物沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下,對(duì)其進(jìn)行DNA 多

51、態(tài)性分析。2所需模板DNA 的量極少, 只要有特定的DNA 片段, 就可將該DNA 片段擴(kuò)增。3引物為人工合成, 通常一套引物可用于多物種的基因組DNA 多態(tài)性分析。4每個(gè)RA PD 標(biāo)記就相當(dāng)于一個(gè)靶序列位點(diǎn)(Sequence Tagged Sites) , 可以檢測(cè)出RFLP標(biāo)記不能檢測(cè)的重復(fù)順序,可填補(bǔ)RFL P圖譜空缺, 更有效地進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建。5絕大多數(shù)RA PD標(biāo)記遵從孟德爾遺傳規(guī)律。 RAPD 技術(shù)的局限性 1由于隨機(jī)引物較短,退火溫度低,因而對(duì)一些PCR 因素更敏感,重復(fù)性較差。一般來說,對(duì)于特定的儀器設(shè)備,對(duì)其反應(yīng)條件反復(fù)進(jìn)行優(yōu)化,才可以得到較可靠的結(jié)果。2分辨率低。3結(jié)

52、果不全是共顯性。4無法分析差異原因。應(yīng)用1盡管RAPD 技術(shù)誕生的時(shí)間很短,但由于其獨(dú)到的快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)DNA 多態(tài)性的方式,使這些技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面,在分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。2適用于種質(zhì)資源的鑒定和分類、目標(biāo)性狀基因分子標(biāo)記、遺傳圖譜的快速構(gòu)建等研究,也可用于親緣關(guān)系等的研究擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism ,AFLP) 既有RFLP 的可靠性,又有RAPD 的方便性基本原理 在AFL P 中,如果DNA 片段遺傳特性發(fā)生改變,則酶切片段數(shù)目、長(zhǎng)短發(fā)生變化,通過PCR 擴(kuò)增基因組DNA

53、片段,擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性就反映在變性聚丙烯酰胺電泳的圖譜上其中引物= 接頭+ 酶切位點(diǎn)+ 23 個(gè)核苷酸. AFLP 技術(shù)分析流程 1DNA 模板制備。2提取樣本DNA 經(jīng)濃度和質(zhì)量檢測(cè)后,一般采用雙酶切, 在基因組DNA 上產(chǎn)生低頻和高頻切口。3選擇性擴(kuò)增酶切片段. 酶切后,限制性片段在T4 連接酶作用下與特定接頭連接,形成帶有接頭的特異性片段。4PCR 前擴(kuò)增,一般用帶一個(gè)選擇性引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件與常規(guī)PCR反應(yīng)基本一致; 5利用放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記PCR 引物。在Taq聚合酶作用下完成94變性30 s ,65淬火30 s ,72 延伸60 s ,PCR 擴(kuò)增36 個(gè)循環(huán)。 6PCR

54、產(chǎn)物在含尿素聚丙烯酰胺上電泳。7將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移到吸附濾紙上,經(jīng)干膠儀進(jìn)行干膠處理。 8在X 光片上感光,數(shù)日后沖洗膠片并進(jìn)行結(jié)果分析。優(yōu)點(diǎn)所需DNA 少(僅需0. 5 微克) ,也可以作用于線粒體DNA。從線粒體中得到RFL P研究所需的幾十到上百微克mDNA 是很困難的。Rosendahl 和Taylor 成功地從mycorrhizal 菌單孢子中獲得了AFL P 標(biāo)記,而每個(gè)單孢子僅產(chǎn)生約0. 10. 5gDNA；效率高且簡(jiǎn)單,RFLP 每次只能分析已知少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn),而AFL P呈典型的孟德爾式遺傳,每個(gè)AFL P 可以獲得50100 條譜帶信息,多態(tài)性強(qiáng)；分辨率高。AFL P擴(kuò)增片段

55、短,片段多態(tài)性檢出率高,而RFL P 片段相對(duì)較大,內(nèi)部多態(tài)性往往被掩蓋；可靠性好。AFL P 由于是特定引物擴(kuò)增,退火溫度高 (一般65 ) ,只有那些與3端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增,選擇性很強(qiáng).因而假陽性低,重復(fù)性好,克服了RAPD 缺點(diǎn)。Jones 等在歐洲8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室,使用共同的樣本,進(jìn)行了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn),將得到的DNA 圖譜比較,172 條譜帶中僅一條出錯(cuò)。這就是說,實(shí)驗(yàn)室間的誤差要少于6 %；不需要Southern 雜交,不需要預(yù)先知道DNA 的序列信息。而且,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在所有的多態(tài)AFLP 標(biāo)記中, 共顯性的AFLP 標(biāo)記出現(xiàn)頻率為4 %15 %,即200 個(gè)多態(tài)標(biāo)記包括530 個(gè)基

56、因座位；李傳友等(2000) 將AFLP 標(biāo)記和RFLP ,RAPD 標(biāo)記進(jìn)行比較,認(rèn)為它們鑒別多態(tài)的功效是AFLP > RAPD > RFLP。 AFLP的應(yīng)用 1在生物多樣性中將AFLP廣泛應(yīng)用到那些無法通過形態(tài)特征區(qū)別的分子標(biāo)記解決的家系或近緣物種與系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究中,是生物多樣性調(diào)查的重要工具。2構(gòu)建遺傳圖譜。3AFLP還可應(yīng)用于基因定位和性別鑒定及繁殖行為研究中。AFLP的不足 1不是共顯性標(biāo)記,擴(kuò)增片段少數(shù)是共顯性條帶,多數(shù)是擴(kuò)增片段有/ 無顯性條帶,條帶統(tǒng)計(jì)分析難度較大。2標(biāo)記引物需要同位素或其它化學(xué)試劑,相對(duì)費(fèi)時(shí)。3對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平要求較高。4對(duì)模板DNA的質(zhì)量要