2細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷

1、感染的診斷感染的診斷有賴于有賴于l從標(biāo)本中檢出病原體或檢出病原從標(biāo)本中檢出病原體或檢出病原體的可溶性抗原體的可溶性抗原,或病原體的或病原體的dnal病人血清中檢出病原體的抗體病人血清中檢出病原體的抗體 本章主要討論檢出病原體的問題本章主要討論檢出病原體的問題實(shí)驗(yàn)診斷的目的與要求實(shí)驗(yàn)診斷的目的與要求l進(jìn)行病原學(xué)診斷進(jìn)行病原學(xué)診斷l(xiāng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn),指導(dǎo)合理用藥指導(dǎo)合理用藥l用作流行病學(xué)調(diào)查用作流行病學(xué)調(diào)查, 追蹤傳染源追蹤傳染源l研究病原生物與感染的關(guān)系研究病原生物與感染的關(guān)系l時間：時間：1992年年9月月l發(fā)?。喊l(fā)?。?6名名l死亡：死亡：10名名l地點(diǎn)：某嬰兒室地點(diǎn)：某嬰兒室l傳染

2、源：慢性攜帶者產(chǎn)婦傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦l傳播方式：通過污染操作臺接觸傳播方式：通過污染操作臺接觸l時間：時間：1991年年11月月l地點(diǎn)：某嬰兒室地點(diǎn)：某嬰兒室l發(fā)病：發(fā)病：55名名 l 死亡：死亡：23名名l 56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件件檢出鼠傷寒沙門菌檢出鼠傷寒沙門菌l有價值的有價值的l快速簡便的快速簡便的l特異性和敏感性高的特異性和敏感性高的查病原體查病原體:直接涂片直接涂片 分離分離,對純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定對純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定查可溶性抗原查可溶性抗原: 用已知抗體用已知抗體查查dna:分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法查抗體查抗體: 用已知抗原用已知抗原

3、igm igg: 效價有效價有4倍以上增高倍以上增高l雙歧檢索雙歧檢索: 以某一試驗(yàn)分以某一試驗(yàn)分l表解表解: 用多種試驗(yàn)整體分析用多種試驗(yàn)整體分析l數(shù)字編碼數(shù)字編碼: 將多種試驗(yàn)分別編碼將多種試驗(yàn)分別編碼, 數(shù)字化后查表數(shù)字化后查表革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陰性桿菌葡萄糖發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵+ -氧化酶氧化酶+ -弧菌弧菌腸桿菌腸桿菌非發(fā)酵菌非發(fā)酵菌a b c d e甲甲 乙乙 丙丙 丁丁+ + - - + + + - - - + + - + - + +組別組別 試驗(yàn)試驗(yàn) 代碼代碼 結(jié)果結(jié)果 結(jié)果代碼結(jié)果代碼 總值總值 1 a 4 - 0 1 b 2 - 0 c 1 + 1 2 d 4 + 4 5 e

4、2 - 0 f 1 + 1 15 l 各試驗(yàn)孔含不同試驗(yàn)的脫水底物各試驗(yàn)孔含不同試驗(yàn)的脫水底物l 加入純化的被檢菌加入純化的被檢菌l 孵育孵育4-24h觀察結(jié)果觀察結(jié)果l 人工讀取根據(jù)編碼資料判定菌種或人工讀取根據(jù)編碼資料判定菌種或 電腦讀取電腦讀取 臨床標(biāo)本的采集與處理臨床標(biāo)本的采集與處理l早期早期,用抗菌藥物前用抗菌藥物前l(fā)根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo)根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo)本本l無菌技術(shù)無菌技術(shù),避免正常菌群污染避免正常菌群污染,防止病防止病原體播散原體播散l采用合適的方法采用合適的方法l盡快接種到合適的培養(yǎng)基上盡快接種到合適的培養(yǎng)基上l根據(jù)抵抗力選擇保存和運(yùn)輸條件根據(jù)抵抗力選擇

5、保存和運(yùn)輸條件 厭氧菌厭氧菌 奈瑟菌奈瑟菌 病毒病毒細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查l用懸滴法或壓片用懸滴法或壓片l細(xì)菌是活的細(xì)菌是活的,可觀察運(yùn)動可觀察運(yùn)動l加入特異抗體可抑制其運(yùn)動加入特異抗體可抑制其運(yùn)動l結(jié)合標(biāo)本來源可作初步診斷結(jié)合標(biāo)本來源可作初步診斷,如霍亂如霍亂,梅毒梅毒l用相差或暗視野顯微鏡效果更好用相差或暗視野顯微鏡效果更好壓片壓片懸滴法懸滴法l革蘭染色革蘭染色(gram stain):紫色革蘭陽性紫色革蘭陽性;紅紅色革蘭陰性色革蘭陰性. 注意細(xì)菌的大小注意細(xì)菌的大小,形狀形狀,排列排列以及著色的均一性以及著色的均一性l抗酸染色抗酸染色(acid-fast stain):紅色抗酸

6、陽性紅色抗酸陽性,藍(lán)色抗酸陰性藍(lán)色抗酸陰性l熒光染色熒光染色:更易觀察更易觀察特殊染色可用于觀察莢膜特殊染色可用于觀察莢膜, 鞭毛等鞭毛等細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)細(xì)菌的分離培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基:營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì),ph7.4 氣體氣體: 需氧菌需氧菌, 厭氧菌厭氧菌, 兼性厭氧兼性厭氧 菌菌,微需氧菌微需氧菌 溫度溫度: 一般一般37c 時間時間: 一般一般1824h1.對對培養(yǎng)基的基本要求培養(yǎng)基的基本要求l足夠的營養(yǎng)物質(zhì)足夠的營養(yǎng)物質(zhì)l合適的合適的phl無菌無菌l澄清澄清l按培養(yǎng)基成分分按培養(yǎng)基成分分: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基: 滿足一般細(xì)菌要求滿足一般細(xì)菌要求 營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)培

7、養(yǎng)基: 滿足苛求細(xì)菌要求滿足苛求細(xì)菌要求 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基: 加有被利用物和指示劑加有被利用物和指示劑 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基: 加有抑制劑加有抑制劑,能抑制非目的菌能抑制非目的菌生長生長 特殊培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基: 滿足特殊細(xì)菌要求滿足特殊細(xì)菌要求l按培養(yǎng)基物理性狀分按培養(yǎng)基物理性狀分: 液體液體:增菌增菌 固體固體:加加2%瓊脂瓊脂,平板用于分離純種平板用于分離純種,斜面用于傳代或保存細(xì)菌斜面用于傳代或保存細(xì)菌 半固體半固體:加加0.5%瓊脂瓊脂,用于觀察動力用于觀察動力,保存菌種保存菌種l分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法:用于分離純種用于分離純種,多次燒灼減少菌多次燒灼減少菌數(shù)數(shù),以獲取單個菌落以獲取

8、單個菌落l連續(xù)劃線連續(xù)劃線:不要求單個菌落不要求單個菌落,用于保存或繁殖用于保存或繁殖細(xì)菌細(xì)菌l涂布涂布:使細(xì)菌長成菌苔使細(xì)菌長成菌苔,可觀察細(xì)菌被抑制情可觀察細(xì)菌被抑制情況或用于繁殖細(xì)菌況或用于繁殖細(xì)菌l傾注平板傾注平板:少量細(xì)菌混于瓊脂中倒板少量細(xì)菌混于瓊脂中倒板,計數(shù)計數(shù),分離純種分離純種固體基固體基: 菌落形成菌落形成,注意其注意其 大小大小, 形狀形狀 表面表面, 邊緣邊緣 質(zhì)地質(zhì)地, 透明度透明度 溶血情況溶血情況液體基液體基: 渾濁渾濁,菌膜菌膜,沉淀沉淀l純種是細(xì)菌學(xué)工作的基礎(chǔ)純種是細(xì)菌學(xué)工作的基礎(chǔ)l獲得方法獲得方法: 劃線分離法劃線分離法(傾注平傾注平板法板法)獲得大的單個菌

9、落獲得大的單個菌落 斜面斜面 純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物l純培養(yǎng)物的外觀表現(xiàn)應(yīng)是一致的純培養(yǎng)物的外觀表現(xiàn)應(yīng)是一致的l確定有無細(xì)菌確定有無細(xì)菌l鑒定細(xì)菌鑒定細(xì)菌l藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)l計數(shù)細(xì)菌計數(shù)細(xì)菌l利用細(xì)菌利用細(xì)菌:制備菌苗制備菌苗,生產(chǎn)抗生素或基生產(chǎn)抗生素或基因工程產(chǎn)品因工程產(chǎn)品l細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測l內(nèi)毒素內(nèi)毒素:致熱作用致熱作用:兔體溫兔體溫 鱟試驗(yàn)鱟試驗(yàn)l外毒素外毒素:體內(nèi)體內(nèi):毒素與抗毒素的中和試驗(yàn)毒素與抗毒素的中和試驗(yàn) 體外體外:elek平板法平板法:沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) elisa毒素和抗毒素的中和試驗(yàn)毒素和抗毒素的中和試驗(yàn) 外毒素外毒素 ? 外毒素外毒素?+已知抗體已知抗體 小

10、白鼠小白鼠 小白鼠小白鼠結(jié)果結(jié)果 發(fā)病發(fā)病 發(fā)病發(fā)病 有毒性有毒性,但不是但不是相相 應(yīng)的應(yīng)的 發(fā)病發(fā)病 不發(fā)病不發(fā)病 是相應(yīng)毒素是相應(yīng)毒素 不發(fā)病不發(fā)病 不發(fā)病不發(fā)病 無毒性無毒性抗毒素抗毒素待測細(xì)菌待測細(xì)菌沉淀線沉淀線elek 試驗(yàn)試驗(yàn) 欲檢測細(xì)菌的生化反應(yīng)欲檢測細(xì)菌的生化反應(yīng), 一一般是在合適的培養(yǎng)基中加入被測般是在合適的培養(yǎng)基中加入被測物和檢測其代謝產(chǎn)物的試劑物和檢測其代謝產(chǎn)物的試劑, 即即在鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)在鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng), 或直或直接加試劑于培養(yǎng)物中接加試劑于培養(yǎng)物中, 觀察呈色觀察呈色等現(xiàn)象判定結(jié)果等現(xiàn)象判定結(jié)果 l糖糖(醇醇)發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵試驗(yàn):酸酸,氣體氣體l氧化氧化

11、-發(fā)酵發(fā)酵(o/f)試驗(yàn)試驗(yàn):l-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(onpg)試驗(yàn)試驗(yàn)l七葉苷水解試驗(yàn)七葉苷水解試驗(yàn)l甲基紅試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)lv-p試驗(yàn)試驗(yàn)l明膠液化試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn)lindol試驗(yàn)試驗(yàn)lura試驗(yàn)試驗(yàn)lh2s試驗(yàn)試驗(yàn)l苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)l氨基酸脫羧酶試驗(yàn)氨基酸脫羧酶試驗(yàn)l枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)l丙二酸鹽利用試驗(yàn)丙二酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)l氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)l過氧化氫酶試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)l硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)l卵磷脂酶試驗(yàn)卵磷脂酶試驗(yàn)l凝固酶試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)lcamp試驗(yàn)試驗(yàn)l膽汁溶菌試驗(yàn)?zāi)懼芫囼?yàn)lo/129試驗(yàn)試驗(yàn)l桿菌肽試驗(yàn)桿

12、菌肽試驗(yàn)loptochin試驗(yàn)試驗(yàn)感染的血清學(xué)檢測感染的血清學(xué)檢測l已知抗體檢測細(xì)菌的抗原用于鑒定已知抗體檢測細(xì)菌的抗原用于鑒定細(xì)菌細(xì)菌l已知抗原檢測病人血清中的抗體已知抗原檢測病人血清中的抗體 用于診斷感染性疾病用于診斷感染性疾病l了解微生物的抗原結(jié)構(gòu)了解微生物的抗原結(jié)構(gòu)l 用已知抗體檢測細(xì)菌的抗原組合用已知抗體檢測細(xì)菌的抗原組合l 特異性較高特異性較高l 多在鑒定的最后進(jìn)行多在鑒定的最后進(jìn)行l(wèi) 可用多種血清學(xué)方法可用多種血清學(xué)方法,細(xì)菌多細(xì)菌多用凝集用凝集反應(yīng)反應(yīng),病毒多用中和試驗(yàn)病毒多用中和試驗(yàn)l查抗體查抗體: 用已知抗原用已知抗原 igm: 感染的指標(biāo)感染的指標(biāo) igg: 效價有效價有

13、4倍以上增高或倍以上增高或 高于當(dāng)?shù)厝巳核礁哂诋?dāng)?shù)厝巳核絣多用于病程較長的全身性感染多用于病程較長的全身性感染感染的分子生物學(xué)檢測感染的分子生物學(xué)檢測檢出病原體檢出病原體dna證明病原體存在證明病原體存在l細(xì)菌分類細(xì)菌分類l臨床診斷臨床診斷,快速鑒定快速鑒定l耐藥性檢測耐藥性檢測l毒素檢測毒素檢測l流行病學(xué)調(diào)查流行病學(xué)調(diào)查l g+c mol% pcrl 限制性內(nèi)切酶片段長度限制性內(nèi)切酶片段長度l 核酸雜交核酸雜交l限制性內(nèi)切酶是能夠在一定部位切限制性內(nèi)切酶是能夠在一定部位切開開dnadna的酶的酶l同樣的內(nèi)切酶可將相同的同樣的內(nèi)切酶可將相同的dnadna切成同切成同樣數(shù)目的，同樣大小分子量

14、的片段樣數(shù)目的，同樣大小分子量的片段l電泳后對所得圖譜進(jìn)行分析可判斷電泳后對所得圖譜進(jìn)行分析可判斷dnadna是否相同是否相同 1989年國外某醫(yī)院泌尿科年國外某醫(yī)院泌尿科3周內(nèi)從病人血，尿中分出周內(nèi)從病人血，尿中分出8株不株不動桿菌，具有相同的耐藥性，經(jīng)動桿菌，具有相同的耐藥性，經(jīng) smal i 酶切后出現(xiàn)相同片段，但酶切后出現(xiàn)相同片段，但與環(huán)境中或其他科室分出的不動與環(huán)境中或其他科室分出的不動桿菌不同，表明泌尿科的病人是桿菌不同，表明泌尿科的病人是由同一克隆引起的爆發(fā)由同一克隆引起的爆發(fā) 某醫(yī)院某醫(yī)院icu病房，從水病房，從水池和病人標(biāo)本中分出多株銅池和病人標(biāo)本中分出多株銅綠假單胞菌，將其

15、染色體綠假單胞菌，將其染色體dna用用x bal 酶切，發(fā)現(xiàn)彼此酶切，發(fā)現(xiàn)彼此之間沒有共同的酶切片段圖之間沒有共同的酶切片段圖譜，病人之間圖譜的也不相譜，病人之間圖譜的也不相同，說明這不是一次爆發(fā)同，說明這不是一次爆發(fā)動物實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)l 分離細(xì)菌分離細(xì)菌, 獲取純種獲取純種l 檢測其致病性檢測其致病性, 觀察發(fā)病或死亡觀察發(fā)病或死亡,可同時可同時加抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)或保護(hù)試驗(yàn)加抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)或保護(hù)試驗(yàn)l 制備抗體制備抗體l 誘導(dǎo)變異誘導(dǎo)變異l 建立感染模型建立感染模型l 檢測生物制品的安全性檢測生物制品的安全性 l多用易感的小動物多用易感的小動物, 如小白鼠如小白鼠, 豚鼠豚鼠l按需要選擇按需要選擇 純系純系,突變系突變系,雜種雜種 無菌動物無菌動物(gf), 悉生動物悉生動物(gb), 無特?zé)o特殊病原體動物殊病原體動物(spf), 最低限度疾病動物最低限度疾病動物(mda), 普通動物普通動物l可選用多種途徑注射可選用多種途徑注射,如腹腔如腹腔,靜脈靜脈,皮下皮下,顱內(nèi)等顱內(nèi)等l形態(tài)形態(tài): 個體個體, 菌落菌落, 液體基生長情況液體基生長情況l生長需要生長需要:氧氧,溫度溫度,營養(yǎng)物營養(yǎng)物l生化反應(yīng)生化反應(yīng): 觀察其酶活性觀察其酶活性l抗原性抗原性: 用已知抗體用已知抗體l致病性致病性: 動物實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)l核酸核酸: pcr, 酶