分子生物學實驗報告

1、華中科技大學生命科學與技術學院分子生物學實驗報告 專業(yè) 班級 姓名 學號 日期 成績 實驗一 質粒的小劑量提取堿裂解法實驗原理：質粒(Plasmid)是獨立于細菌染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小為1-200千堿基對(kb)，存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多，在細胞中一般以游離超螺旋狀存在。質粒具有自主復制性、不相容性、多拷 貝性、轉移性、選擇性遺傳標記、質粒DNA鏈上有1到幾個限制性內切酶單一識別位點等特點。它可獨立游離于細胞質內，也可以整合到細菌染色體中，它離開宿主細胞就不能存活，而它控制的許多生物學功能也是對宿主細胞

2、的補償。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態(tài)，一是“嚴謹型”；二是“松馳型”。 1.嚴謹型：這些質粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；2.松馳型：這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使質?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質粒pBR322即屬于松弛型質粒，要經過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。質粒的提取有多種方法。本實驗采用堿裂解法 進行質粒

3、的小量制備。堿裂解法是常用的質粒的小劑量提取法，它的原理是：在堿性條件下，染色體DNA和質粒DNA都發(fā)生變性，但質粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，纏結的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質粒DNA因不溶于70的乙醇，可在加入乙醇后通過離心得到質粒DNA沉淀實驗目的：1、掌握堿裂解法提取質粒的基本原理。2、掌握堿裂解法的實驗操作及各種試劑的配制方法及作用。3、學習質粒的基本結

4、構實驗試劑與器材：（一）實驗試劑：1、LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，待用純水完全溶解后，用1N NaOH調pH至7.3左右，15Ibf/in2高壓蒸氣滅菌20分鐘。固體培養(yǎng)基則添加15g/L瓊脂。2、卡納霉素：100mg/ml，工作液為100ug/ml。3、溶液（pH8.0）：取1.982 g葡萄糖、4 ml EDTA（0.5 mol/L，pH8.0）、5 mlTris-Cl（1mol/L，pH8.0），加雙蒸水定容至200 ml，高壓滅菌20 分鐘，于4保存。 （50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。滅

5、菌后存放。）4、 溶液：取2 ml NaOH（10 mol/L稀釋）、10 ml SDS（10%），加雙蒸水定容至100 ml，室溫使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。 （0.2mol/L NaOH， 1% SDS（m/V） 5、 溶液：29.4 g乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，加雙蒸水定容至100 ml。 （5mol/L 乙酸鉀 60ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5ml。所配成的濃度中鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。保存于4度，用時置于冰浴中。）6、酚/氯仿/異戊醇液(V/V/V25/24/1)：配制時，先將氯仿中加入異戊醇，使其體積比為24:1，再將Tris平衡酚與之等體積混合，4保

6、存，1月內有效。7、TE緩沖液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT8、RNase 1mg/ml：稱10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，此液為10mg/ml RNase濃度，應用時稀釋至1mg/ml。9、70乙醇、無水乙醇10、分別含有pEGFP-C1質粒以及CMV-UXT質粒的大腸桿菌DH5（二）實驗儀器： 37度恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、臺式高速離心機、臺式小型振蕩器、水浴鍋

7、、EP管(1.5mL微量離心管)、移液槍(10uLlmL)、吸頭、制冰機、冰盒。實驗過程：1、將含有pEGFP-C1質粒及CMV-UXT質粒的大腸桿菌DH510l分別接種到10ml含卡納霉素(終濃度100g /ml)的LB培養(yǎng)液中，37振搖過液。2、取1.3ml菌液轉入Eppendorf管中，12000rpm離心1分鐘，除去上清（可以再加1.5ml菌液離心，以提高細菌細胞的數(shù)量）。盡可能吸干培養(yǎng)基。3、將細菌沉淀重懸于100l用冰預冷的溶液（已加入RNase，終濃度1mg/ml）中，旋渦振蕩混勻。4、加200l新配制的溶液，蓋緊管口，反復顛倒數(shù)次，使溶液在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，隨后置冰浴

8、中3-5分鐘。6、用臺式高速離心機12000rpm 離心5分鐘，將上清轉入另一Eppendorf管中。如上清液渾濁則需重新離心一次。7、加入與上清等體積酚/氯仿/異戊醇，旋渦振蕩混勻后，12000rpm離心5分鐘，小心吸取上清液，轉移至另一1.5mL Ep管中，注意勿將兩液相中間的白色蛋白薄層吸出。8、向上清液加入2倍體積無水乙醇，上下顛倒混勻（可以震蕩），室溫放置min。用離心機于12000rpm離心5min。小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。9、用0.5mL 70乙醇洗滌沉淀一次，上下顛倒混勻，12000rpm離心3min，除盡乙醇，室溫自然干燥(將離心管倒置于一

9、張紙巾上，約10-15分鐘)，備用。10、用30-50ul TE或去離子水溶解質粒DNA。11、用核酸測定儀分析DNA的質與量。實驗結果及分析：注意事項:1.步驟2中,一次加1.5ml于1.5mlEP管中會有點多,故加1.3ml或1.4ml,后期如若覺得細胞較少,可再次加菌液離心;2.步驟4禁止劇烈震蕩是為防止溶解細胞的同時基因組被破壞降解成小片段，影響后面對質粒的提取，防止最后得到的質粒里有大量雜質污染輕輕上下顛倒五到六次，澄清即可加溶液III3.考慮離心機加速階段占用一定時間，離心時間可適當加長，離心效果不佳可再次離心實驗二 PCR擴增目的片段實驗原理：PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱，指在引

10、物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術，在分子生物學中有廣泛的應用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學等。 PCR基本原理是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3末端有引物存在的情況下，用酶進行互補鏈的延伸，多次反復的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴增。在微量離心管中，加入與待擴增的DNA片段兩端已知序列分別互補的兩個引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq DNA聚合酶、Mg2+ 等。反應時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態(tài)

11、；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿53方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作為下一輪反應的模板，如此重復改變溫度，由高溫變性、低溫復性和適溫延伸組成一個周期，反復循環(huán)，使目的基因得以迅速擴增。瓊脂糖電泳：瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數(shù)量

12、，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數(shù)蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現(xiàn)廣泛應用于核酸的研究中。蛋白質和核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在69之間，離子強度0.020.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達107bp的DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于

13、等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。實驗目的：1、 掌握PCR基本原理2、 掌握PCR反應體系設計方法3、 掌握PCR基本實驗步驟4、 掌握瓊脂糖凝膠電泳原理及實驗試劑與器材：試劑：模板、引物F、引物R、dNTP、Taq酶、10×Buffer（含Mg2+）、ddH2O、TAE緩沖液、儀器：PCR擴增儀、EP管、移液槍(1uL10uL)、吸頭、制冰機、冰盒、電泳儀、電泳盒，凝膠電泳成像系統(tǒng)實驗過程：1、 了解PCR各組成成分的原始濃度，并根據(jù)PCR的總體積，計

14、算各組成成分的用量，并記入下表；PCR成分原始濃度終濃度使用量各成分多少對PCR的可能影響模板400ng/ul1ul模板量較少,擴增產物強度相應減弱；當模板量較多,會出現(xiàn)大片段擴增產物的缺失或無擴增產物,且點樣孔至泳道會出現(xiàn)相應增強的彌散背景引物F10uM100-500-1000nmol/L1.5ul引物濃度在一定范圍內時，擴增結果基本一致;但隨著引物濃度的逐漸增加,開始出現(xiàn)彌散背景增強的趨勢,并且有些擴增帶發(fā)生減弱或缺失引物R10uM100-500-1000nmol/L1.5ul同上dNTP2.5mM/each20-200umol/L0.6ul一定濃度范圍內，隨著濃度的減小,擴增帶明顯減少或

15、擴增強度減弱,當濃度某值時,擴增產物豐富、清晰、帶濃,擴增片段產率與濃度呈正相關Taq酶5U/ul2.5-5U/100ul0.9ul隨著聚合酶濃度的增高,擴增產物量呈增多趨勢但彌散背景也相應增強10×Buffer（含Mg2+）10×1x3ulMg2+濃度過小時,無擴增產物; Mg2+濃度在適當范圍時,隨著Mg2+濃度的增加,擴增產物帶型基本一致ddH2O21.5ul總體積30ul2、設計PCR的陰性對照組與陽性對照組，并計算各組相關成分的用量，并寫在實驗報告中；3、取冰塊，在冰上按照計算好的用量進行PCR各個成分的加樣（注意加樣順序！注意不要將樣品加到管壁上！）；4、上機，

16、記下PCR程序的各個參數(shù)；5、瓊脂糖電泳檢測PCR結果：、制膠（1%瓊脂糖）稱取DNA電泳用瓊脂糖放入100ml三角燒瓶中，加1×TAE緩沖液，將燒瓶置微波爐或電爐上加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。待凝膠溶液冷卻至60左右時，混勻后趁熱將凝膠溶液倒入插好適當梳齒的電泳板上。室溫下待凝膠完全凝固(約需30分鐘)，拔出梳齒，將凝膠連同制膠板一起放入電泳槽中。注意，上樣孔在電泳槽負極一端。、電泳向電泳槽中加1xTAE緩沖液至剛沒過凝膠表面。取三支Eppendorf管，標號，如下表準備電泳樣品。12345分子量標準PCR產物1PCR產物2提取的質粒1提取的質粒2樣品5l9l9l9l9l10&#

17、215;上樣緩沖液-1l1l1l1l混勻后，依次全部加入點樣孔中，注意加樣器吸頭不可插入過深，一般剛剛與加樣孔口相切，以免刺穿凝膠，導致樣品外溢。接通電源，調節(jié)電壓至80V，電泳約1小時左右，將凝膠板取出。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄結果。實驗結果及分析：圖1條帶從左至右依次為Marker、pEGFP-C1質粒、UXT質粒、PCR擴增陰性、PCR擴增實驗結果分析：1、第1條帶：Marker跑出來比較清楚，說明膠、緩沖液等條件較合適2、第2、3條帶：質粒拖尾擴散可能是提取不徹底，有殘留蛋白影響了其運動（蛋白質提取步驟為實驗一第7步，可能是蛋白層不慎吸出）。上樣量過大，加樣時間過長等也會造成拖尾現(xiàn)象（

18、但基于Marker正常，排除這些原因）。第2條帶孔處有擴散，應該是點樣時戳破了一點凝膠孔所致。3、第4、5條帶：前面跑的最快的分子量最小，應該是引物二聚體，由于其量少，故顏色也要暗一些。后面兩條帶應該是擴增出來的質粒，顏色比較亮，說明質粒濃度較大。甚至超出了顯色范圍而出現(xiàn)了紅色。注意事項：1、 TE緩沖液不需要加太多，剛好沒過凝膠表面就好，否則點樣的時候槍頭找凝膠孔的時候看著比較困難2、 點樣迅速，要穩(wěn)，點完樣后不應放置過長時間才電泳，防止樣品擴散。 實驗三 DNA重組目的片段與載體片段的連接實驗原理：DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的

19、方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起，而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來，但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。實驗目的：掌握DNA重組技術的原理及基本操作實驗試劑與器材：試劑：Buffer DE-A、Buffer DE-B、異丙醇、Buffer W1、Buffer W2、無菌水、10xBuffer、

20、Marker、T4DNA連接酶、EcoRI 、BamHI器材：1.5 ml離心管 、離心機 、水浴鍋 、DNA 制備管 、2 ml離心管、PCR儀實驗過程：(一) 酶切按照下表添加試劑后輕敲管底使其混勻，置離心機中離心數(shù)秒后置于37水浴鍋中保溫1.5半小時后取出并逐個加入上樣緩沖液，即可終止酶切反應以及用于電泳。膠回收DNA自提質粒10×BufferEcoRIBamHI水A（插入片段）-15ul3ul2ul2ul8ulB（載體片段）-3ul3ul2ul2ul20ul(二) 電泳：結果見圖2(三) 膠回收DNA片段1、在紫外燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并

21、切碎。計算凝膠重量（提前記錄1.5 ml 離心管重量），該重量作為一個凝膠體積（如100 mg=100 ul體積）。2、加入3 個凝膠體積（1%凝膠）的Buffer DE-A，混合均勻后于75°C 加熱（低熔點瓊脂糖凝膠于40°C 加熱），間斷混合（每2-3 min），直至凝膠塊完全熔化（約6-8 min）。* Buffer DE-A 為紅色溶液。在熔化凝膠的過程中，可以幫助觀察凝膠是否完全熔化。3、加0.5 個Buffer DE-A 體積的Buffer DE-B，混合均勻。當分離的DNA 片段小于400bp 時，需再加入1 個凝膠體積的異丙醇。* 加Buffer DE-B

22、 后混合物顏色變?yōu)辄S色，充分混勻以保證形成均一的黃色溶液。4、吸取步驟3 中的混合液，轉移到DNA 制備管（置于2 ml（試劑盒內提供）離心管）中，12,000×g離心1 min。棄濾液。5、將制備管置回2 ml 離心管，加500 l Buffer W1，12,000×g 離心30 s，棄濾液。6、將制備管置回2 ml 離心管，加700 l Buffer W2，12,000×g 離心30 s，棄濾液。以同樣的方法再用700 l Buffer W2 洗滌一次12,000×g 離心1 min。* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶

23、上的指定體積加入無水乙醇。* 兩次使用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對后續(xù)實驗的影響。7、將制備管置回2 ml 離心管中，12,000×g 離心1 min。8、將制備管置于潔凈的1.5 ml 離心管(試劑盒內提供)中，在制備膜中央加30l Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min。12,000×g 離心1 min 洗脫DNA。* 將Eluent 或去離子水加熱至65將提高洗脫效率。9、 制備管及柱子的回收：加700ul去離子水，12,000×g 離心1 min，棄濾液，反復3次，標記好，備用。10、 可以用瓊脂糖電泳檢測回收片段或核酸測定儀

24、測量。(四) 酶連、PCR擴增連接反應參照體系：10×T4 DNA連接緩沖液 1L*酶切后的載體片段 2L*酶切后的目的基因 6LT4DNA連接酶 1L 總體積 10L放入PCR儀中，16， 3小時。實驗結果及分析：圖2條帶從左至右依次為Marker、載體片段、插入片段結果分析：1、 第2條帶出現(xiàn)雜帶，應該是酶切時間過長切出了其他片段所導致，畢竟切出的雜片段是少的，所以其亮度較低。2、 根據(jù)條帶與Marker的對比，可以知道我們需要的是上圖紅色方框所標示部分。分子量大，為載體片段，總重290mg；分子量小，為目的基因片段，總重190mg。注意事項：1、 所切載體片段量較多，應分次離心

25、2、 第7步中，在第6步之后并未加入液體洗涕，但并不是沒有離心的必要；離心是除去殘留的肉眼不宜看出的液體3、 膠回收過程注意防護紫外線實驗四 感受態(tài)細胞的制作與重組質粒的轉化實驗原理：帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構建成后，需要導入適當?shù)乃拗骷毎麅冗M行繁殖或表達出具有一定生物活性的蛋白。能夠作為重組體轉化的受體，主要有動物細胞、植物細胞、微生物細胞等。導入受體細胞的途徑重要有轉化（轉染），顯微注射和電穿孔等多種不同的方式?？梢愿鶕?jù)不同的受體選擇不同的導入方式。一般情況下，細菌一類的原核生物和酵母這樣的低等真核細胞可用轉化方式導入，而高等動植物細胞則需采用顯微注射或電穿孔來進行。 細菌表面

26、通過CaCl2 處理后，局部失去細胞壁或細胞壁溶解，DNA分子能夠通過質膜進入細胞。其進入細胞的方式是完整的雙鏈DNA分子首先吸附到細胞表面，雙鏈DNA分子解鏈變成單鏈，單鏈DNA分子一條進入受體細胞內，另一條被降解。進入細胞內的單鏈DNA則復制成雙鏈環(huán)狀DNA，隨同復制子同時復制，并被轉錄翻譯。實驗目的：1、掌握制作感受態(tài)細胞的原理和方法2、掌握外源DNA轉入細胞的的原理及操作實驗試劑與器材：試劑：LB液體培養(yǎng)基、0.1mol/LCaCl2 、甘油、冰、 器材：50ml離心管、離心機、無菌吸頭、EP管、水浴鍋、搖床、涂布棒、酒精燈、培養(yǎng)皿實驗過程：1.受體菌培養(yǎng)：1)無菌接種環(huán)刮取凍存于-7

27、0的大腸桿菌菌種DH5，劃線接種于不含抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)16h左右。2)挑取一單個菌落，接種于3ml 不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)過夜。2感受態(tài)細胞制備（CaCl2法）：準備冰浴，將0.1mol/LCaCl2預冷。1)吸取0.5ml菌液接種于37預熱的25mlLB液體培養(yǎng)基（裝入50ml離心管）中（1：50的比例），37振蕩培養(yǎng)2.53h（后一個小時隨時觀察細菌生長情況，A600值約為0.4）。2)將處于對數(shù)生長期的菌液置于冰上，冰浴30min，冷卻至0。3)4，5000r/min離心10min。4)棄上清，倒置離心管，使殘留液體流盡。5)使細菌懸于10ml預冷

28、的0.1mol/LCaCl2溶液中，冰浴15min。6)4下，5000r/min 離心10min。7)棄上清，每個管加425ul冰預冷的0.1mol/LCaCl2重懸細胞，再加入75ul甘油，混勻。8)用無菌吸頭將感受態(tài)細胞分裝于無菌離心管中，50l/每管，貯存于-70。9)當天將制備好的感受態(tài)菌置于液氮中過夜，第二天可將之取出，在-70中保存，半年內使用。3、轉化： 準備冰浴，42水浴1)取連接產物10l加入50l感受態(tài)細胞混勻，冰浴30分鐘。同時完成對照組DNA的轉化，即：標準質粒（1ul，約1000ng）的轉化。2)將EP管轉移到42水浴中熱休克90秒后，迅速置冰浴中冷卻5分鐘。3)加入

29、300l LB液體培養(yǎng)基（無抗生素），37下以100 rpm輕搖45分鐘。4)取300l菌液涂于含卡納霉素的LB平板上。對照組依次操作。培養(yǎng)16h，觀察結果。 16h小時后觀察平板，判斷感受態(tài)的效益；判斷連接反應是否成功。實驗結果及分析：實驗組圖3陽性對照組圖4陰性對照組圖5結果分析：1、 陰性對照組沒有長雜菌，說明實驗過程中沒有雜菌污染2、 陽性對照組長出菌落，說明感受態(tài)細胞制作及細胞生理狀態(tài)正常3、 實驗組幾乎未長出菌落，聯(lián)合陽性對照組和陰性對照組的結果分析可知，最大可能是重組質粒制作不成功?？赡苁琴|粒添加量過少所致。思考題：1. 請寫出堿裂解制備質粒中各個主要試劑的用途。答:卡那霉素：抗

30、生素，防止雜菌污染 溶液I：維持溶液pH，因此選用適當濃度和適當pH值的Tris-CI溶液。葡萄糖：使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子底部。EDTA：Cat+和Mgt+等二價金屬離子的鰲合劑，可以抑制DNase的活性和微生物生長。溶液II：NaOH：溶解細胞SDS：堿性，但若只用SDS，達不到徹底溶解細胞的作用，主要為下一步做鋪墊。溶液III：SDS在高鹽濃度下發(fā)生沉淀，同時SDS能與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，所以沉淀也將溶液中的大部分蛋白質沉淀下來。溶液中的K+置換了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高濃度的鹽使沉淀更完全。同時，由于基因組DNA很長，容易被PD

31、S共沉淀。2M的醋酸：中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，小于100 kb的片斷，就不容易與PDS共沉淀。酚/氯仿/異戊醇：PDS的沉淀并不能將所有的蛋白質沉淀，酚可以使蛋白質變性，作用大于氯仿，但水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。還有，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(比如限制性酶切反應)，因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液進行抽提，跑

32、到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。異戊醇的添加，主要可以使離心后上下層的界面更加清晰，方便水相的回收。 無水乙醇：沉淀DNA 79%乙醇：去鹽；DNA不能過度失水，否則變形，難恢復，難再溶。2. 請列舉估計/測定DNA濃度/純度的幾種辦法。答: 分光光度法：DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結構在紫光區(qū)具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算其比值來衡量樣品的純度。瓊脂糖電泳測量法 ：質粒DNA及