南醫(yī)生化實驗報告4

1、生物化學(xué)實驗報告一、實驗?zāi)康?.學(xué)習并掌握肝糖原提取和鑒定原理和方法；2.學(xué)習并掌握蒽酮比色測定糖原含量的原理、注意事項和操作方法；3.學(xué)習并掌握刻度吸管和微量加樣槍的使用方式；4.正確掌握使用離心機的方法步驟；5.正確掌握使用分光光度計的方法步驟。二、實驗原理1.肝糖原的提取與鑒定糖原是生物的主要儲能物質(zhì)之一，主要儲存與肝細胞中，采用研磨勻漿等方法可以使肝細胞破碎。肝細胞破碎，細胞內(nèi)容物流出。低濃度的三氯醋酸能使蛋白質(zhì)變性，破壞肝組織中的酶并且使蛋白質(zhì)沉淀，糖原則能夠穩(wěn)定地保存在上清液中，從而達到分離糖原與蛋白質(zhì)等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于熱水，故可以先用95%乙醇將濾液中糖原沉

2、淀，再溶于熱水中。糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。此外，糖原還可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反應(yīng)和葡萄糖的還原性，可以判定肝組織中糖原的存在。糖原水解溶液與班氏試劑混勻沸水浴加熱2min后會出現(xiàn)磚紅色沉淀。2. 肝糖原的定量測定糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故可將肝組織先置于濃堿中加熱，以破壞其他成分，保留肝糖原。糖原可以被濃酸水解成葡萄糖，而濃硫酸能使葡萄糖進一步脫水生成5-羥甲基呋喃甲醛，該化合物與蒽酮脫水縮合可以生成藍色的化合物。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。糖含量在10-100g，溶液顏色的深淺與可溶性糖的含量成正比。利用該反應(yīng)原理處理標準葡萄糖溶液，通過標準對照法即可計算出樣品中糖

3、原的含量。三、材料與方法：1.實驗材料（1）肝糖原的提取與鑒定樣品：1.50g的雞肝試劑：5%CCl3COOH、95%乙醇、蒸餾水、濃HCl溶液、50%NaOH溶液、碘試劑和班氏試劑儀器和器材：離心機、試管、玻璃棒、室溫至100恒溫水浴箱、剪刀、鑷子、刻度吸管、微量加樣槍和白瓷反應(yīng)板（2） 肝糖原的定量測定樣品：0.15g的雞肝試劑：30%KOH溶液、蒸餾水、標準葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液儀器和器材：室溫至100恒溫水浴箱、比色皿、分光光度計、試管、剪刀、鑷子、刻度吸管和微量加樣槍2.實驗流程（1）肝糖原的提取與鑒定用托盤天平稱取1.50g的雞肝，剪碎；加入5%CCl3COOH 1 ml，研

4、磨至乳狀；加入5%CCl3COOH 3 ml，研磨成肝勻漿；將肝勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，離心3分鐘（4000 r / min）；棄去沉淀，取上清液3ml；滴加3ml 95%乙醇，混勻，靜置10分鐘；離心5分鐘（4000 r / min）；棄去上清液，往沉淀中滴加1ml蒸餾水；沸水浴2分鐘，使沉淀溶解；得糖原溶液1ml，滴加5滴濃HCl；白瓷板孔穴中沸水浴15min，冷卻；加碘試劑2滴加糖原溶液2滴加碘試劑2滴滴加5滴50%NaOH溶液；呈色反應(yīng)得到糖原水解液。取糖原水解液2滴，滴加4滴班氏試劑；沸水浴2min，觀察變化。用托盤天平稱取0.15g的雞肝；（2） 肝糖原的定量測定沸水浴15min；冷

5、卻，全部轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中；加水至標線，仔細混勻，此為糖原提取液；肝糖原的定量測定。 取3支試管，按下表操作：試劑（ml）空白管標準管樣品管蒸餾水1.0-標準葡萄糖溶液-1.0-糖原提取液-1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5 混勻后，沸水浴10min，冷卻。在分光光度計620 nm波長處，用空白管溶液調(diào)零，測定各管溶液的吸光度（A）。四、結(jié)果與討論：1. 實驗結(jié)果（1） 肝糖原的提取與鑒定 所獲糖原溶液如下圖： 經(jīng)與蒸餾水比較，所獲糖原溶液呈乳樣光澤。經(jīng)加碘試劑呈色反應(yīng)，結(jié)果如下圖：經(jīng)檢驗，糖原溶液與碘試劑混合后呈紅棕色，故結(jié)論是：雞肝樣品中含有糖原。經(jīng)班氏試劑與糖原溶液混勻后沸水浴

6、2min，結(jié)果如下圖：經(jīng)檢驗，糖原水解溶液與班氏試劑混勻沸水浴加熱2min后出現(xiàn)磚紅色沉淀。故結(jié)論是：雞肝樣品中含有糖原，糖原水解后產(chǎn)生葡萄糖。（2） 肝糖原的定量檢測空白管、樣品管和標準管比色如下：測定次數(shù)空白管標準液樣品液100.7930.190200.7940.192300.7940.191各管平均值A(chǔ)62000.7940.191根據(jù)公式：肝糖原（g/100g肝組織）=A樣品/A標準 0.05×100/肝組織重(g)×100/1000×1.11得本組實驗：肝糖原=0.89g/100g肝組織 故本次實驗結(jié)論為：該雞肝樣品含有肝組織，且肝糖原含量為0.89g/1

7、00g肝組織。2. 結(jié)果分析經(jīng)查閱資料得：飽食雞肝的肝糖原含量為：23g/100g肝組織而本組實驗測得肝糖原=0.89g/100g肝組織，即本次實驗測得的肝糖原含量偏低。3.討論總結(jié)經(jīng)查閱資料和與搭檔討論得以下注意事項：（1）試劑中有強酸、強堿，如蒽酮試劑是用濃硫酸配制的，具有強腐蝕性，故操作中要注意安全；（2）0.2%蒽酮溶液和30%KOH 1.5ml 應(yīng)用刻度吸管移取，可減少實驗誤差，比起使用微量加樣槍操作也更安全，避免損毀微量加樣槍；（3）比色皿盛裝溶液體積不得超過比色皿2/3，防止溶液溢出，腐蝕比色杯架；（4）肝組織必須在沸水浴中全部溶解，否則將影響比色；（5）使用離心機前一定要配平，否則會損壞離心機；（6）糖原水解溶液與班氏試劑混勻沸水浴加熱2min后若出現(xiàn)黑色渾濁，則是因為班氏試劑過量所致；（7）蒽酮試劑必須2倍于被測液；（8）沸水浴時，注意打開方式，避免燙傷；（9）糖原提取并轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中進行樣品糖原溶液配制時必須注意仔細定容，以免導(dǎo)致稀釋倍數(shù)過大，導(dǎo)致實驗誤差；（10）肝糖原提