目的基因的連接、轉化、涂板培養(yǎng)-劉玥

1、生物化學與分子生物學教研室生物化學與分子生物學教研室劉玥劉玥 （TaKaRa公司）2. PCR擴增產物擴增產物3. T4 DNA連接酶連接酶4. 10T4DNA連接酶緩沖液連接酶緩沖液 反應體系反應體系連接試劑盒使用說明（連接試劑盒使用說明（TaKaRa公司）公司） 0.5l 0.5 l PCR擴增產物擴增產物 4.5lControl Insert DNA 1l ddH2O 3.5lSolution I 5l 5l總體積總體積 10l 10lo 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞o 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞：經過電擊、：經過電擊、 CaCl2、 RuCl等化等化學試劑處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成學試劑處理

2、后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。分子通過時細胞的狀態(tài)。實驗原理實驗原理 -CaCl -CaCl2 2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞 目前，感受態(tài)細胞的制備常用冰預冷的目前，感受態(tài)細胞的制備常用冰預冷的CaCl2處理細處理細菌的方法制備，即用菌的方法制備，即用CaCl2溶液在溶液在時處理快速生長的細菌，從而獲得感受態(tài)細菌。此時時處理快速生長的細菌，從而獲得感受態(tài)細菌。此時，在此條件下易形成在此條件下易形成粘附在細菌表面，通過粘附在細菌表面，通過促進細胞對促進細胞對DNA的吸收。的吸收。實驗器材實驗器材器材：器材：恒溫搖床恒溫

3、搖床, ,電熱恒溫培養(yǎng)箱電熱恒溫培養(yǎng)箱, ,臺式高速離心機臺式高速離心機, ,無無菌工作臺菌工作臺, ,低溫冰箱低溫冰箱, , 恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋, , 制冰機制冰機, , 分分光光度計光光度計, ,微量移液槍。微量移液槍。 1.LB1.LB瓊脂固體和液體培養(yǎng)基。瓊脂固體和液體培養(yǎng)基。2.2.含特定抗生素的含特定抗生素的LBLB固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基。3.100mM CaCl23.100mM CaCl2溶液。溶液。4.4.含含15%15%甘油的甘油的0.05mol/L CaCl2: 0.05mol/L CaCl2: 稱取稱取0.28g CaCl2(0.28g CaCl2(無無水水, ,分析純

4、分析純),),溶于溶于50ml50ml重蒸水中重蒸水中, ,加入加入15ml15ml甘油甘油, ,定容至定容至100ml,100ml,高壓滅菌。高壓滅菌。5. 5. 待轉化質粒。待轉化質粒。試劑試劑 實驗步驟實驗步驟1.1.挑取一挑取一DH5DH5單菌落于單菌落于2.5ml LB2.5ml LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中3737過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng) 2.2.取其中取其中500ul500ul菌液于一含菌液于一含50mlLB50mlLB培養(yǎng)液的錐形瓶培養(yǎng)液的錐形瓶中，中，3737振搖培養(yǎng)至振搖培養(yǎng)至OD600OD600值達到值達到0.3-0.40.3-0.4之間之間 3. 3. 取取50ml50ml菌液置于離心

5、管內，菌液置于離心管內，4 4500g4 4500g離心離心5 5分鐘分鐘4. 4. 加入加入30ml ,100mM30ml ,100mM的冰冷的冰冷CaClCaCl2 2溶液，搖蕩重懸細胞，冰溶液，搖蕩重懸細胞，冰浴浴3030分鐘分鐘5. 4 4500g5. 4 4500g離心離心5 5分鐘收集細胞后，加分鐘收集細胞后，加2 ml ,100mM2 ml ,100mM的冰的冰冷冷CaClCaCl2 2溶液輕輕懸浮細胞溶液輕輕懸浮細胞, ,冰上放置幾分鐘冰上放置幾分鐘, ,即成感受即成感受態(tài)細胞懸液。態(tài)細胞懸液。 6.6.感受態(tài)細胞分裝成感受態(tài)細胞分裝成100l100l的小份的小份, ,暫且不用

6、的貯存于暫且不用的貯存于- -7070可保存半年?？杀４姘肽辍?取其中一份進行轉化。取其中一份進行轉化。7. 7. 向轉化管中加入向轉化管中加入DNADNA（不超過（不超過10ul10ul）, ,輕度搖晃混合后輕度搖晃混合后于冰上放置于冰上放置3030分鐘。分鐘。8. 8. 將上述混合物轉移到預熱到將上述混合物轉移到預熱到4242的水浴鍋中，熱休克的水浴鍋中，熱休克9090秒秒 ( (不要搖動試管不要搖動試管) )，然后將試管迅速轉移到冰浴，冷，然后將試管迅速轉移到冰浴，冷卻卻1 12 2分鐘。分鐘。9. 9. 向管內加入向管內加入800ul800ul的的LBLB培養(yǎng)液培養(yǎng)液。然后。然后37

7、37 培養(yǎng)培養(yǎng)4545分鐘。分鐘。生長培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基10. 10. 取適量體積的轉化細胞轉移到取適量體積的轉化細胞轉移到含有適當抗生素的含有適當抗生素的LBLB固固體平板體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置幾分上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置幾分鐘鐘選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基11. 11. 倒置平板于倒置平板于37 37 培養(yǎng)培養(yǎng)12121616個小時。個小時。實驗流程實驗流程感受態(tài)細菌感受態(tài)細菌 100ulul連接產物連接產物 10ulul冰浴中冰浴中30混勻混勻420C水浴水浴 90冰浴冰浴1-2 加入加入500 l LB培養(yǎng)液培養(yǎng)液 370C振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)45 涂板涂板培養(yǎng)過

8、夜培養(yǎng)過夜實驗注意事項實驗注意事項為了提高轉化效率為了提高轉化效率, , 實驗中要考慮以下幾個重要因素：實驗中要考慮以下幾個重要因素： 1. 1. 細胞生長狀態(tài)和密度細胞生長狀態(tài)和密度: : 細胞生長密度以剛進入細胞生長密度以剛進入時時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 OD600 來控制。來控制。2. 2. 質粒的質量和濃度質粒的質量和濃度: : 用于轉化的質粒用于轉化的質粒DNADNA應主要是應主要是。一般情。一般情況下況下,DNA,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的。 3. 3. 試劑的質量試劑的質量: : 所用的試劑所用的試劑, ,如如CaCl2 CaCl2 等均需是最等均需是最的的(GR.(GR.或或AR.),AR.),并用超純水并用超純水配制配制, ,最好分裝保存于干燥的最好分裝保存于干燥的。4. 4. 防止雜菌和雜防止雜菌和雜DNADNA的污染：整個操作過程均應在的污染：整個操作過程均應在下進行。下進行。 lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解乳糖乳糖iPO調控蛋白調控蛋白P大腸桿菌的大腸桿菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因