雙水相萃取技術(shù)研究現(xiàn)狀與應(yīng)用

1、雙水相萃取技術(shù)研究現(xiàn)狀與應(yīng)用張瓊瓊天津科技大學(xué)摘要：雙水相萃取技術(shù)是一種新型的高效溫和的用于提取、分離、純化的技術(shù)，目前的研究證明雙水相萃取已經(jīng)應(yīng)用于生物分子分離、污水處理、貴金屬分離、生物合成、檢測等方面，而且由于其本身的易于擴(kuò)大，成本低、快速、高效等優(yōu)勢，應(yīng)用前景會更加廣闊。關(guān)鍵詞：雙水相萃?。惶崛?；分離；純化 隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞培養(yǎng)工程、代謝工程等高新生物技術(shù)研究工作的廣泛展開，各種生化新產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，但由于大部分的生物產(chǎn)品原液是具有低濃度和生物活性的，對分離條件以及環(huán)境要求及其苛刻，使得傳統(tǒng)的液液萃取已不能適應(yīng)分離要求，因此一種新型的液液分離技術(shù)-雙水相萃取技術(shù)應(yīng)運而生。雙

2、水相萃取技術(shù)是利用組分在兩水相間分配的差異而進(jìn)行組分的分離提純的技術(shù)。由于雙水相萃取分離過程條件溫和、可調(diào)節(jié)因素多、易于放大和操作，并可借助傳統(tǒng)溶劑萃取的相關(guān)理論和經(jīng)驗，不存在有機(jī)溶劑殘留問題，特別適用于生物物質(zhì)的分離和提純。目前，雙水相萃取技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工和食品工業(yè)等領(lǐng)域，被認(rèn)為是生物下游工程中具有廣闊前景的分離技術(shù)。 目前國內(nèi)外對雙水相萃取技術(shù)的研究主要集中在：(1)雙水相體系成相機(jī)理及熱力學(xué)模型的探索。由于雙水相體系自身的復(fù)雜性，目前還沒有一套完整的理論來解釋雙水相體系，近年來對雙水相液液相平衡的熱力學(xué)模型的研究非常活躍；(2)新型、高效、廉價的雙水相體系

3、的開發(fā)。如用低分子有機(jī)物與無機(jī)鹽所形成的雙水相體系來分離提取中草藥。這種雙水相體系的引人，可以大大節(jié)約能耗，降低成本，簡化操作流程，提高產(chǎn)品收率，為大規(guī)模工業(yè)化的實現(xiàn)提供了可能；(3)雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，利用其它相關(guān)技術(shù)對雙水相萃取過程優(yōu)化。如雙水相技術(shù)與相關(guān)技術(shù)的集成問題，就充分地利用了雙水相體系的技術(shù)和條件優(yōu)勢，為分離科學(xué)提供了新思維；(4)雙水相萃取技術(shù)中體系的放大以及新工藝流程的開發(fā)等1。1 雙水相萃取技術(shù)1.1 雙水相體系的形成早在1896年，Beijerjnck2觀察到，明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液混合時，得到一種不透明的混合溶液，靜置后可分為兩相，上相中含有大部分的

4、明膠，下相中含有大部分瓊脂（或淀粉），這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相容性，從而產(chǎn)生了雙水相。例如將2.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的葡聚糖水溶液與0.72%的甲基纖維素的水溶液等體積混合靜置后，可以得到兩個液層，下層含有71.8%的葡聚糖，上層含有90.3%的甲基纖維素，兩相的主要成分都是水。1.2 雙水相體系類型在雙水相體系中，常見的水溶性高聚物有：聚乙二醇（PEG）、聚丙二醇、甲基纖維素、聚丙烯乙二醇、吐溫、聚氧乙烯類表面活性劑等；聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/無機(jī)鹽是常用的雙水相體系，由于葡聚糖價格昂貴，聚乙二醇/無機(jī)鹽體系應(yīng)用更為廣泛，現(xiàn)把幾種常見的雙水相體系列于表1。表1 常見的雙水相系統(tǒng)類型上相的組

5、分下相的組分非離子型聚合物/非離子型聚合物聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖，聚蔗糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖甲基纖維素葡聚糖，羥丙基葡聚糖非離子型聚合物/無機(jī)鹽聚丙二醇硫酸鉀聚乙二醇硫酸鎂，硫酸鉀，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸甲鈉 高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)硫酸葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽非離子型聚合物/低分子量組分葡聚糖丙醇聚丙烯乙二醇磷酸鉀，葡萄糖甲氧基乙二醇磷酸鉀1.3 雙水相萃取的基本原理3 雙水相萃取與一般的水有機(jī)物萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當(dāng)萃取體系的性

6、質(zhì)不同，物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于分子問的范德華力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷的作用，且標(biāo)物質(zhì)在上、下相中的濃度不同，從而達(dá)到分離的目的。溶質(zhì)(包括蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)、稀有金屬以及貴金屬的絡(luò)合物、中草藥成分等)在雙水相體系中服從Nernst分配定律：K=Ci/Cb，其中Ci、Cb分別代表溶質(zhì)在上相、下相中的濃度。 系統(tǒng)固定時，分配系數(shù)為一常數(shù)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)人雙水相體系后，在上相和下相同進(jìn)行選擇性分配，這種分配關(guān)系與常規(guī)的萃取分配關(guān)系相比表現(xiàn)出更大或更小的分配系數(shù)。如各種類型的細(xì)胞粒子、噬菌體的分配系數(shù)都大于100或者小于0.01，因此為物質(zhì)分離提供了可能。1.

7、4 影響物質(zhì)分配平衡的因素影響物質(zhì)在雙水相體系中分配的因素有很多，其中主要包括體系有機(jī)相組成(如有機(jī)物的類型、平均分子量等)、鹽類(包括離子類型和濃度、電荷數(shù)、電解質(zhì)強(qiáng)度、酸堿性等)、相比R(上下相的體積比)、溶質(zhì)即目標(biāo)物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)(包括分子量，等電點)，以及體系的溫度、壓力等。而這些參數(shù)并不是獨立起作用的，所以要預(yù)測雙水相體系間的分配系數(shù)是相當(dāng)困難的。目前最常用的方法是用試驗的方法來確定滿足分配要求的操作條件。1.5 雙水相萃取的特點4（1） 整個體系的含水量高（70%-90%），萃取是在接近生物物質(zhì)生理環(huán)境條件下進(jìn)行，故而不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；（2） 單級分離提純效率高。通

8、過選擇適當(dāng)?shù)碾p水相系統(tǒng)，一般可獲得較大的分配系數(shù)，也可調(diào)節(jié)被分離組分在兩相中的分配系數(shù)，使目標(biāo)產(chǎn)物有較高的效率；（3） 傳質(zhì)速率快，分相時間短。雙水相系統(tǒng)中兩相的含水量一般都在80%左右，界面張力遠(yuǎn)低于水-有機(jī)溶劑兩相體系，故傳質(zhì)過程和平衡過程快速；（4） 操作條件溫和，所需設(shè)備簡單。整個操作過程在室溫下進(jìn)行，相分離過程非常溫和，分相時間短。大量雜質(zhì)能與所有固體物質(zhì)一起去掉，大大簡化分離操作過程；（5） 過程易于放大和進(jìn)行連續(xù)化操作。雙水相萃取易于放大，各種參數(shù)可以按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低，易于與后續(xù)提純工序直接相連接，無需進(jìn)行特殊處理，這對于工業(yè)生產(chǎn)來說尤其有利；（6） 不存在有機(jī)溶劑殘

9、留問題，高聚物一般是不揮發(fā)性物質(zhì)，因而操作環(huán)境對人體無害；（7） 雙水相萃取處理容量大，能耗低。主要成本消耗在聚合物的使用上，而聚合物可以循環(huán)使用，因此生產(chǎn)成本較低。2 雙水相萃取技術(shù)進(jìn)展2.1 廉價雙水相體系5的開發(fā) 高聚物一高聚物(PEGDextran系列)體系為常用的雙水相體系，但該體系的成相聚合物價格昂貴，在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)時，從經(jīng)濟(jì)上喪失了該體系技術(shù)上的優(yōu)勢，因而尋找廉價的有機(jī)物雙水相體系是雙水相體系的一個重要的發(fā)展方向。廉價雙水相體系的開發(fā)目前主要集中在尋找一些廉價的高聚物取代現(xiàn)用昂貴的高聚物。用變性淀粉(PPI')、乙基羥乙基纖維素(EHEC)、糊精、麥芽糖糊精等有機(jī)物代

10、替昂貴的葡聚糖(Dextran)，羥基纖維素、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等代替聚乙二醇(PEC)已取得了階段性的成果。研究發(fā)現(xiàn)由這些聚合物形成的雙水相體系的相圖與PEGDextran形成的雙水相體系相圖非常相似，其穩(wěn)定性也比PEGDextran雙水相體系好，并且具有蛋白質(zhì)溶解度大、黏度小等優(yōu)點。2.2 新的雙水相系統(tǒng)6 新型功能雙水相系統(tǒng)是指系統(tǒng)中采用的聚合物易于回收或操作簡便的雙水相體系。此處就溫度敏感型雙水相體系、表面活性劑雙水相體系、親和功能雙水相體系做一簡單介紹。2.2.1 溫度敏感型雙水相體系 因為溫度敏感型聚合物分子含有的親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)， 可與水分子形成氫鍵，

11、 溫度變化誘導(dǎo)可改變氫鍵強(qiáng)弱導(dǎo)致聚合物在溶液相中的溶解度發(fā)生變化。溫度敏感型雙水相體系就是根據(jù)以上原理，在相分離過程中無需進(jìn)行萃取后目標(biāo)物與聚合物的分離和聚合物回收再利用， 只需通過溫度變化誘導(dǎo)，就可使聚合物從溶液相分離出來。表面活性劑類聚合物及其改性聚合物是目前應(yīng)用較多的溫度敏感型聚合物， 包括隨機(jī)共聚物EOPO（環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的隨機(jī)共聚物）、嵌段共聚物EOPOEO 系列、吐溫（Tween） 和曲拉通（Triton） 等非離子表面活性劑、陰陽離子表面活性劑等。構(gòu)成的常用雙水相體系如EOPO/Dex/H2O體系、EOPO/ 鹽/H2O 體系、EOPOEO/磷酸鹽/H2O 體系、Triton

12、/H2O 體系等。 常用的水溶性溫敏聚合物是隨機(jī)共聚物EOPO，其中EO（環(huán)氧乙烷） 是親水基團(tuán)， PO（環(huán)氧丙烷）是疏水基團(tuán)。當(dāng)溫度高于臨界點（即濁點） 時，EOPO 聚合物水溶液分成上、下兩相， 上相近乎純水， 下相富含聚合物（通常含EOPO 40%60%）。從而使被萃取物得到分離和純化， 并能實現(xiàn)EOPO 的回收和利用。2.2.2 表面活性劑雙水相體系 表面活性劑雙水相體系是指采用表面活性劑為聚合物材料的雙水相體系。在一定濃度和混合比范圍內(nèi)、無任何外加物質(zhì)的條件下， 將陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉和陽離子表面活性劑溴化十二烷基三乙銨進(jìn)行混合， 可以形成兩個互不混溶、平衡共存的水相，兩相

13、均為很稀的表面活性劑水溶液（其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%以下）。該雙水相體系操作成本低、萃取效果好，還能保證活性被萃取物質(zhì)不失活。此外，當(dāng)溫度高于一定值時，非離子表面活性劑Triton/Tween 等和其他聚合物或水可以形成雙水相體系，上相富含表面活性劑，下相為富水相或富聚合物相。應(yīng)用該體系可以分離具有一定疏水性的水溶性蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度高于臨界點（濁點）時，包含蛋白質(zhì)的表面活性劑就會從水相中分離出來，從而萃取出目標(biāo)蛋白。與其他的雙水相體系相比，在表面活性劑的濃度很低（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%左右）時就會產(chǎn)生相分離，而且不需要有機(jī)溶劑。4.2.3 親和功能雙水相體系 由于雜蛋白的存在，萃取目標(biāo)蛋白存在萃取專一性不

14、高的問題。為了解決此問題，近年來借鑒親和色譜的特點，發(fā)展了一種親和雙水相萃取技術(shù)。親和雙水相萃取技術(shù)是指在兩種成相聚合物混合形成雙水相體系前，將一種和目標(biāo)蛋白有很強(qiáng)親和力的配基（如離子交換基團(tuán)、疏水基團(tuán)、染料配基、金屬螯合物配基以及生物親和配基）與其中一種成相聚合物共價結(jié)合，這樣在雙水相體系進(jìn)行萃取目標(biāo)蛋白時，目標(biāo)蛋白質(zhì)就會專一性地進(jìn)入結(jié)合有配基的成相聚合物所在相中，而其他雜蛋白則進(jìn)入另一相。親和雙水相不僅具有萃取系統(tǒng)處理量大、放大簡單等優(yōu)點，而且具有親和吸附專一性，分離效率高的特點。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于乙醇脫氫酶、丙酮酸激酶和核酸內(nèi)切酶等酶以及細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等粒子的提取中。3 雙

15、水相萃取的應(yīng)用3.1 生物工程技術(shù)中物質(zhì)的提取與純化雙水相萃取技術(shù)最先應(yīng)用的領(lǐng)域是生物產(chǎn)品的分離，目前，雙水相萃取技術(shù)已應(yīng)用于蛋白質(zhì)、生物酶、菌體、細(xì)胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子物質(zhì)的分離、純化。朱自強(qiáng)等用PEG 2000 8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、(NH4)2SO2 20(質(zhì)量分?jǐn)?shù))在pH=5.0，20時直接處理青霉素G發(fā)酵液，得出分配系數(shù)K=58.39，濃縮倍數(shù)為3.53，回收率為9367，青霉素G對糖的分離因子和對雜蛋白的分離因子分別為13.36和21.9。在此基礎(chǔ)上，再安排了青霉素G的實驗小試流程，得到了青霉素G的結(jié)晶，純度為88.48，總收率達(dá)76.567。3.2 在醫(yī)藥行業(yè)8的應(yīng)用 雙

16、水相體系不僅可以用于分離醫(yī)藥行業(yè)需要的細(xì)胞，還可以用來高效的提取抗生素?？股夭粌H能殺滅細(xì)菌，而且對支原體、衣原體等致病微生物也具有良好的抑制及殺滅效果。所以雙水相萃取技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)得到廣泛認(rèn)可。Sousa等人利用免疫親和性PEGDextran雙水相體系從臍帶血中分離造血干細(xì)胞源細(xì)胞，針對造血干細(xì)胞CD34面抗原的單克隆抗體用于直接分離臍帶血中的造血干細(xì)胞到PEG相中，干細(xì)胞的回收率達(dá)到95%，純化因子達(dá)到245。3.3 在廢水處理方面的應(yīng)用 工廠排放的廢水中往往既含有大量的對環(huán)境污染性極大的物質(zhì)，如酚類物質(zhì)及一些鎘等金屬污染物，也含有一些可以回收循環(huán)利用的物質(zhì)，所以對廢水的處理意義重大，亟需

17、一種快速高效的方法來解決這些問題。近年來，很多研究者開始利用雙水相進(jìn)行廢水處理。 曹文等將丙醇硫酸銨雙水相體系應(yīng)用于焦化廠廢水中酚類物質(zhì)的萃取分離。對于50.0 mL含酚廢水，最佳硫酸銨用量為18.0 g、正丙醇用量為30mL9。張星剛等采用聚乙二醇無水硫酸鈉雙水相體系萃取光度法測定鋅，結(jié)果表明，當(dāng)PEG2000溶液用量為4.5 mL、緩沖溶液pH值為7.4時，萃取率最高。還通過研究二苯碳酰二肼(DPC)一鉻(VI)配合物在PEG2000Na2SO4雙水相體系中的顯色和萃取分離條件，建立了集萃取分離和Cr6+測定于一身的雙水相萃取光度分析方法。結(jié)果表明，PEG2000溶液用量為4.0-6.0

18、mL、Na2S04用量為1.2 g、DPC用量為0.5mL時，效果最佳9。 3.4 在藥物分析10中的應(yīng)用 雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的萃取技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于藥物分析中。 梁華正等研究有機(jī)溶劑磷酸氫二鉀雙水相體系對梔子黃廢液中梔子苷的萃取條件，并將萃取后的梔子苷用于梔子藍(lán)色素的生產(chǎn)。根據(jù)分相后上下相中梔子苷的分配系數(shù)及兩相體積比，選擇合適的雙水相體系，并改變?nèi)軇┡c廢液的體積比、磷酸氫二鉀加入量、廢液pH值以及萃取溫度等參數(shù)，研究萃取梔子苷的最佳條件。實驗結(jié)果表明，乙醇磷酸氫二鉀為合適的萃取體系。當(dāng)雙水體系總量為l0mI。時，乙醇與梔子黃廢液的體積比為6:4，磷酸氫二鉀1.0g，體系分相完全后

19、梔子苷分配系數(shù)(K)為4.56，兩相體積比(R)為6.38，梔子黃廢液pH值及萃取溫度在正常條件下對K值及R值影響不大。放大實驗表明，以乙醇磷酸氫二鉀體系萃取梔子黃廢液中的梔子苷，所得梔子苷純度可達(dá)62.12，收率可達(dá)96.32。萃取后的梔子苷經(jīng)肛葡萄糖苷酶水解精氨酸顯色后得到梔子藍(lán)色素，色價Ei盔(590nm)65.92。高云濤等利用超聲提取集成丙醇一硫酸銨雙水相體系對苦蕎麥苗中總黃酮進(jìn)行提取分離，研究丙醇一硫酸銨雙水相的形成和提取條件對總黃酮得率的影響。結(jié)果表明，提取率為1.86，提取物中總黃酮含量為19.3，明顯高于回流提取法。提取物對脂質(zhì)過氧化具有良好的抑制作用，最大抑制率為68.2，

20、方法操作簡便、條件溫和，環(huán)境友好。3.5 在貴金屬分離方面的應(yīng)用 貴金屬的分離提取及純化技術(shù)主要有火法和濕法兩類，但是這兩種方法的成本高、收率低，所以用經(jīng)濟(jì)有效、環(huán)境友好的方法提取貴金屬是大家共同追求的目標(biāo)，雙水相以其獨特的優(yōu)勢逐漸被使用在貴金屬提取純化方面。高云濤用1-propanol/鹽雙水相體系和鹽誘導(dǎo)浮選分離法實現(xiàn)了鉑、鈀、鍺、銥、金、鋨、等貴金屬元素的分離，改變了傳統(tǒng)較難分離惰性貴金屬銠、銥等的情況，并且此種方法易于擴(kuò)大化。張磊用氧化酸浸泡除去處理成70-200目的廢棄電子印刷線路板中的其它金屬后，用王水溶解剩余含金固體， 在PEG2000 質(zhì)量濃度15%、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度

21、20%、溫度25、pH=1的條件下，金的3次萃取率超過了97%8。3.6雙水相萃取與其它技術(shù)結(jié)合應(yīng)用 雙水相萃取技術(shù)有其獨有的優(yōu)點， 如能與其它技術(shù)結(jié)合應(yīng)用， 萃取分離效果更佳。雙水相萃取技術(shù)與超聲波、微波、殼聚糖沉淀相結(jié)合應(yīng)用的研究已經(jīng)比較成熟， 其中與超聲波分離技術(shù)結(jié)合應(yīng)用得最多。滕毅等研究超聲波耦合乙醇磷酸氫二鉀雙水相萃取技術(shù)用于提取密蒙花黃色素， 通過正交實驗考察了乙醇濃度、超聲時間、超聲波功率對提取率的影響。結(jié)果表明， 影響密蒙黃提取率的因素顯著性順序為乙醇濃度超聲波功率超聲時間， 最佳提取條件為： 乙醇濃度50%、超聲提取時間20min、超聲波功率500W； 在此工藝條件下， 密蒙黃的萃取率達(dá)到27.1111。4 結(jié)論與展望 雙水相萃取技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的分離技術(shù)，所需設(shè)備簡單、條件溫和、易于操作，且可以獲得較高的收率和較純的有效成分，與常規(guī)的有機(jī)溶劑萃取技術(shù)相比較，最大的優(yōu)勢在于可保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象，因此在生物技術(shù)、藥物分析提取、金屬分離等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。但是體系自身也存在的一定的缺陷，如雙聚合物體系價格較高，限制了其在工業(yè)中大規(guī)模的應(yīng)用；體系的易乳化問題，