DNA雜交作為信號開關(guān)的分子識別及應(yīng)用實例

1、DNA雜交作為信號開關(guān)的分子識別和應(yīng)用【摘要】DNA雜交作為信號開關(guān)的分子識別檢測是發(fā)展成熟，應(yīng)用廣泛的分析策略之一。本篇課程報告列舉了已經(jīng)使用的五種模式，并一一以實例介紹和探討，最后對其特點和發(fā)展方向進(jìn)行了總結(jié)和討論?！娟P(guān)鍵詞】DNA 雜交 信號開關(guān) 識別 檢測圖1.堿基互補配對脫氧核糖核酸（DNA）承載了真核生物絕大多數(shù)的遺傳信息任務(wù)，其精妙的螺旋分子結(jié)構(gòu)，嚴(yán)格的堿基配對互補（即腺嘌呤A與胸腺嘧啶T以兩個氫鍵配對，鳥嘌呤G與胞嘧啶以三個氫鍵配對，見圖1)讓人為之嘆服，也吸引著、生命科學(xué)、化學(xué)、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域研究者的目光。在分析化學(xué)方面，DNA一方面扮演著重要的被檢測物角色，一方面在構(gòu)建完整

2、信號響應(yīng)過程中起到了巨大作用，而利用DNA雜交作為信號開關(guān)的分子識別就是其中發(fā)展最為成熟，應(yīng)用最為廣泛，模式最為多樣的一種策略。分子識別是特異性過程，利用被檢測物對DNA雜交狀態(tài)的特異性改變，以及DNA雜交本身具有特異性的特點，就可以實現(xiàn)識別。識別最終要轉(zhuǎn)化為檢測，此時就體現(xiàn)了DNA雜交的信號開關(guān)作用，即在其雜交狀態(tài)被改變后，可以觸發(fā)與被檢物相關(guān)聯(lián)的信號變化，變化的信號被監(jiān)測、記錄和分析，就可得到被測物的信息。要說明的是，這里的信號開關(guān)概念不是單純的信號有無，也可以指信號強弱的迅速改變；利用信號開關(guān)模式的檢測也不僅是對被檢物有無的定性，也可以實現(xiàn)一定范圍的定量。DNA雜交作為信號開關(guān)的模式可以

3、總結(jié)為：（1）雜交引入信號，或雜交或逆過程本身引發(fā)信號的改變；（2）通過雜交，釋放信號分子；（3）DNA雜交輔助聚合；（4）有關(guān)空間距離控制的信號開關(guān)；（5）雙鏈DNA反應(yīng)。這些模式在實際應(yīng)用中也互有交錯。1、 雜交引入或引發(fā)信號圖2.染料標(biāo)記目標(biāo)DNA引入光電信號的光電傳感器利用帶標(biāo)記的DNA互補鏈與體系中單鏈DNA（ssDNA）雜交，從而將信號分子引入體系，是最簡單的使信號從無（關(guān)）到有（開）的方式，被標(biāo)記的ssDNA可以是探針，也可以是目標(biāo)鏈，檢測物可以是DNA，也可以是與DNA連接的其它被測物；而相應(yīng)的，若體系中ssDNA是帶有標(biāo)記的，信號為開，利用帶有猝滅劑的互補鏈DNA雜交猝滅原有

4、信號也是一種簡單實用的方法。這種通過標(biāo)記與雜交的方式實現(xiàn)分子識別及其后的檢測早已在傳統(tǒng)DNA芯片中得到廣泛應(yīng)用1，在其它方面也是重要的識別和檢測策略。Tokadome等設(shè)計了一種檢測DNA的光電傳感器（見圖2）。以羅丹明B或Alexa Fluor 647兩種染料為光敏劑，標(biāo)記目標(biāo)DNA單鏈，目標(biāo)DNA與連接在TiO2表面的探針DNA雜交后，在特定光照下誘發(fā)光電流，實現(xiàn)檢測；光電流大小可以與目標(biāo)DNA濃度相聯(lián)系，從而為實現(xiàn)定量檢測提供了可能2。Shurong Tang等則利用DNA雜交引入CdS量子點（CdS QDs)，使得Pb2+的濃度與CdS的方波溶出伏安信號相關(guān)聯(lián)，達(dá)到定量檢測的目的（見圖

5、3）3。信號響應(yīng)過程不僅涉及CdS QDs標(biāo)記的DNA與互補鏈的雜交，也涉及Pb2+激活DNA酶，催化DNA斷裂解旋的過程，設(shè)計非常巧妙。同時，在這個實驗中作者采用滾環(huán)擴(kuò)增制造大量與CdS QDs標(biāo)記的短鏈DNA互補的序列，使得每個Pb2+對應(yīng)多個CdS QDs，從而解決了雜交引入信號源時信號放大的難題。圖3.利用滾環(huán)擴(kuò)增和CdS QDs標(biāo)記的DNA實現(xiàn)Pb2+檢測與信號放大以上皆為標(biāo)記的方法，而帶標(biāo)記的分子識別與檢測過程存在諸多問題，例如用作標(biāo)記的基團(tuán)存在毒性，標(biāo)記物易脫落，標(biāo)記過程耗時長等，因此免標(biāo)記技術(shù)成為了重要的發(fā)展方向。DNA雜交及解旋本身存在著質(zhì)量、形態(tài)、電化學(xué)性質(zhì)等變化，所以理論

6、上任何可以檢測相關(guān)信號的手段都可以使用，如電化學(xué)阻抗譜（EIS）45，表面共振6等。Hui Boon Teh等用石英晶體微天平（QCM）的方法檢測Pb2+激活DNA酶，催化DNA斷裂解旋后的質(zhì)量減小。因為Pb2+對DNA酶的激活是特異性的，由于被剪切鏈DNA序列的特殊設(shè)計，酶對DNA的催化斷裂位點也是特異性的，所以這個方法完成了對Pb2+的特異性識別和檢測7。2、 通過雜交，釋放信號分子圖4. DNA熒光開關(guān)這是最能體現(xiàn)DNA開關(guān)作用的一種模式?；驹硎强捎脝捂淒NA作為封堵劑，在與互補序列結(jié)合后脫離(通常是本身折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)），原先被封裝的信號分子，例如熒光染料等得以釋放，產(chǎn)生信號。圖4

7、為錢若燦等設(shè)計的一種應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)端粒酶檢測的探針。首先，熒光猝滅劑被固定于硅球孔道內(nèi)壁，灌注的熒光素?zé)晒獗烩?，呈off狀態(tài)。用于封堵硅球的ssDNA O1由重復(fù)的CCCTAA序列和端粒酶引物序列構(gòu)成，在癌細(xì)胞內(nèi)，高度表達(dá)的端粒酶將O1末端延長出TTAGGG的序列，與CCCTAA互補，形成剛性發(fā)卡結(jié)構(gòu)，O1從硅球上脫落，釋放熒光素分子，脫離了猝滅劑后熒光顯現(xiàn)，呈on狀態(tài)8。O1在分析過程中一方面起到開關(guān)作用，一方面也實現(xiàn)了端粒酶特異性識別。3、 DNA雜交輔助聚集這是一種利用DNA雜交過程將納米粒子聚集的策略，納米粒子的聚集直接引發(fā)相關(guān)被檢信號的形成或變化。Ximei Qian等設(shè)計了表面修

8、飾特定ssDNA的金納米粒子（Au NPs），加入互補鏈后，Au NPs聚合，若通過DNA鏈長控制間距在10-20nm，拉曼光譜有明顯增強效應(yīng)，信號由弱轉(zhuǎn)強。通過溫度控制DNA雜交與解旋，還可實現(xiàn)on與off的轉(zhuǎn)換9。Dong-Kwon Lim等采用DNA和Ag層厚度兩個控制手段，將信號開關(guān)過程分為DNA輔助聚集和Ag層生長兩步，制備了識別和檢測DNA的拉曼標(biāo)簽10。圖5. DNA的堿基距離DNA雜交輔助聚集的重要應(yīng)用是在活細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)檢測方面。通常體積小的探針更容易進(jìn)細(xì)胞，因而利用DNA雜交輔助聚集，先將小的納米粒子導(dǎo)入細(xì)胞，此時無信號或弱信號，再導(dǎo)入互補鏈DNA或利用胞內(nèi)核酸使納米粒子聚集，

9、信號開，類似思路已在基于疏水作用的胞內(nèi)自組裝上得以體現(xiàn)11。另外，這種策略中可以同時使用DNA實現(xiàn)分子識別過程，識別物可以是引發(fā)聚集的DNA，也可以是能與雙鏈DNA連接的物質(zhì)。后者可以使用表面增強拉曼光譜檢測，通過DNA鏈長的距離控制實現(xiàn)被檢物因聚合恰好處于增強區(qū)域。4、 有關(guān)空間距離控制的信號開關(guān)圖6.內(nèi)部鏈取代打開缺口的分子信標(biāo)點亮胞內(nèi)端粒酶DNA嚴(yán)格具有每十個堿基構(gòu)成一個3.4nm完整螺旋的特點（見圖5），這一特點為構(gòu)建空間距離控制的信號開關(guān)提供了可能。具有空間相關(guān)的效應(yīng)除了已經(jīng)舉例的表面拉曼增強作用外，還有能量轉(zhuǎn)移（ET）過程，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），激子-等離子體激元相互作

10、用（EPI）等，這些都已有應(yīng)用實例。FRET是當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離接近時，發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，使得供體的熒光猝滅的作用。錢若燦將Cy5標(biāo)記于長鏈DNA的5端，3端用巰基和Au的反應(yīng)連接于Au NP，Au NP猝滅Cy5熒光，信號為off狀態(tài)；當(dāng)端粒酶延長短鏈（TSP），發(fā)生內(nèi)部鏈取代，Cy5離開Au表面，熒光狀態(tài)轉(zhuǎn)為on（見圖6）12。EPI與FRET有一定相似性。以CdS QDs和Ag NPs光電體系為例，光激發(fā)CdS QDs伴隨的發(fā)光過程，同時激發(fā)Ag NPs產(chǎn)生表面等離子體激元(SPR)，伴隨著粒子間的能量轉(zhuǎn)移(ET)過程，Cd

11、S QDs的圖7.CdS QDs和Ag NPs體系的EPI過程光生電流強度將產(chǎn)生一定程度的降低，即所謂“猝滅”，亦為信號的關(guān)13。在光電體系中，例如EPI等利用DNA控制距離是一種實用易行，有十分有效的策略，光電活性物質(zhì)，包括具有光電活性的DNA與電極基體的距離的控制都是較為常見的手段1415，在DNA、蛋白質(zhì)、有機小分子、離子等識別與檢測方面有重大價值。5、 雙鏈DNA反應(yīng)形成雙鏈DNA（dsDNA）后，相比ssDNA具有不同反應(yīng)，如特殊位點可被限制性核酸內(nèi)切酶識別并剪切等。根據(jù)這種反應(yīng)的不同，可對只與dsDNA或ssDNA的物質(zhì)進(jìn)行檢測，也可以用這些物質(zhì)構(gòu)建DNA識別檢測的傳感器。DNA本

12、身一般不具有光電活性，也不能傳導(dǎo)電荷，但是摻雜氧化還原性物質(zhì)可以提高其電荷傳導(dǎo)性能，從而完成光電轉(zhuǎn)換過程。Ru(bpy)2dppz2+是一種很好的摻雜劑，但是只能插入到dsDNA中，根據(jù)這一性質(zhì)，Xiaoru Zhang等設(shè)計了一種DNA光電傳感器，見圖816。圖8.Ru(bpy)2dppz2+摻雜的DNA光電傳感器同樣采用光電檢測手段，根據(jù)某種酶對dsDNA具有彎折效應(yīng)，并利用已經(jīng)提及的EPI過程，可以構(gòu)建此酶或DNA的傳感器。具體實驗還在進(jìn)行中。總的來說，DNA雜交作為信號開關(guān)的分子識別具有特異性、靈敏性和多樣性的特點。其特異性主要由被檢測物對DNA雜交狀態(tài)的特異性改變，DNA雜交本身的特

13、異性來實現(xiàn)；其多樣性則體現(xiàn)在可檢測信號的多樣性（帶來檢測手段多樣性），被檢測物質(zhì)的多樣性，實現(xiàn)檢測的原理、策略的多樣性等。雖然DNA雜交作為信號開關(guān)已經(jīng)被廣泛使用，但是仍具有很大的提升空間，包括新的檢測原理和方法的開發(fā)，相關(guān)新材料的發(fā)展等。這有賴于對基于DNA的分子識別過程的進(jìn)一步探索：結(jié)合納米技術(shù)、自組裝技術(shù)的發(fā)展，以及生命科學(xué)的進(jìn)展，在分子水平上推進(jìn)基礎(chǔ)理論研究，加深對分子識別過程的理解，發(fā)現(xiàn)新的識別反應(yīng)。另一方面，現(xiàn)有的實驗時間都普遍偏長，一個完整的識別、檢測、分析過程可能需要一天甚至更長的時間，而且檢測成本非常高，導(dǎo)致這些技術(shù)很難應(yīng)用于實際，所以除提高準(zhǔn)確性、靈敏度外，如何提升檢測速度

14、與自動化程度，降低成本應(yīng)該是一個必須要考慮的問題。此外，信號開關(guān)可以對應(yīng)0/1的二進(jìn)制編碼，故而我們可以設(shè)想這些DNA雜交作為信號開關(guān)的策略也可以引入到DNA計算機等領(lǐng)域，作為一種新的計算模式。但是這個過程雖涉及分子識別，但關(guān)聯(lián)性已經(jīng)不大，也尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)予以可行性佐證，所以不深入討論?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1、Heller R A, Schena M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 2150.2、Tokadome H., Yamada Y., et al. Appl. Phys. Lett., 2005, 87, 213901.3、Shur

15、ong Tang, Ping Tong, Heng Li, Jing Tang, Lan Zhang*. Biosens. Bioelectron., 2013, 12, 608.4、Zhenzhen Lin, Yue Chen, Xiaohong Li*, Weihai Fang. Analyst, 2011, 2367.5、Zhenzhen Lin, Xiaohong Li, Heinz-Bernhard Kraatz. Anal.Chem., 2011, 83, 6896.6、Watts H J, Yeung D, Parkes H. Anal.Chem.,1995, 67, 4283.

16、7、Hui Boon Teh, Haiyan Li, Sam Fong Yau Li. Analyst, 2014, 139, 5170.8、Ruocan Qian, Lin Ding*, Huangxian Ju*. J. Am. Chem.Soc., 2013, 135, 13282.9、Ximei Qian, Xi zhou, Shuming Nie*. J. Am. Chem. Soc. , 2008, 130, 14934.10、Dong-Kwon Lim, Ki-Seok Jeon, Hyung Min Kim, Jwa-Min Nam, Yung Doug Suh. Nat. M

17、ater., 2010, 9, 60.11、Deju Ye, Pandit P, et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1526.12、Ruocan Qian, Lin Ding, Liwen Yan, Manfei Lin, Huangxian Ju*. J. Am. Chem.Soc., 2014, 136, 8205.13、Wei-Wei Zhao, Pei-Pei Yu, Yun Shan, Jing Wang, Jing Juan Xu, Hong-Yuan Chen. Anal. Chem., 2012, 84.14、Eyal Golub, Gilad Pelossof