SDS-PAGE測定蛋白質相對分子質量

1、 SDSSDSPAGEPAGE測定蛋白質測定蛋白質 相對分子質量相對分子質量學習學習SDS-PAGESDS-PAGE測定蛋白質分子量的原理。測定蛋白質分子量的原理。 掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。運用運用SDS-PAGESDS-PAGE測定蛋白質分子量及染色鑒測定蛋白質分子量及染色鑒定。定。帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象現(xiàn)象。在一定的電場強度下，分子在凝膠介質中的遷移速率取決。在一定的電場強度下，分子在凝膠介質中的遷移速率取決于分子的大小、構型和帶電量的大小。于分子的大小、構型和帶電量的大小。 聚丙

2、烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（PAGPAG）是由）是由丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr(Acr) )和和甲叉甲叉雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺(Bis(Bis) )在在四甲基乙二胺四甲基乙二胺 TEMEDTEMED 和和過過硫酸銨硫酸銨(AP) (AP) 的作用下的作用下。以此以此凝膠作為支持介質的電泳稱為凝膠作為支持介質的電泳稱為。 具有電泳和分子篩的雙具有電泳和分子篩的雙重作用。重作用。 CH2=CHC=ONH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CHCH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2C

3、H2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )mPAGPAG機械強度好，有彈性，透明，化學性質穩(wěn)定，機械強度好，有彈性，透明，化學性質穩(wěn)定，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。緩沖液緩沖液pHpH值與凝膠中的相同值與凝膠中的相同. .帶電顆粒在電場帶電顆粒在電場作用下，主要作用下，主要。帶電帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。佳。SDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加

4、入是在蛋白質樣品中加入SDSSDS和含有巰基乙醇的和含有巰基乙醇的樣品處理液，樣品處理液，是一種很強的是一種很強的，它，它可以可以，破壞蛋白質分子的二，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。級和三級結構。可以可以破壞蛋白質的四級破壞蛋白質的四級 結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解 聚后的側鏈與聚后的側鏈與SDSSDS充分結合形成帶負電荷的充分結合形成帶負電荷的 蛋白質分子蛋白質分子陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超 過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所 帶凈

5、電荷的差異。帶凈電荷的差異。而與其所帶電荷的性質無關而與其所帶電荷的性質無關。將已知分子量的將已知分子量的在在 中的電泳遷中的電泳遷移率移率，即可得到一條標準曲線。，即可得到一條標準曲線。只要測得未知分子量的蛋白質在相同條件下的電泳只要測得未知分子量的蛋白質在相同條件下的電泳遷移率，就能根據標準曲線求得其分子量。遷移率，就能根據標準曲線求得其分子量。當蛋白質的分子量在當蛋白質的分子量在17,00017,000165,000165,000之間時，之間時， 的電泳遷移率與蛋白質分子量的對的電泳遷移率與蛋白質分子量的對數呈線性關系：數呈線性關系： 用海綿和洗滌劑輕柔地清洗，嚴禁使用刷子和顆粒狀的用海

6、綿和洗滌劑輕柔地清洗，嚴禁使用刷子和顆粒狀的去污粉與洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干。去污粉與洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干。 配制配制12%12%分離膠。在燒杯中依次加入分離膠。在燒杯中依次加入重蒸水重蒸水3.35ml,3.35ml,分離膠緩沖液分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl,pH8.81.5mol/L Tris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS 0.1ml,2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝膠儲備液凝膠儲備液4.0ml4.0ml，10% 10% 過硫酸銨過硫酸銨50ul50ul和和TEMED 10ulTEMED 10ul。由于。由于APAP和和TEMEDTEMED

7、相遇后凝膠相遇后凝膠即開始聚合，所以應立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長、即開始聚合，所以應立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長、短玻璃板間的窄縫內，留出梳齒的齒高加短玻璃板間的窄縫內，留出梳齒的齒高加1cm1cm的空間停止灌膠，小心的空間停止灌膠，小心覆蓋一層蒸餾水，覆蓋一層蒸餾水，3737烘箱下聚合（約烘箱下聚合（約30 min30 min）。待分離膠聚合完全）。待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的蒸餾水。后，除去覆蓋的蒸餾水。 配制配制5%5%濃縮膠。在燒杯中依次加入濃縮膠。在燒杯中依次加入重蒸水重蒸水2.92ml,2.92ml,濃縮膠濃縮膠緩沖液緩沖液(0.5mol/L Tris-

8、HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝膠儲備液凝膠儲備液0.8ml0.8ml，10% 10% 過硫酸銨過硫酸銨25ul25ul和和TEMED 10ulTEMED 10ul。由于。由于APAP和和TEMEDTEMED相遇后凝膠即開始聚合，所以應立即混勻混合液，用相遇后凝膠即開始聚合，所以應立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長、短玻璃板間的窄縫內，灌滿后小心移液槍抽取凝膠液加至長、短玻璃板間的窄縫內，灌滿后小心插入梳齒，避免混入氣泡，插入梳齒，避免混入氣泡，3737烘箱

9、下聚合（約烘箱下聚合（約30 min30 min）。）。 低分子量標準蛋白試劑盒低分子量標準蛋白試劑盒: :兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100MW=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 開封后，沸水浴中加熱開封后，沸水浴中加熱3-5min3-5min后上樣。后上樣。 用移液槍小心吸取處理好的血清用移液槍小心吸取處理好的血清50ul50ul至至1.5m

10、l1.5ml的離心管中，再加入的離心管中，再加入50ul50ul上樣緩沖液，混勻后上樣緩沖液，混勻后沸水浴中加熱沸水浴中加熱3min3min，取出冷卻后加樣。，取出冷卻后加樣。 將電泳儀的正負極與電泳槽正負極相連接，將電泳儀的正負極與電泳槽正負極相連接，打開電泳儀開關，設置電壓為打開電泳儀開關，設置電壓為200V200V，電泳電泳60mins,60mins,此時溴酚藍染料達到凝膠底部，停止電此時溴酚藍染料達到凝膠底部，停止電泳，關閉電源。泳，關閉電源。 用移液器分別取用移液器分別取5 l l樣品液，小心將樣品加樣品液，小心將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。到凝膠凹形樣品槽底部。 量出加樣端距細銅絲

11、間的距離量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)(cm)以及各蛋白質樣品以及各蛋白質樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)(cm)，按下式計算相對遷移率，按下式計算相對遷移率m mR R： 相對遷移率相對遷移率m mR R= =蛋白質樣品遷移距離蛋白質樣品遷移距離(cm)(cm)溴酚藍區(qū)帶距加樣端距離溴酚藍區(qū)帶距加樣端距離(cm)(cm)電泳結束后，取下玻板，在自來水下用特制板撬開電泳結束后，取下玻板，在自來水下用特制板撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。加入溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。加入染色液染色染色液染色60 mins60 mins，再用脫色液脫色，直至蛋白質區(qū)，再用脫色液脫色，直至蛋白質區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。帶清晰，即可計算相對遷移率。1、在上樣緩沖液中在上樣緩沖液中SDS