第八章發(fā)酵過程控制PPT課件

1、 本章內(nèi)容一、概述二、代謝調(diào)控在發(fā)酵過程控制中的應(yīng)用1. 初級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié) 2. 次級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)三、溫度對發(fā)酵的影響及其控制四、pH對發(fā)酵的影響及其控制五、溶解氧對發(fā)酵的影響及其控制六、CO2和呼吸商對發(fā)酵的影響及其控制七、基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及補料控制八、高密度發(fā)酵及過程控制九、泡沫對發(fā)酵的影響及其控制十、自動控制技術(shù)在發(fā)酵過程控制中的應(yīng)用第1頁/共138頁1. 過程控制的重要性 菌株特性(營養(yǎng)要求、生長速率、 呼吸強度、產(chǎn)物合成速率) 傳遞性能 物理：n、T、Ws 化學：pH、DO、濃度 過程控制的意義：最佳工藝條件的優(yōu)選（即最佳工藝參數(shù) 的確定）以及在發(fā)酵過程中通過過程調(diào)節(jié)達到

2、最適水平的 控制。決定發(fā)酵單位(水平)的因素外部環(huán)境因素工藝條件生物因素：生物因素：設(shè)備性能：設(shè)備性能：第2頁/共138頁2. 發(fā)酵過程控制的一般步驟 確定能反映過程變化的各種理化參數(shù)及其檢測方法 研究這些參數(shù)的變化對發(fā)酵生產(chǎn)水平的影響及其機制，獲取最適水平或最佳范圍 建立數(shù)學模型定量描述各參數(shù)之間隨時間變化的關(guān)系 通過計算機實施在線自動檢測和控制，驗證各種控制模型的可行性及其適用范圍，實現(xiàn)發(fā)酵過程最優(yōu)控制 第3頁/共138頁3. 參數(shù)檢測 代謝參數(shù)按性質(zhì)可分為三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、 pH

3、、產(chǎn)物濃度、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌體濃度、菌體比生長速率、呼吸強度、攝氧率、關(guān)鍵酶活力等第4頁/共138頁3. 參數(shù)檢測 參數(shù)按獲取方式可分為兩類： 如T、pH、罐壓、空氣流量、攪拌轉(zhuǎn)速、溶氧濃度等 如攝氧率()、呼吸強度(QO2)、比生長速率（) 、體積溶氧系數(shù)(KLa)、呼吸商(RQ)等。直接參數(shù)直接參數(shù)： 間接參數(shù)間接參數(shù)：將直接參數(shù)通過公式計算獲得的：將直接參數(shù)通過公式計算獲得的參數(shù)，參數(shù)，第5頁/共138頁3. 參數(shù)檢測 參數(shù)的測量形式離線測量：基質(zhì)（糖、脂類、無機鹽等）、前體和代謝產(chǎn)物（抗生素、酶、有機酸、氨基酸等）在線測量：如T 、pH、DO、溶解CO2、尾氣CO2、黏度

4、、攪拌轉(zhuǎn)速等 優(yōu)點：及時、省力，可從繁瑣操作中解脫出來，便于計算機控制。 困難：傳感器要求較高。 第6頁/共138頁v對傳感器的要求 能經(jīng)受高壓蒸汽滅菌； 傳感器及其二次儀表具有長期穩(wěn)定性； 最好能在過程中隨時校正，靈敏度好； 探頭材料不易老化，使用壽命長； 安裝使用和維修方便； 解決探頭敏感部位被物料（反應(yīng)液）粘住、堵塞 問題； 價格合理，便于推廣。 3. 參數(shù)檢測第7頁/共138頁3. 參數(shù)檢測v參數(shù)檢測方法溫度測量 感溫元件：熱電偶（溫度信號 電信號） 二次儀表：將熱電偶輸出的電信號轉(zhuǎn)換成 被測介質(zhì)的溫度第8頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌功率的測量攪拌轉(zhuǎn)速：磁感應(yīng)式，光感應(yīng)

5、式， 測速電機；攪拌功率：功率表，測定力矩求功率法。3. 參數(shù)檢測第9頁/共138頁3. 參數(shù)檢測v參數(shù)檢測方法 空氣流量測定體積流量型： 會引起流體能量損失，受溫度和壓力變化的影響； 同心孔板壓差式流量計； 轉(zhuǎn)子流量計。質(zhì)量流量型： 根據(jù)流體固有性質(zhì)（質(zhì)量、導電性、熱傳導性能）設(shè)計的流量計。第10頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 罐壓測量 壓力表 壓力傳感器 3. 參數(shù)檢測第11頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 料液計量與液位控制 壓差法：H=（P2/P1）H 直接重量測量法：直接稱重 體積計量法：計算進出料液 流量計量法：計算流量和時間 液位探針3. 參數(shù)檢測第12頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 發(fā)

6、酵液粘度測定 毛細管粘度計 回轉(zhuǎn)式粘度計 渦輪旋轉(zhuǎn)粘度計3. 參數(shù)檢測第13頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 pH測量 復合pH電極 pH測量儀器3. 參數(shù)檢測第14頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 溶解氧的測量 化學法 極譜法 復膜氧電極法 3. 參數(shù)檢測復膜氧電極示意圖（a）極譜型 （b）原電池型第15頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 溶解二氧化碳測量 復膜式電極法 滲透膜碳酸氫鈉法 發(fā)酵尾氣的在線分析 CO2分析 O2分析3. 參數(shù)檢測第16頁/共138頁v參數(shù)檢測方法 細胞濃度的測量 化學法：如DNA、RNA分析等 物理法：如重量分析、分光光度分析、 濁度分析等新技術(shù)：以電容法為測量原理的在線 活

7、細胞濃度測量傳感器 3. 參數(shù)檢測原位活細胞在線檢測儀原位活細胞在線檢測儀第17頁/共138頁1. 初級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)初級代謝物：指一類低分子量的終點產(chǎn)物及這些終點產(chǎn)物的生物合成途徑中的中間體。 (1) 避開固有的反饋調(diào)節(jié)(2) 細胞通透性的變更第18頁/共138頁 反饋調(diào)節(jié)包括 反饋抑制：某一生物合成途徑的最終代謝物抑制該途徑的第一或第二個酶的活性。 反饋阻遏：抑制酶的形成，是由途徑終點產(chǎn)物或其衍生物施行的。（1）避開固有的反饋調(diào)節(jié)第19頁/共138頁黃色短桿菌賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機制黃色短桿菌賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機制1-天冬氨酸激酶；天冬氨酸激酶；2-DDP合成酶；合成酶；3-高絲氨酸脫氫酶

8、；高絲氨酸脫氫酶；4-琥珀酰高絲氨酸合成酶；琥珀酰高絲氨酸合成酶；5-蘇氨酸脫氫酶蘇氨酸脫氫酶第20頁/共138頁（1 1）避開固有的反饋調(diào)節(jié) 方法限制菌在胞內(nèi)積累終點產(chǎn)物的能力以解除負反饋調(diào)節(jié)作用 從遺傳上改變酶的活性和酶的形成系統(tǒng)，篩選有抗反饋作用的基因突變型（對反饋作用不敏感）。 具體應(yīng)用積累中間產(chǎn)物積累終點產(chǎn)物耐反饋作用的突變株的篩選：抗結(jié)構(gòu)類似物突變株 第21頁/共138頁第22頁/共138頁第23頁/共138頁第24頁/共138頁抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選機制 末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋作用，但是它們不能參與生物合成。在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細

9、胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導致細胞死亡。那些對類似物不敏感的突變株仍能制造末端產(chǎn)物并長成菌落。 突變株耐結(jié)構(gòu)類似物的原因： 酶的結(jié)構(gòu)起了變化（指耐反饋抑制的突變株） 酶的合成系統(tǒng)起了變化（指耐反饋阻遏的突變株）第25頁/共138頁（1 1）避開固有的反饋調(diào)節(jié) 雙突變株的概念：單一菌株內(nèi)同時發(fā)生耐反饋抑制和耐反饋阻遏的突變作用。 思考題： 某一菌株對所要生產(chǎn)的產(chǎn)物的類似物有天然的耐受力，這種時候能否利用類似物篩選突變株呢？ 回復篩選：用突變除去反饋敏感的酶和用第二次突變置換它，常產(chǎn)生分泌終點產(chǎn)物的回復子。 第26頁/共138頁細胞通透性的變更 細菌細胞膜通透性

10、的增加是谷氨酸過量生產(chǎn)的原因之一。 能過量生產(chǎn)谷氨酸的細菌有兩個共同特征： -酮戊二酸脫氫酶缺失：表明這類細菌的TCA上的酶受阻，保證了碳引向谷氨酸的合成歧路。 對生物素的營養(yǎng)需求：表明這類細菌的生物素的生物合成受阻，導致細胞膜通透性的改變，使細胞可以分泌出谷氨酸。 第27頁/共138頁2. 次級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)(1) 次級代謝的特點及與初級代謝的關(guān)系(2) 調(diào)節(jié)方法 誘導作用 避開固有的負反饋 操縱環(huán)境條件來控制次級代謝物的生物合成 耐負反饋調(diào)節(jié)的抗性突變株的篩選 初級代謝物的調(diào)節(jié)作用 能荷調(diào)節(jié) e.g.磷酸鹽影響金霉素的合成第28頁/共138頁（1）次級代謝的特點及與初級代謝的關(guān)系 次級代

11、謝酶的特異性較初級代謝酶的特異性低，故受遺傳及環(huán)境因素的影響大。 次級代謝物的合成途徑比初級代謝的種類多，但大多數(shù)次級代謝物都是由少數(shù)關(guān)鍵中間代謝物組裝的。 次級代謝產(chǎn)物的合成一般是在生長期后，即培養(yǎng)基中的養(yǎng)分快耗盡，菌的比生長速率降低時才合成。 第29頁/共138頁操縱環(huán)境條件來控制次級代謝物的生物合成 改變培養(yǎng)基成分來避免分解阻遏作用 改變培養(yǎng)基成分來避免反饋抑制和阻遏作用 e.g.鏈霉素發(fā)酵中限制磷酸鹽的加量，避免其對參與生物合成的磷酸酯酶的反饋抑制和阻遏作用 培養(yǎng)基中添加前體物來避免分支途徑終產(chǎn)物對發(fā)酵產(chǎn)品的間接抑制作用第30頁/共138頁n 分解阻遏作用的解除主要是在多個碳源中選擇慢

12、碳分解阻遏作用的解除主要是在多個碳源中選擇慢碳源或者采用緩慢流加快碳源的工藝源或者采用緩慢流加快碳源的工藝 在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中的青霉素發(fā)酵代謝曲線在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中的青霉素發(fā)酵代謝曲線第31頁/共138頁耐負反饋調(diào)節(jié)的抗性突變株的篩選 篩選耐結(jié)構(gòu)類似物的突變株 e.g. 不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高產(chǎn)菌株 回復篩選 e.g. 高產(chǎn)金霉素產(chǎn)生菌 篩選耐藥性菌株 e.g. 利用抗生素篩選耐藥性菌株 第32頁/共138頁第33頁/共138頁(三)溫度對發(fā)酵的影響及其控制1. 影響發(fā)酵溫度的因素2. 溫度對微生物生長的影響3. 溫度對基質(zhì)消耗的影響4. 溫度對產(chǎn)物合成的影響5.

13、最適溫度的選擇與控制 第34頁/共138頁(1)發(fā)酵熱 發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的熱量，叫做發(fā)酵熱。 Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射 第35頁/共138頁(2)生物熱 來源 ：微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的分解所釋放的能量 影響因素： 菌株 培養(yǎng)基成分 發(fā)酵時期 生物熱與其它參數(shù)的關(guān)系 呼吸強度QO2 糖利用速率當產(chǎn)生的生物熱達到高峰時，菌的呼當產(chǎn)生的生物熱達到高峰時，菌的呼吸強度最大，糖的利用速率也最大，吸強度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗來衡量生物熱?？捎煤难趿俊⑻呛膩砗饬可餆?。第36頁/共138頁2. 溫度對微生物生長的影響 當時，可忽略，微生物處于生長狀態(tài)。、皆與T有關(guān)，其關(guān)系均可用

14、阿累尼烏斯公式描述： EE 死亡速率比生長速率對溫度變化更為敏感 xxdtdxdtdxx1RTE1eARTE2eA第37頁/共138頁嗜冷、嗜中溫、嗜熱菌的典型生長與溫度關(guān)系嗜冷、嗜中溫、嗜熱菌的典型生長與溫度關(guān)系第38頁/共138頁2. 溫度對微生物生長的影響(續(xù)) 在其最適溫度范圍內(nèi)，生長速率隨溫度升高而增加，當溫度超過最適生長溫度，生長速率隨溫度增加而迅速下降。 不同生長階段的微生物對溫度的反應(yīng)不同 處于延遲期的細菌對溫度的影響十分敏感。 對于對數(shù)生長期的細菌，如果在略低于最適溫度的條件下培養(yǎng)，即使在發(fā)酵過程中升溫，則升溫的破壞作用較弱。 處于生長后期的細菌，其生長速度一般主要取決于溶解

15、氧，而不是溫度。 第39頁/共138頁(1) 糖比消耗速率qs Righelato假定：m維持因子，即生長速率為零時的葡萄糖的消耗。m項與滲透壓調(diào)節(jié)、代謝產(chǎn)物的生成、遷移性及除繁殖以外的其它生物轉(zhuǎn)化等過程所需的能量有關(guān)。這些過程受溫度的影響，所以m也和溫度相關(guān)。B生長系數(shù)，即同一生長速率下的糖耗，B值越大，說明同樣比生長速率下，用于純粹生長的糖耗越大。 改變溫度可以控制qs和 Bmqs第40頁/共138頁（2）T對B、m和的影響 qs一定： 當TTm時， m ， , B 底物轉(zhuǎn)化效率低當T=Tm時，mT(K)m溫度對溫度對B、m和不同和不同qs下對下對值的影響值的影響第41頁/共138頁4.

16、溫度對產(chǎn)物合成的影響 影響發(fā)酵過程中各種反應(yīng)速率，從而影響微生物的生長代謝與產(chǎn)物生成。 e.g. 青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素 青霉菌生長活化能青霉菌生長活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能青霉素合成活化能E2=112kJ/mol 青霉素合成速率對溫度較敏感青霉素合成速率對溫度較敏感第42頁/共138頁 改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響菌的生物合成 。 影響生物合成方向。 e.g. 四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌：T5.0：酵母形態(tài)變小，發(fā)酵液變黑，且污染大量細菌 pH0.5% 低pH6.8控制加糖 7% ， OTR逐漸至OTR=，即 ，高位平衡 當處于高位平衡時，表明供氧性能好。

17、高位平衡通常發(fā)生在正常情況的前、后期。LLaCCKOTR0dtdCLOTR,CC,CLL0dtdCL第64頁/共138頁n平衡點分析平衡點分析：當當CL（如對數(shù)生長期如對數(shù)生長期很大很大）， ，OTRCm, 卷須霉素: 而有些菌株 Ccr CCr，生產(chǎn)階段滿足生產(chǎn)階段滿足CLCm。 第70頁/共138頁（1 1）發(fā)酵異常指標 發(fā)酵中污染雜菌，溶解氧發(fā)生異常變化。 對于好氣性雜菌，溶解氧會一反往常在較短時間內(nèi)跌到零附近，跌零后長時間不回升。 對于厭氣性雜菌，溶解氧升高。 污染噬菌體或其它不明原因引起 發(fā)酵液變稀，此時溶解氧迅速上升。 操作故障或事故分析 谷氨酸正常發(fā)酵和異常發(fā)酵的溶解氧曲線正常發(fā)

18、酵溶解氧曲線-異常發(fā)酵溶解氧曲線異常發(fā)酵光密度曲線第71頁/共138頁（2）補料控制指標 中間補料是否得當可以從溶解氧的變化看出。 發(fā)酵過程中出現(xiàn)“發(fā)酸”現(xiàn)象，此時溶解氧很快下降。 第72頁/共138頁（3）代謝方向控制指標 測量溶解氧可以確定CCr、Cm值 通過溶氧測量可以掌握由好氣轉(zhuǎn)為厭氣培養(yǎng)的關(guān)鍵時機 e.g.天門冬酰胺酶發(fā)酵：45%飽和度 在酵母以及其他微生物菌體的生產(chǎn)中，溶氧值是控制其代謝方向的最好的指標之一 。第73頁/共138頁（4）設(shè)備性能、工藝合理性指標 評價設(shè)備性能、工藝合理性的最終指標：發(fā)酵單位 設(shè)備反映供氧性能： 攪拌槳形式 葉片形式 攪拌器直徑d 攪拌檔數(shù)m和攪拌器間

19、距s 檔板寬度w和檔板數(shù)z 通氣：空氣分布器的類型和位置 n，P/V 設(shè)備操作參數(shù) 罐壓 WS或VVM攪拌攪拌設(shè)備幾何參數(shù)設(shè)備幾何參數(shù)第74頁/共138頁（4）設(shè)備性能、工藝合理性指標工藝條件反映耗氧和供氧特征 菌種性能：耗O2 培養(yǎng)基性能：耗O2、供O2 溫度：耗O2、供O2 RQ（O2與CO2水平比較）：耗O2 表面活性劑：耗O2、供O2第75頁/共138頁改進工藝：控制補料速度、改進工藝：控制補料速度、T 的調(diào)節(jié)、中間補水、的調(diào)節(jié)、中間補水、 添加表面活性劑等等添加表面活性劑等等 對現(xiàn)有發(fā)酵工對現(xiàn)有發(fā)酵工廠進行技術(shù)改造廠進行技術(shù)改造 淺層次淺層次 修改設(shè)備和工藝修改設(shè)備和工藝 規(guī)模和控制

20、水平上檔次規(guī)模和控制水平上檔次 引入新型發(fā)酵類型引入新型發(fā)酵類型 深層次深層次 第76頁/共138頁 工藝的改進是否有效可通過溶解氧水平進行評價：工藝的改進是否有效可通過溶解氧水平進行評價： P/V的改變對溶解氧和產(chǎn)量的影響的改變對溶解氧和產(chǎn)量的影響 e.g.利福霉素發(fā)酵利福霉素發(fā)酵：5080h波谷階段波谷階段，P/V，KLa，供氧供氧；3W/L比比1 W/L批號的發(fā)酵單位增加約批號的發(fā)酵單位增加約900u/ml 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)n 對溶解氧和產(chǎn)量的影響對溶解氧和產(chǎn)量的影響e.g.赤霉素發(fā)酵赤霉素發(fā)酵：15 50h期間期間，n從從155 提高至提高至180r/min， 赤霉素單位赤霉素單位第7

21、7頁/共138頁（1 1）溶解氧控制的一般原則 生長階段： 即可 產(chǎn)物合成階段： 即可v過高的溶氧水平反而對菌體代謝有不可逆的抑制作用CrLCC mLCC 第78頁/共138頁（2）溶解氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一 v控制原理 發(fā)酵過程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 補糖使CL下降，而CL回升的快慢取決于供氧效率。 對于一個具體的發(fā)酵，存在一個最適氧濃度（Cm）水平，補糖速率應(yīng)與其相適應(yīng)。 mLCC，加大補糖速率加大補糖速率 mLCC ，減小補糖速率減小補糖速率實現(xiàn)用溶解氧水平控制補料速率實現(xiàn)用溶解氧水平控制補料速率 第79頁/共138頁 補糖速率控制在正好使生產(chǎn)菌處

22、于所謂“半饑餓狀態(tài)”，使其僅能維持正常的生長代謝，即把更多的糖用于產(chǎn)物合成，并永遠不超過罐設(shè)計時的KLa水平所能提供的最大供氧速率。 v控制原則（2）溶氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一 第80頁/共138頁v控制方法 溶氧和補糖控制系統(tǒng) 溶氧和pH控制的系統(tǒng) （2）溶氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一 第81頁/共138頁溶氧在加糖控制上的應(yīng)用溶氧在加糖控制上的應(yīng)用第82頁/共138頁溶氧與溶氧與pH協(xié)同控制系統(tǒng)協(xié)同控制系統(tǒng)第83頁/共138頁（3）溶解氧控制的工藝方法：從供氧、需氧兩方面考慮 供氧方面：提高氧分壓（氧分含量），即 ，提高供氧能力改變攪拌轉(zhuǎn)速：通過改變KLa來提高供氧能力 通氣速

23、率Ws ：Ws增加有上限，引起“過載”、泡沫提高罐壓： ，但同時會增加CO2的溶解度，影響pH及可能會影響菌的代謝，另外還會增加對設(shè)備的強度要求。 CC第84頁/共138頁改變發(fā)酵液理化性質(zhì)（， ，Ii） 加消泡劑，補加無菌水，改變培養(yǎng)基成分改變KL改變溫度： ，提高推動力（C*CL）C,T（3）溶解氧控制的工藝方法（續(xù)）溶解氧控制的工藝方法（續(xù)）n 供氧方面：供氧方面：第85頁/共138頁（3）溶解氧控制的工藝方法（續(xù)） 耗氧方面 限制性基質(zhì)的流加控制（補料控制）：在OTR一定情況下，控制基質(zhì)濃度限制、x 限制 控制溶解氧第86頁/共138頁（4）溶解氧自動控制系統(tǒng) 改變通氣速率的溶氧控制系

24、統(tǒng) 改變攪拌轉(zhuǎn)速的溶氧控制系統(tǒng) 改變通氣量、轉(zhuǎn)速、罐壓所組成的多參數(shù)溶氧控制系統(tǒng) 第87頁/共138頁溶解氧對被孢霉合成花生四烯酸 (AA) 的影響 溶氧量對溶氧量對AA產(chǎn)量的影響產(chǎn)量的影響注：搖床轉(zhuǎn)速注：搖床轉(zhuǎn)速150r/min, 25 KLa越大越大，培養(yǎng)基中溶培養(yǎng)基中溶解氧越多解氧越多, , AA合成速合成速度越快度越快第88頁/共138頁溶解氧控制對鳥苷產(chǎn)量的影響不同的不同的DO控制條件下鳥苷積累的比較控制條件下鳥苷積累的比較DO()：5，l0，20，30發(fā)酵過程發(fā)酵過程 DO 變化與鳥苷變化與鳥苷 積累的關(guān)系積累的關(guān)系DO 控制在控制在1020，產(chǎn)物積累產(chǎn)物積累，鳥苷含量最高。，鳥苷

25、含量最高。DO在在5和和30，前期產(chǎn)物積累前期產(chǎn)物積累，但后期基本不增加，但后期基本不增加.DO水平的超高階段水平的超高階段(發(fā)酵周期發(fā)酵周期28h44h)，鳥苷積累量基本不，鳥苷積累量基本不增加；調(diào)整增加；調(diào)整DO 在適當水平上，鳥苷積累量繼續(xù)上升。在適當水平上，鳥苷積累量繼續(xù)上升。 第89頁/共138頁（六）CO2和呼吸商對發(fā)酵的影響及其控制1. 定義 2. 發(fā)酵過程中CO2釋放率的變化3. . CO2對發(fā)酵的影響 第90頁/共138頁1. 定義 呼吸商（RQ）：指菌體呼吸過程中，CO2釋放率和菌的耗 氧速率之比，RQ反映菌的代謝情況。 菌體耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌體CO2釋

26、放率CER，molCO2/LhOURCERRQ 第91頁/共138頁（1 1）影響尾氣中CO2濃度的因素 通入空氣量： 呼吸強度： CO2溶解度： 菌體量：出2COC,VVM出，2CO2CO2OCQQ出出，；、2CO2COCPC,TPT出，2CO2COCCERxQx第92頁/共138頁（2）CER變化規(guī)律 CO2積累量漸增，與x曲線對應(yīng)，基本類似S型曲線變化； 當工藝和設(shè)備參數(shù)一定的情況下，CER與x有比例關(guān)系（CER菌體生長速率）； CO2濃度變化與O2濃度變化成反向同步關(guān)系。第93頁/共138頁CERdtCERdt，菌體干重的時間曲線，菌體干重的時間曲線1- CERdt1- CERdt；2

27、-2-菌量菌量第94頁/共138頁（3）CER的測量與計算 測量方法：熱導、紅外分析儀、質(zhì)譜儀 計算 fCCC1CCVFxQCER2CO2O2CO2COL2CO進出出出惰進進第95頁/共138頁（1 1）研究參數(shù)CO2的意義 作為代謝產(chǎn)物或中間前體，尾氣中CO2積累與生物量 成正比，通過C質(zhì)量平衡估算生長速率和細胞量。 高濃度CO2對發(fā)酵多表現(xiàn)為抑制作用，應(yīng)實施測量與 控制； 尾氣CO2不僅直接反映代謝情況，而且和其它參數(shù)及補料操作密切相關(guān)，可作為工藝優(yōu)化的指標。 第96頁/共138頁（2）CO2對細胞的作用機制 “麻醉”作用 CO2及HCO3-都會影響細胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜的流動性及表面電荷密度

28、發(fā)生變化，導致許多基質(zhì)的跨膜運輸受阻，影響了細胞膜的運輸效率，使細胞處于“麻醉”狀態(tài)，細胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變。 第97頁/共138頁（3）CO2對菌體生長及產(chǎn)物形成的影響 CO2, 基質(zhì)分解速率，ATP ，中間產(chǎn)物或形態(tài)變異導致產(chǎn)量 高濃度CO2抑制作用的獨立性: 只要CO2在培養(yǎng)液中濃度過量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能解除，這種負作用在放大過程更明顯。 正確評價通氣的作用： 供氧： 排廢氣： 水分及揮發(fā)性組分的散失 LaK,VVM第98頁/共138頁（4）CO2釋放與發(fā)酵過程參數(shù)pH及操作參數(shù)補糖速率的關(guān)系 在青霉素發(fā)酵中補糖將引起排氣CO2增加，同時pH下降。

29、 糖、CO2、pH三者的相關(guān)性，被青霉素工業(yè)生產(chǎn)上用于補料控制的參數(shù)，并認為排氣CO2的變化比pH變化更為敏感，所以測定排氣CO2釋放率 （CER）來控制補糖速率。 補糖與溶氧及pH協(xié)同控制 補糖速率與CER控制 補糖對排氣補糖對排氣CO2和和pH的影響的影響第99頁/共138頁（4）尾氣CO2與O2的相關(guān)性 相關(guān)程度表示： 尾氣CO2與O2相關(guān)性：反向同步關(guān)系 呼吸商（RQ）與發(fā)酵的關(guān)系不同菌株、同一菌株不同代謝途徑、同一菌株利用不同基質(zhì)、同一菌株在不同發(fā)酵階段，RQ值不相同。RQ值可以表征發(fā)酵狀況。 OURCERRQ fCC1CCCVFxQOUR2O2CO2O2OL2O出出出惰進進第100

30、頁/共138頁青霉素發(fā)酵不同階段青霉素發(fā)酵不同階段： 菌體生長階段菌體生長階段：RQ0.909 維持階段維持階段：RQ=1 生產(chǎn)階段生產(chǎn)階段：RQ=4如果產(chǎn)物的還原性比基質(zhì)大時，其如果產(chǎn)物的還原性比基質(zhì)大時，其RQ值就增加；反之，值就增加；反之，當產(chǎn)物的氧化性比基質(zhì)大時當產(chǎn)物的氧化性比基質(zhì)大時，RQ值就要減少值就要減少，其偏離程其偏離程度決定于單位菌體利用基質(zhì)形成產(chǎn)物的量。度決定于單位菌體利用基質(zhì)形成產(chǎn)物的量。 產(chǎn)物形成對產(chǎn)物形成對RQ影響最大影響最大第101頁/共138頁（七）基質(zhì)濃度對發(fā)酵過程的影響及補料控制1. 基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響 2. 補料控制第102頁/共138頁（1） 基質(zhì)濃度對

31、微生物生長的影響 sKS情況下，比生長速率與基質(zhì)濃度呈直線關(guān)系： 一般情況下符合Monod方程式 基質(zhì)濃度高時 SkSmaxSkSSmaxSkkiimax第103頁/共138頁第104頁/共138頁(2) 基質(zhì)濃度對產(chǎn)物合成的影響 低濃度限制 低水平誘導 高濃度抑制及分解阻遏作用e.g.葡萄糖氧化酶發(fā)酵：葡萄糖用量從8%降至6%，補入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分別提高26%或6.7%。 谷氨酸發(fā)酵（乙醇為碳源）：當乙醇濃度為2.5g/L和35g/L時，可延長谷氨酸生產(chǎn)時間，但在更高濃度下，菌體生長受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量降低。第105頁/共138頁（1）補料的目的 解除基質(zhì)過濃的抑制 解除產(chǎn)物的

32、反饋抑制 解除分解代謝物阻遏作用 避免因一次性投糖過多造成細胞大量生長，耗氧過多而造成波谷現(xiàn)象。 在生產(chǎn)上，補料還經(jīng)常作為糾正異常發(fā)酵的一個重要手段。第106頁/共138頁（2）補料的內(nèi)容n 補充微生物能源和碳源補充微生物能源和碳源n 補充菌體所需要的氮源補充菌體所需要的氮源n 補充微量元素或無機鹽補充微量元素或無機鹽n 添加前體、誘導劑等添加前體、誘導劑等第107頁/共138頁（3）補料的原則 中間補料的數(shù)量為基礎(chǔ)料的13倍 。 補料的原則就在于控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。 現(xiàn)有的各種補料措施都是通過實驗方法確定的。 第108頁/共138頁 大多數(shù)補料分批發(fā)酵均補

33、加生長限制性基質(zhì)大多數(shù)補料分批發(fā)酵均補加生長限制性基質(zhì)以經(jīng)驗數(shù)據(jù)或預(yù)測數(shù)據(jù)控制流加；以經(jīng)驗數(shù)據(jù)或預(yù)測數(shù)據(jù)控制流加；用傳感用傳感器直接測定限制性基質(zhì)的濃度，直接控制流器直接測定限制性基質(zhì)的濃度，直接控制流加；加；以以溶氧、pH、RQ、排氣中CO2分壓及代謝物質(zhì)濃度等參數(shù)間接控制流加；等參數(shù)間接控制流加；以物料平衡方程，通過傳感器在線測定的一些參數(shù)以物料平衡方程，通過傳感器在線測定的一些參數(shù)計算限制性基質(zhì)的濃度，間接控制流加。計算限制性基質(zhì)的濃度，間接控制流加。（4）補料控制的策略第109頁/共138頁（5）反饋控制參數(shù)的確定 為了有效地進行中間補料，必須選擇恰當?shù)姆答伩刂茷榱擞行У剡M行中間補料，

34、必須選擇恰當?shù)姆答伩刂茀?shù)，以及了解這些參數(shù)與微生物代謝、菌體生長、參數(shù)，以及了解這些參數(shù)與微生物代謝、菌體生長、基質(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關(guān)系?；|(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關(guān)系。 e.g. 谷氨酸發(fā)酵 在谷氨酸發(fā)酵過程中的某階段，生產(chǎn)菌的攝氧率和基質(zhì)消耗速率之間存在著線性關(guān)系。mmolmmolOxqOURk2S糖耗耗氧量第110頁/共138頁K=1.51K=1.75K=2.16谷氨酸發(fā)酵中谷氨酸發(fā)酵中K值對糖濃度的控制的影響值對糖濃度的控制的影響第111頁/共138頁（6）補料速率的確定 優(yōu)化補料速率是補料控制中十分重要的一環(huán)，補料補料速率要根據(jù)微生物對營養(yǎng)等的消耗速率及所設(shè)定的速率要根據(jù)微生

35、物對營養(yǎng)等的消耗速率及所設(shè)定的培養(yǎng)液中最低維持濃度而定。培養(yǎng)液中最低維持濃度而定。 補糖速率最佳點與設(shè)備的供氧能力有關(guān)。 e.g.青霉素發(fā)酵：青霉素發(fā)酵：KLa大的設(shè)備補料速率相應(yīng)大些；供氧低的設(shè)備，補料速率相應(yīng)減少，產(chǎn)量比供氧能力好的設(shè)備降低23。第112頁/共138頁（7）實例：四環(huán)素發(fā)酵中的補糖控制 補糖時間對四環(huán)素發(fā)酵單位的影響補糖時間適當補糖時間適當 （ 45h后加）后加）補糖時間過晚補糖時間過晚 （62h開始加）開始加） 補糖時間過早補糖時間過早 （20h后加）后加）第113頁/共138頁n 維持不同還原糖水平的四環(huán)素發(fā)酵中流加補糖的作用維持不同還原糖水平的四環(huán)素發(fā)酵中流加補糖的作

36、用第114頁/共138頁補糖對四環(huán)素發(fā)酵的影補糖對四環(huán)素發(fā)酵的影響響 在最適補加葡萄在最適補加葡萄糖的條件下，能正糖的條件下，能正確控制菌絲量的增確控制菌絲量的增加、糖的消耗與發(fā)加、糖的消耗與發(fā)酵單位增長三者之酵單位增長三者之間的關(guān)系，就可獲間的關(guān)系，就可獲得比采用豐富培養(yǎng)得比采用豐富培養(yǎng)基時更長的生物合基時更長的生物合成期。成期。n 維持不同還原糖水平的四環(huán)素發(fā)酵中流加補糖的作用維持不同還原糖水平的四環(huán)素發(fā)酵中流加補糖的作用第115頁/共138頁（八）高密度發(fā)酵及過程控制1. 高密度發(fā)酵2.高密度發(fā)酵策略3.高密度發(fā)酵技術(shù)4.高密度發(fā)酵存在的問題第116頁/共138頁1. 高密度發(fā)酵 代謝產(chǎn)

37、物的合成是靠菌體作為生產(chǎn)者來完成的。 高細胞密度發(fā)酵就是為了適應(yīng)這一要求而得到廣泛的重視。 高密度發(fā)酵：在發(fā)酵過程中保持較高的細胞密度，同時細胞或菌體的生產(chǎn)能力保持在較佳的狀態(tài)。 第117頁/共138頁高細胞密度發(fā)酵成功的實例菌種菌種特征特征基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵罐發(fā)酵罐類型類型培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法細胞干重細胞干重（g/L）培養(yǎng)時間（培養(yǎng)時間（h）產(chǎn)率產(chǎn)率 (g/L)/d大腸桿菌大腸桿菌需氧、葡萄需氧、葡萄糖過量、形糖過量、形成乙醇成乙醇葡萄糖礦物鹽葡萄糖礦物鹽或甘油礦物鹽或甘油礦物鹽攪拌罐攪拌罐葡萄糖（甘油）葡萄糖（甘油）非限制指數(shù)補料非限制指數(shù)補料140150304090100枯草桿菌枯草桿

38、菌嗜溫菌嗜溫菌含葡萄糖的完含葡萄糖的完全培養(yǎng)基全培養(yǎng)基攪拌罐攪拌罐補料分批培養(yǎng)，補料分批培養(yǎng)，以葡萄糖調(diào)節(jié)以葡萄糖調(diào)節(jié)pH18530160畢氏酵母畢氏酵母嗜溫菌嗜溫菌葡萄糖礦物鹽葡萄糖礦物鹽攪拌罐攪拌罐補料分批培養(yǎng)，補料分批培養(yǎng)，補甲醇補甲醇10050120120150釀酒酵母釀酒酵母嗜溫菌嗜溫菌含葡萄糖的完含葡萄糖的完全培養(yǎng)基全培養(yǎng)基攪拌罐攪拌罐連續(xù)培養(yǎng)，流加連續(xù)培養(yǎng)，流加葡萄糖葡萄糖2108050150第118頁/共138頁2.高密度發(fā)酵策略 使用最低合成培養(yǎng)基以便進行準確的培養(yǎng)基設(shè)計和計算生長得率。 優(yōu)化細胞生長速率，使得碳源能被充分利用和獲得較高的產(chǎn)率，用養(yǎng)分流加來限制菌的生長速率還能

39、控制培養(yǎng)物對氧的需求和產(chǎn)熱速率。 可用碳源作為限制性養(yǎng)分，且采用補料分批發(fā)酵來實現(xiàn)高密度發(fā)酵。 第119頁/共138頁3.高密度發(fā)酵技術(shù) 用于高密度發(fā)酵的生物反應(yīng)器類型： 攪拌罐，透析膜反應(yīng)器， 氣升式反應(yīng)器，氣旋式反應(yīng)器 在工業(yè)化生產(chǎn)中，通常采用的是攪拌罐與補料工藝來進行高細胞密度發(fā)酵。 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵成功的關(guān)鍵技術(shù)是補料策略，限制性基質(zhì)（葡萄糖）的流加模式有3種：恒速流加補料、變速流加補料和指數(shù)流加補料。 第120頁/共138頁4. 高密度發(fā)酵存在的問題 水溶液中的固體與氣體物質(zhì)的溶解度，基質(zhì)對生長的限制或抑制作用，基質(zhì)與產(chǎn)物的不穩(wěn)定性和揮發(fā)性，產(chǎn)物或副產(chǎn)物的積累達到抑制生長的水平

40、，高濃度的CO2與熱的釋放速率，高的氧需求以及培養(yǎng)基的粘度不斷增加等 。第121頁/共138頁1. 泡沫的產(chǎn)生及其影響 泡沫的產(chǎn)生 通氣和攪拌 代謝氣體的逸出 存在穩(wěn)定泡沫的表面活性物質(zhì)第122頁/共138頁1. 泡沫的產(chǎn)生及其影響 泡沫的類型泡沫的類型一類存在于發(fā)酵液的液面上。這類泡沫氣相所占比一類存在于發(fā)酵液的液面上。這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡沫與它下面的液體之間有能分辨例特別大，并且泡沫與它下面的液體之間有能分辨的界線。如在某些稀薄的前期發(fā)酵液或種子培養(yǎng)液的界線。如在某些稀薄的前期發(fā)酵液或種子培養(yǎng)液中所見的泡沫。中所見的泡沫。另一類出現(xiàn)在粘稠的菌絲發(fā)酵液當中。這種泡沫分另一類出現(xiàn)

41、在粘稠的菌絲發(fā)酵液當中。這種泡沫分散很細，而且很均勻，也較穩(wěn)定。泡沫與液體間沒散很細，而且很均勻，也較穩(wěn)定。泡沫與液體間沒有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相占的比例由下而上地逐漸增加。占的比例由下而上地逐漸增加。第123頁/共138頁 泡沫的不利影響 降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù) 增加了菌群的非均一性 增加了染菌機會 大量起泡引起“逃液”，導致產(chǎn)物的損失 泡沫嚴重時會影響通氣攪拌的正常進行 消泡劑的加入將給提取工序帶來困難1. 泡沫的產(chǎn)生及其影響第124頁/共138頁2.發(fā)酵過程中泡沫的消長規(guī)律 影響因素 通氣攪拌的強度 培養(yǎng)基的配比及原材料組成

42、 培養(yǎng)基的滅菌方法和操作條件 微生物代謝活動造成發(fā)酵液性質(zhì)變化 染菌 第125頁/共138頁霉菌發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的性質(zhì)與泡沫的關(guān)系霉菌發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的性質(zhì)與泡沫的關(guān)系第126頁/共138頁3. 泡沫的控制 （1）機械消泡（2）化學消泡 （3）從微生物本身特性著手，防止泡沫形成 篩選不產(chǎn)生泡沫的微生物突變株 幾種微生物混合培養(yǎng) 第127頁/共138頁（1）機械消泡 原理：靠機械力引起強烈振動或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機械力將排出氣體中的液體加以分離回收。 優(yōu)缺點 優(yōu)點：不需引入外來物質(zhì)，可節(jié)省原材料，減少 污染機會，并可減少培養(yǎng)液性質(zhì)復雜化的程度。 缺點：不如化學消泡迅速可靠，需要一定的設(shè)備和消耗一定的動力；不能從根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素 第128