金銀花20121030

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐課題申請(qǐng)書題 目 金銀花中綠原酸的提取及其抑菌作用的研究 姓 名 汪麗、楊鎮(zhèn)宇、潘蕾 專 業(yè) 動(dòng)物科學(xué) 學(xué) 號(hào) 3130103178 實(shí)驗(yàn)班級(jí) 周一下午 指導(dǎo)教師 李霽 浙江大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心2014年11月課題名稱金銀花中綠原酸的提取及其抑菌作用的研究課題組長(zhǎng)楊鎮(zhèn)宇學(xué)號(hào)專業(yè)動(dòng)物科學(xué)Email電話手機(jī)小 組 成 員姓名潘蕾學(xué)號(hào)3130103178專業(yè)動(dòng)物科學(xué)姓名汪麗學(xué)號(hào)專業(yè)姓名學(xué)號(hào)專業(yè)姓名學(xué)號(hào)專業(yè)摘 要 金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物忍冬(Lonicerajaponicathunb)及同屬多種植物的干燥花蕾,是臨床常

2、用的中藥之一。金銀花是人醫(yī)臨床常用的有代表性的清熱解毒藥,也是防治乳腺炎的要藥之一,具有抗菌、消炎、解熱、保肝、抗生育、止血、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、興奮中樞等多方面的藥理學(xué)作用。金銀花抗菌的有效成分主要是綠原酸和異綠原酸。金銀花在我國(guó)分布廣,藥用歷史悠久,是常用的清熱解毒藥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),金銀花中富含多種對(duì)人體健康有益的物質(zhì),諸如揮發(fā)油黃酮及綠原酸類、三萜類和微量元素等,具有很高的利用價(jià)值。在眾多的成分中綠原酸較為豐富且具有多種活性功能,因此常以綠原酸含量的高低評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的優(yōu)劣。   綠原酸是一種含有酚羥基的化合物,藥理學(xué)證明,綠原酸具有保護(hù)心血管的活性。人體內(nèi)的低密度脂

3、蛋白(LDL)被氧化是引起心血管病的一個(gè)重要原因。綠原酸能有效地保護(hù)人體LDL中2Tocopher2ol,使其LDL免受氧化。當(dāng)人體攝入一定量含有酚羥基化合物的食物時(shí),這些物質(zhì)可降低或淬滅人體中自由基的產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)在心臟病低發(fā)病率的人群中,發(fā)病率與綠原酸的攝入有一定聯(lián)系,其部分抗病機(jī)制是綠原酸對(duì)人體LDL中2Tocopherol氧化的抑制作用。 實(shí)驗(yàn)對(duì)金銀花中綠原酸的抗菌、抗氧化活性等方面做一些探討,為工業(yè)化生產(chǎn)該類物質(zhì)提供一定的技術(shù)依據(jù)，為篩選、研發(fā)防治殺菌抗氧化藥物新制劑提供參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。關(guān)鍵詞（用分號(hào)分開，最多5個(gè)）金銀花；綠原酸；抑菌作用；抗氧化性基本信息立題依據(jù)與研究?jī)?nèi)容： 1

4、.課題的立題依據(jù)。（研究意義、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來(lái)論述科學(xué)意義及其應(yīng)用前景。附主要參考文獻(xiàn)目錄）金銀花為忍冬屬忍冬植物的干燥花蕾 ，常用于中藥及保健食品，具有清熱解毒 ，涼風(fēng)散熱，抗病毒，保肝利膽的功能。金銀花含有綠原酸、異綠原酸 、三萜皂苷、木犀草素及肌醇等，一般認(rèn)為 ，金銀花的抗菌有效成分為綠原酸，且常以綠原酸的含量高低來(lái)評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的好壞。綠原酸具有顯著的清熱解毒、抗菌消炎作用，同時(shí)還具有增香和護(hù)色功能，可用于食品和果品的保鮮防腐。綠原酸是含有羧基和鄰二酚羥基的有機(jī)酸，易溶于水、醇溶液和丙酮等溶劑。金銀花即忍冬花在我國(guó)分布較廣,而且藥用歷史悠久,為常用

5、的清熱解毒藥。它也是國(guó)家衛(wèi)生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥之一。 金銀花中的綠原酸由于其優(yōu)越的抗菌、抗氧化活性愈來(lái)愈受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。Peter 等人(1998)的研究結(jié)果認(rèn)為，綠原酸是很有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先導(dǎo)化合物， Kwon 等人（2000）的研究結(jié)果與之一致。鑒于綠原酸的巨大開發(fā)價(jià)值，國(guó)內(nèi)外已紛紛開展綠原酸提取及其藥理活性的相關(guān)研究，綠原酸的提取工藝也取得了一定的研究進(jìn)展，但提取率低、能耗大、耗時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜等問題一直未能有效解決。金銀花在我國(guó)作為藥用已有數(shù)千年歷史，栽培相當(dāng)廣泛，在上述國(guó)家政策背景以及社會(huì)市場(chǎng)需求下，采用現(xiàn)代新技術(shù)對(duì)金銀花特征成分綠原酸的進(jìn)行提

6、取及純化研究工作十分有意義；鑒于綠原酸療效確切和富含綠原酸的各種制劑在臨床上的廣泛使用，若從中提取醫(yī)用綠原酸，原料有來(lái)源保障，將有廣闊的開發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)將采用多種方法分別從金銀花中提取綠原酸,用紫外光譜法進(jìn)行定性定量分析，探究高效節(jié)約的有效提取方法。并測(cè)定綠原酸對(duì)幾種的致病菌的抑菌能力,進(jìn)一步明確綠原酸的抑菌活性,完善綠原酸的抗菌譜，同時(shí)探究其對(duì)自由基的抗氧化能力。為研發(fā)篩選消炎抗菌藥物及其它抗氧化性產(chǎn)品的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)，進(jìn)一步完善對(duì)綠原酸的研究。參考文獻(xiàn)1 烏蘭.金銀花中綠原酸的提取及抗氧化性的研究C. 天津科技大學(xué) ，2005;2徐躍成.金銀花中綠原酸的提取分離及其抑菌作用研究C.

7、重慶大學(xué),2008;3趙鐘興;韋藤幼;郝瑞然從金銀花中提取綠原酸生產(chǎn)工藝的改進(jìn)期刊論文-時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥 2004(12);4 林緞嫦，宋勁詩(shī)，等&金銀花中綠原酸提取工藝探究J.中成藥，1994;5許東穎，盛家榮，賈永周.金銀花中綠原酸提取方法的比較和優(yōu)化研究N.廣西師范學(xué)院學(xué)報(bào).2003.6第二期；6 王宏軍, 吳國(guó)娟, 李煥榮,于同泉, 蔣紅, 路蘋.金銀花中綠原酸提取方法的篩選及其抑菌作用N.北京農(nóng)學(xué)院;7吳正奇，洪秀菊，石勇.膜技術(shù)分離純化綠原酸提取液的研究J.食品科學(xué).2007.28（11）；8黃云;肖艷萍;李娟不同工藝的金銀花提取物組分比較研究期刊論文-中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2005(0

8、6).本文采用多種方法分別從金銀花中提取綠原酸,用紫外光譜法和高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析。測(cè)定了綠原酸對(duì)食品中常見的致病菌的抑菌能力,清除DPPH自由基的能力和對(duì)Fe3+的還原能力。還對(duì)綠原酸的物理、化學(xué)性質(zhì)即對(duì)光、熱等的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。 綠原酸提取試驗(yàn)結(jié)果表明:綠原酸的最大吸收峰為324nm,用70%乙醇熱回流提取,時(shí)間為90min,浸提溶劑比為101（v/w）,提取溫度為80。精制工藝條件為:選擇D-301吸附樹脂,上柱液以30、2mL/min的流速下直接上柱吸附,15%乙醇洗脫,獲得綠原酸的提取率高于其他方法,提取終產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品的最高吸收峰均在324nm處,終產(chǎn)物中綠原酸的含量

9、為90.38%?？咕囼?yàn)結(jié)果表明:綠原酸具有較強(qiáng)的抑菌活性。抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明,金銀花中綠原酸對(duì)自由基DPPH·有較強(qiáng)的清除能力;從還原力上比較,較低濃度的綠原酸也遠(yuǎn)高出抗壞血酸的還原力;對(duì)綠原酸的物理、化學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明,它對(duì)光、熱等穩(wěn)定。2、課題的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問題。（此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）（1） 研究?jī)?nèi)容：1.查詢各類文獻(xiàn)后得到常用的三種提取綠原酸的方法，通過(guò)水提法，醇提法，超聲波提取法三種方法從金銀花中提取綠原酸，得到產(chǎn)物后通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量分析數(shù)據(jù)后可得三種方法所得綠原酸的含量。2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究金銀花中綠原酸對(duì)大腸埃希氏菌,枯草芽胞桿菌,金黃色

10、葡萄球菌,藤黃八疊球菌四種常見菌的抑菌效果。3.通過(guò)對(duì)金銀花中綠原酸在體外清除2,22二苯基22苦基肼自由基(DPPH)的能力,及其對(duì)Fe3+的還原能力來(lái)測(cè)定金銀花中綠原酸的抗氧化能力。（2） 研究目標(biāo)：由于綠原酸對(duì)許多疾病都具有明顯的療效,日益受到醫(yī)學(xué)及藥學(xué)界的重視,社會(huì)需求巨大,但目前國(guó)內(nèi)綠原酸的相關(guān)研究尚非常薄弱,尚無(wú)成熟的綠原酸純品生產(chǎn)工藝。本研究的主要目的是為了建立穩(wěn)定有效的金銀花綠原酸提取純化物的檢測(cè)鑒定方法。1. 明確綠原酸的有效提取方法并為其生產(chǎn)和研究提供參考;通過(guò)工藝優(yōu)化尋找更經(jīng)濟(jì)高效的綠原酸提取及分離純化方法;2.3. 通過(guò)對(duì)幾種食品中常見致病菌的綠原酸抑制活性研究,進(jìn)一步

11、明確綠原酸的抑菌活性；4. 通過(guò)對(duì)其還原性的研究進(jìn)一步了解其抗氧化性作用。5. 熟練掌握實(shí)驗(yàn)原理及方法，充分了解并記住各種實(shí)驗(yàn)儀器的使用。（3） 擬解決關(guān)鍵問題1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論分析常用的三種金銀花中綠原酸的提取方法中最高效節(jié)約的方法。2. 通過(guò)對(duì)其抑菌活性的研究完善其抗菌譜。3. 通過(guò)分析總結(jié)出綠原酸在其他方面的性質(zhì)及應(yīng)用。3、擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明）(一)實(shí)驗(yàn)原理1.金銀花(Loncera japonica Thunb)為忍冬科植物的花蕾，它的藥用歷史悠久，是中醫(yī)臨床用藥之一，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽等功效。金銀花中主要化學(xué)成分為

12、綠原酸、異綠原酸、黃酮化合物、芳樟醇、雙花醇等，其中主要的抗菌成分為綠原酸和異綠原酸。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑代謝產(chǎn)生的苯丙素類化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)為：綠原酸由結(jié)構(gòu)可以看出它是含有羧基和鄰二酚羥基的極性有機(jī)酸化合物，為酸性。由于分子內(nèi)含有鄰二酚羥基，受熱、見光易氧化，因此供試液要在陰涼、避光下保存?zhèn)溆?，且高溫和長(zhǎng)時(shí)間加熱不利于綠原酸的提取。在堿性條件下，綠原酸易發(fā)生水解，植物體內(nèi)存在的綠原酸往往是混合物而非單一組分。綠原酸物理性質(zhì)：名稱分子式分子量性狀熔點(diǎn)溶解度綠原酸C16H18O9345.30半水化合物為針狀晶（110變?yōu)闊o(wú)水化合物）

13、208水中4%，在熱水中溶解度更大，易溶于乙醇、丙酮和甲醇等極性溶劑，難溶于氯仿、苯、乙醚等親脂性有機(jī)溶劑2.紫外分光光度法：準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用 30% 甲醇溶解 并定容于50ml容量瓶中。取0.05mol/L的 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)于200500nm掃描（查詢文獻(xiàn)得到綠原酸的最大吸收峰為324nm左右）。 然后選取最大吸收波長(zhǎng)分別測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，以其吸光度值(OD值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取得到的綠原酸樣品同樣用分光光度計(jì)測(cè)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知樣品中綠原酸含量。綠原酸含量=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得含量/原金

14、銀花質(zhì)量綠原酸提取率=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得含量/原金銀花中 綠原酸總含量3. 抑菌試驗(yàn)與抗氧化性研究國(guó)內(nèi)外研究表明，綠原酸是一種有效新型天然酸性抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、生育酚等綠原酸之所以具有抗氧作用是因?yàn)榫G原酸含有一定量的 R-OH 基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，可以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，保護(hù)組織免受氧化作用的損傷，還可以有效地抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用。因此，可以通過(guò)檢測(cè)綠原酸對(duì)自由基的清除情況，來(lái)評(píng)價(jià)綠原酸的抗氧化能力。1.將提取到的綠原酸加入四種菌的培養(yǎng)基，觀察一段時(shí)間

15、后若出現(xiàn)某種菌大量死亡不再繁殖則可得到綠原酸對(duì)該菌有抑制作用。2.在自由基中加入綠原酸后每過(guò)一分鐘測(cè)量其吸光度，直至吸光度穩(wěn)定為止，吸光度值越大表示綠原酸還原能力越強(qiáng)。（二）實(shí)驗(yàn)步驟1.金銀花中綠原酸的提取水提法實(shí)驗(yàn)：稱取6O g干燥并粉碎的金銀花粉末3份裝在3個(gè)燒杯中，分別貼上標(biāo)簽，分別加入100ml蒸餾水，于60恒溫水浴鍋中加熱，第1份30min，第2份50 min，第3份70 min，提取完后，分別過(guò)濾，再分別向?yàn)V渣加入100 mL蒸餾水在各自提取相同時(shí)間，加熱完后再過(guò)濾將濾渣倒掉，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，濃縮液定容至20 mL。再分別抽濾，最后到離心機(jī)上4 000轉(zhuǎn)離心10 min，將

16、澄清的溶液放人冰箱待用乙醇提?。悍Q6O g干燥并粉碎的金銀花粉末5份裝在5錐形瓶中，分別貼上標(biāo)簽，分別加入40，50，60，70，80的乙醇各l00 mL，并且都密封，于60恒溫水浴鍋中加熱30 min，提取完后，分別過(guò)濾，再分別向?yàn)V渣加入各自濃度的乙醇100 mL，重復(fù)上述操作，之后也將濾液濃縮至20 mL，再分別抽濾，最后到離心機(jī)上4 000轉(zhuǎn)離心10 min，將澄清的溶液放人冰箱待用超聲波加水提?。悍Q取6O g干燥并粉碎的金銀花3份分裝在3個(gè)錐形瓶中，分別貼上標(biāo)簽，加入looml蒸餾水，于超聲波發(fā)生器中60加熱，超聲波效率為100，第1份30 min，第2份50 min，第3份70min

17、，提取完后，分別過(guò)濾，再向?yàn)V渣加入100 mL蒸餾水，重復(fù)上述操作，之后也將濾液濃縮至20 mL，再分別抽濾，最后到離心機(jī)上4 O00轉(zhuǎn)離心10 min，將澄清的溶液放人冰箱待用 超聲波加乙醇提?。悍Q6O g干燥并粉碎的金銀花粉末5份分裝在5個(gè)錐形瓶中，分別貼上標(biāo)簽，分別加入40，50，60，70，80的乙醇各100 mL，并且都密封，于60超聲波提取30 min，提取完后，分別過(guò)濾，再分別向?yàn)V渣加入各自濃度的乙醇100 mL，重復(fù)上述操作，之后也將濾液濃縮至20 mL，再分別抽濾，最后到離心機(jī)上4 000轉(zhuǎn)離心10 min，將澄清的溶液放人冰箱待用2. 綠原酸含量測(cè)定紫外分光光度法 (1)

18、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，30%甲醇溶解 并定容于50ml容量瓶中。再準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、 0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00ml分別10ml比色管中，用30%甲醇溶液定容。取0.05mol/L的 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)于200500nm掃描。 然后選取最大吸收波長(zhǎng)分別測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸 光度值(OD值)，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，以 其吸光度值(OD值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (2) 綠原酸含量的測(cè)定 ：將不同提取工藝所得供試品各取1ml用30%的甲醇 溶液定容至1000ml；在324nm處測(cè)其吸光度值，

19、以計(jì)算其中綠原酸的含量及提取率。綠原酸含量=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得含量/原金銀花質(zhì)量 綠原酸提取率=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得含量/原金銀花中 綠原酸總含量3.金銀花中綠原酸的抑菌活性研究試驗(yàn)菌株：大腸埃希氏菌(EscherichiaColi,G-),枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis,G+),金黃色葡萄球菌(Staphylo2coccusaureus,G+)，藤黃八疊球菌(Microccusluteus(Schroeter)Cohn,G+)培養(yǎng)基：固體肉湯培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl5.0,瓊脂20.0,pH7.2,121滅菌20min;半固體肉湯培養(yǎng)基(g/L):

20、蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl5.0,瓊脂8.0,pH7.2,121滅菌20min。實(shí)驗(yàn)儀器：ORION818型pH計(jì),RE23000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,SHB2循環(huán)水式多用真空泵,AB2042N分析天平,Uvmi2ni21240紫外可見分光光度計(jì)。主要試劑：CH3CH2OH、NaCl、FeCl3、K3Fe(CN)6、Na2HPO4、NaH2PO4、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、2,22二苯基22苦基肼(DPPH)、三乙胺、三氯乙酸(均為分析純)。實(shí)驗(yàn)方法：綠原酸抑菌活性實(shí)驗(yàn)生物檢測(cè)法  抑菌試驗(yàn)方法:無(wú)菌操作。取10mL瓊脂培養(yǎng)基于直徑為9cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,鋪勻,待凝固后,放入兩個(gè)牛

21、津杯。取含有活菌的半固體培養(yǎng)基10mL,加到裝有牛津杯的培養(yǎng)皿中,鋪勻,待凝固后,拔出牛津杯,在其中一個(gè)杯孔中加入藥液50L,并設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,37培養(yǎng)24h觀察結(jié)果,并測(cè)量抑菌環(huán)直徑。抑菌環(huán)直徑20mm為極敏,1520mm為高敏,1015mm為中敏,10mm為低敏。4.綠原酸抗氧化性(1)綠原酸清除DPPH活性測(cè)定取0.1mL的精制綠原酸樣品溶液,加入2.9mL0.05g/L的DPPH乙醇溶液?；靹蚝笤?17nm處測(cè)定吸光度值,每1min測(cè)量一次,直至讀數(shù)穩(wěn)定。(2) 綠原酸還原Fe3+能力的測(cè)定取2.5mL的不同樣品溶液,加入2.5mL的磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L,pH=6.6)

22、及2.5mL的1%K3Fe(CN)6溶液,于50水浴反應(yīng)20min后急速冷卻,加入2.5mL的10%三氯乙酸溶液,取反應(yīng)液5mL,加入5mL的H2O和0.1%FeCl3溶液1mL,混合均勻,10min后于700nm處測(cè)定其吸光度值,以水為空白,吸光度值越大表示還原能力越強(qiáng)。所得樣品保存方法：綠原酸在 pH 3.0 時(shí)比 pH 5.6 時(shí)更穩(wěn)定；而同樣溶劑條件下，綠原酸于 4 恒溫冰箱避光放置時(shí)比其 25恒溫儲(chǔ)藏室自然光放置更穩(wěn)定，儲(chǔ)存30天后，經(jīng)單因素 Duncan 多重函數(shù)綠原酸提取液的 pH 值處于 3.0 時(shí)，綠原酸比較穩(wěn)定，其原因可能是綠原酸為弱酸，在此環(huán)境不易分解保持在游離狀態(tài). 表明在這種情況下原酸的含量基本不隨時(shí)間的變化而降低，因此在后續(xù)的處理工藝中應(yīng)盡量將保持在 pH 值處