反義核酸與RNAi

1、RNA干擾RNA interference，RNAiJ生物技術史上革命性事件核酸結構與功能的揭示核酸結構與功能的揭示1PCR技術技術2重組重組DNA技術技術3RNAi和反義技術和反義技術4概述 RNA干擾（干擾（RNA interference, RNAi）是指在進化是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源）誘發(fā)的、同源mRNA高高效特異性降解的現(xiàn)象。效特異性降解的現(xiàn)象。目前對目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種，不同的定義有很多種，不同的資料對其定義的側重點也不盡相同，如果

2、將的資料對其定義的側重點也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學現(xiàn)象，可以有以下定義：看作一種生物學現(xiàn)象，可以有以下定義： RNAi是有是有dsRNA參與指導的，以外源和內(nèi)源參與指導的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標的轉基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異為降解目標的轉基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機制，是一種當外源基因導入或病毒入性的自我防御機制，是一種當外源基因導入或病毒入侵后，細胞中與轉基因或入侵病毒侵后，細胞中與轉基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。生共同基因沉默的現(xiàn)象。 如果將其作為一門生物技術，則定義為如果將其作為一門生物技術，則定義為 ：R

3、NAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細胞內(nèi)特異性的將與之同源的）在細胞內(nèi)特異性的將與之同源的 mRNA降解成降解成21nt23nt 的小片段，使相應的基因沉默。的小片段，使相應的基因沉默。 RNAi是將與靶基因的是將與靶基因的mRNA 同源互補的雙鏈同源互補的雙鏈RNA(dsRNA ) 導入細胞導入細胞,能特異性地降解該能特異性地降解該mRNA ,從從而產(chǎn)生相應的功能表型缺失而產(chǎn)生相應的功能表型缺失, 屬于屬于轉錄后水平的基因沉轉錄后水平的基因沉默默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 發(fā)

4、現(xiàn)過程 共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) u RNAi研究的早期線索來自于美國和荷蘭的兩個研究的早期線索來自于美國和荷蘭的兩個轉基因植物實驗組轉基因植物實驗組,約根森（約根森（Jorgensen）研究小組）研究小組 ,在對矮牽牛在對矮牽牛(petunias)進行的研究中有個奇怪的發(fā)進行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn)現(xiàn):u 他們設想將更多的色素基因注入矮腳牽牛植物他們設想將更多的色素基因注入矮腳牽牛植物體中，試圖加深花朵的紫顏色，而結果出其預料，體中，試圖加深花朵的紫顏色，而結果出其預料，轉基因的植株不僅沒有新基因表達，反而使原有的轉基因的植株不僅沒有新基因表達，反而使原有的色素基因也受到了抑制。色素基

5、因也受到了抑制。加入 chalcone synthase基因 or轉基因發(fā)現(xiàn)過程 Jorgensen 將這種現(xiàn)象命名為將這種現(xiàn)象命名為 共抑制共抑制(cosuppression) 因為導入的基因和其相似的內(nèi)源基因同因為導入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。時都被抑制。 發(fā)現(xiàn)過程發(fā)現(xiàn)過程 Quelling現(xiàn)象現(xiàn)象 并非只有植物學家才注意到了這種意外的現(xiàn)象并非只有植物學家才注意到了這種意外的現(xiàn)象。 1994年意大利的意大利的Cogoni等等,將外源類胡蘿卜素基將外源類胡蘿卜素基因導入鏈孢霉因導入鏈孢霉(Neurosporacrassa),結果轉化細胞中結果轉化細胞中內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到

6、了抑制。而在真菌內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制。而在真菌轉基因實驗中這種共抑制現(xiàn)象被稱轉基因實驗中這種共抑制現(xiàn)象被稱 “quelling”（現(xiàn)象?，F(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)過程J 95年康乃爾大學的研究人員年康乃爾大學的研究人員Guo(郭蘇郭蘇)和和kemphues在秀在秀麗線蟲麗線蟲(C.elegans)中用反義中用反義RNA 阻止一些基因的表達，給阻止一些基因的表達，給對照組用正義對照組用正義RNA不但不增加該基因的表達，反而產(chǎn)生與不但不增加該基因的表達，反而產(chǎn)生與反義反義RNA 同樣的結果同樣的結果特異性阻斷該基因的表達，這個特異性阻斷該基因的表達，這個奇怪的現(xiàn)象直到奇怪的現(xiàn)象直到3年后年后1998

7、才被解開。才被解開。J 1998年年Fire等發(fā)現(xiàn)將等發(fā)現(xiàn)將ds RNA注入秀麗線蟲可顯著抑制特注入秀麗線蟲可顯著抑制特定基因的表達，并證明了定基因的表達，并證明了Guo和和kemphues所發(fā)現(xiàn)的正義所發(fā)現(xiàn)的正義RNA的基因壓制作用其實是轉錄時污染微量的基因壓制作用其實是轉錄時污染微量dsRNA所造成所造成的。的。 線蟲體內(nèi)的RNAi線蟲中RNAi效應的檢測（左面）兩條線蟲表現(xiàn)為綠色熒光蛋白（GFP）表達類型品系，該品系含有一個普遍性表達的GFP報告基因重組質粒（帶有核內(nèi)定位信號位點）。（右面）喂食表達針對GFP的dsRNA的細菌后，整個蟲體的GFP信號消失。發(fā)現(xiàn)過程p將制備的將制備的RNA

8、高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義RNA無基因抑無基因抑制作用，反義制作用，反義RNA的基因抑制作用也很微弱，而用的基因抑制作用也很微弱，而用純化后的純化后的dsRNA注入線蟲，卻能高效、特異地阻斷注入線蟲，卻能高效、特異地阻斷相應基因的表達。相應基因的表達。p實驗證明雙鏈實驗證明雙鏈RNA抑制基因的表達的效率比純化后抑制基因的表達的效率比純化后的反義的反義RNA至少高幾個數(shù)量至少高幾個數(shù)量 ，他們稱此現(xiàn)象為，他們稱此現(xiàn)象為ds RNA介導的介導的RNA干擾（干擾（RNAi）。）。 Effects of mex-3 RNA interference on levels of the en

9、dogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from par

10、ent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfe

11、ring RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) RNA干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 安德魯安德魯菲爾菲爾(AndrewZ.Fire)、克雷格、克雷格梅洛梅洛(Craig C.Mello) 1998年發(fā)現(xiàn)了年發(fā)現(xiàn)了RNA干擾和基因沉默現(xiàn)象干擾和基因沉默現(xiàn)象。其論文發(fā)表在。其論文發(fā)表在1998年的年的NATRUE雜志上。雜志上。Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by d

12、ouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-811. 發(fā)現(xiàn)過程 RNAi現(xiàn)象的普遍性現(xiàn)象的普遍性 隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在也存在于水稻、煙草、果蠅、小于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核鼠及人等幾乎所有的真核生物中。生物中。RNAi能高效特能高效特異的阻斷基因的表達，在異的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內(nèi)，線蟲，果蠅體內(nèi)，RNAi能達到基因敲除的效果。能達到基因敲除的效果。2006年年10月月2日瑞典皇家科學院諾貝爾獎委員會日瑞典皇家科學院諾貝爾獎委員會宣布，

13、將宣布，將2006年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予兩名美國科學安德魯兩名美國科學安德魯法爾和克雷格法爾和克雷格梅洛，以表梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。法爾和梅洛將分干擾現(xiàn)象。法爾和梅洛將分享一千萬瑞典克朗的獎金享一千萬瑞典克朗的獎金(137萬美元萬美元)。 RNA干擾獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學干擾獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獎 目前普遍認為，共抑制、基因壓制和目前普遍認為，共抑制、基因壓制和RNAi很可能具有相很可能具有相同的分子機制，都是通過同的分子機制，都是通過dsRNA的介導而特異地降解靶的介導而特異地降解靶mRNA, 抑制相應基因的表達。抑制相應基因

14、的表達。 實際上，法爾在接受諾貝爾獎網(wǎng)站采訪時提到，第一個在實際上，法爾在接受諾貝爾獎網(wǎng)站采訪時提到，第一個在線蟲中觀察到線蟲中觀察到(RNA干擾干擾)這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學研這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學研究生究生郭蘇郭蘇。 1995年，從復旦大學畢業(yè)后赴美的郭蘇在坎菲斯年，從復旦大學畢業(yè)后赴美的郭蘇在坎菲斯(KennethKemphues)指導下，試圖阻斷秀麗新小桿線蟲的某個基因指導下，試圖阻斷秀麗新小桿線蟲的某個基因時，意外地發(fā)現(xiàn)反義和正義這兩種單鏈時，意外地發(fā)現(xiàn)反義和正義這兩種單鏈RNA都阻斷了該基都阻斷了該基因的表達。因的表達。 但可惜的是，她和坎菲斯一直沒能解釋這個奇怪現(xiàn)象。直但可

15、惜的是，她和坎菲斯一直沒能解釋這個奇怪現(xiàn)象。直到到3年后，當時在卡內(nèi)基研究所供職的法爾和梅洛才揭開年后，當時在卡內(nèi)基研究所供職的法爾和梅洛才揭開了謎底：在郭蘇的實驗中，體外轉錄所得了謎底：在郭蘇的實驗中，體外轉錄所得RNA污染了微量污染了微量的雙鏈的雙鏈RNA，而經(jīng)過純化的雙鏈，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA能夠高效率地阻斷相能夠高效率地阻斷相應基因的表達。這就是應基因的表達。這就是RNA干擾。干擾。 郭蘇目前在舊金山加州大學任職。她說：郭蘇目前在舊金山加州大學任職。她說：“他們在我們工他們在我們工作的基礎上，解釋了我們那個讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個飛作的基礎上，解釋了我們那個讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個飛躍躍

16、我和坎菲斯通過話，我們的工作在這個獎項中有所我和坎菲斯通過話，我們的工作在這個獎項中有所貢獻，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認為安德魯貢獻，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認為安德魯法爾和克雷格法爾和克雷格理應獲獎。理應獲獎。”&在實驗時，要認真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)在實驗時，要認真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導?，F(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導。正如美國西北大學神經(jīng)生物學教授饒毅所說：正如美國西北大學神經(jīng)生物學教授饒毅所說：“法爾的法爾的發(fā)現(xiàn)打開了一個新的研究領域，它既是一項科學發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)打開了一個新的研究領域，它既是一項科學發(fā)現(xiàn)，也是一項技術發(fā)明，為治療人類許多疾病提供了新的希也是一項技術發(fā)明，

17、為治療人類許多疾病提供了新的希望，這項成就和兩位華人很有關系，其中一位就是法爾望，這項成就和兩位華人很有關系，其中一位就是法爾實驗室的研究技術員徐思群實驗室的研究技術員徐思群”。 畢業(yè)于上海第二醫(yī)科大學的徐思群是那篇畢業(yè)于上海第二醫(yī)科大學的徐思群是那篇自然自然論文的第二作者。自論文的第二作者。自1992年起，從美國拿到碩士學位年起，從美國拿到碩士學位的他在法爾實驗室以研究技術員身份工作了的他在法爾實驗室以研究技術員身份工作了6年。但他年。但他扮演的角色不只是通常意義上負責實驗室日常運作的扮演的角色不只是通常意義上負責實驗室日常運作的“管家管家”?！耙粋€科學實驗成功的關鍵是實驗設計和實驗結果的一

18、個科學實驗成功的關鍵是實驗設計和實驗結果的分析理解，這當然要歸功于安迪和克雷格。我經(jīng)常說分析理解，這當然要歸功于安迪和克雷格。我經(jīng)常說我是小人，因為小人動手，君子動口和動腦，我不過我是小人，因為小人動手，君子動口和動腦，我不過是把他們的實驗意圖比較完整地在實驗臺上體現(xiàn)出來是把他們的實驗意圖比較完整地在實驗臺上體現(xiàn)出來?！毙焖既赫f。徐思群說。 u法爾和梅洛等人的研究發(fā)表以后，激發(fā)法爾和梅洛等人的研究發(fā)表以后，激發(fā)了全球研究人員對了全球研究人員對RNA干擾領域的興趣。干擾領域的興趣。u2001年和年和2002年，美國年，美國科學科學雜志連續(xù)雜志連續(xù)將將RNA干擾列入年度十大科學進展干擾列入年度十大

19、科學進展 。 轉錄水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 轉錄后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)TGS是指轉基因在細胞核內(nèi)RNA 合成受到了阻止而導致基因沉默。PTGS 則是指轉基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉錄，但在細胞質里卻無相應的mRNA 存在這一現(xiàn)象?；虺聊琑NA干擾的分子機制干擾的分子機制 J基因沉默基因沉默RNA干擾的分子機制干擾的分子機制 1.dsRNA的產(chǎn)生的產(chǎn)生:內(nèi)源性內(nèi)源性:p包括細胞內(nèi)源性基因的雙向表達包括細胞內(nèi)源性基因的雙向表達;p具有反向重復序列的細胞內(nèi)

20、源性基因表達產(chǎn)具有反向重復序列的細胞內(nèi)源性基因表達產(chǎn)生的短發(fā)夾生的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA， shRN A)等等外源性外源性:p以轉基因表達的以轉基因表達的mRNA 為模板，通過異常聚合作為模板，通過異常聚合作用形成用形成dsRNA;p真核生物基因組中的轉座子在復制表達過程真核生物基因組中的轉座子在復制表達過程 中產(chǎn)中產(chǎn)生的生的dsRNA;pRNA病毒基因組或病毒感染復制過程中產(chǎn)生的病毒基因組或病毒感染復制過程中產(chǎn)生的dsRNA中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物;p采采 用化學合成的用化學合成的dsRNA;或用質?；虿《据d體表達或用質粒或病毒載體表達所需的所需的dsRNA等等 siRN

21、A制備方法制備方法 化學合成化學合成 體外轉錄法合成體外轉錄法合成siRNA siRNA表達載體表達載體 siRNA表達框架表達框架siRNA設計的原則設計的原則 siRNA雙鏈設計時，一般在靶雙鏈設計時，一般在靶mRNA起始密碼下游起始密碼下游100200 bp至翻譯終止密碼上游至翻譯終止密碼上游50100 bp的范圍內(nèi)搜尋的范圍內(nèi)搜尋AA序列，并記錄每個序列，并記錄每個AA 3 端相鄰端相鄰19個核苷酸作為候選個核苷酸作為候選siRNA靶位點。靶位點。 建議設計的建議設計的siRNA不要針對不要針對mRNA的的5 和和3 端非編碼區(qū)端非編碼區(qū)(untranslated regions，UT

22、Rs)，因為這些區(qū)域有豐富，因為這些區(qū)域有豐富的調控蛋白結合位點，而的調控蛋白結合位點，而UTR結合蛋白或者翻譯起始結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響復合物可能會影響siRNP(siRNA protein complex，核，核酸內(nèi)切酶復合物酸內(nèi)切酶復合物)結合結合mRNA，從而影響，從而影響siRNA干擾的干擾的效果效果 。 最后還應將候選最后還應將候選siRNA序列在序列在GenBank進行進行BLAST檢檢索，與非同源基因具有索，與非同源基因具有3個或個或3個以上堿基相異的序列個以上堿基相異的序列方可選用。方可選用?；瘜W合成化學合成 早期早期RNAi實驗中，實驗中，dsRNA或或siR

23、NA均由化學法所均由化學法所合成?；瘜W合成的合成?；瘜W合成的siRNA純度高，合成量不受限純度高，合成量不受限制，且還可對制，且還可對siRNA進行標記，方便對其跟蹤，進行標記，方便對其跟蹤，但該方法價格昂貴，不適用于但該方法價格昂貴，不適用于siRNA序列的篩選序列的篩選和長期基因沉默實驗。和長期基因沉默實驗。 體外轉錄法合成體外轉錄法合成siRNA較為經(jīng)濟。根據(jù)較為經(jīng)濟。根據(jù)siRNA序列序列合成相應合成相應DNA Oligo模板，再利用模板，再利用T7 RNA聚合酶進聚合酶進行體外轉錄，分別獲得行體外轉錄，分別獲得siRNA的正義鏈和反義鏈，的正義鏈和反義鏈，然后將其退火、純化即可得到能

24、直接導入細胞的然后將其退火、純化即可得到能直接導入細胞的siRNA。 體外轉錄法最大缺點是體外轉錄法最大缺點是siRNA合成量受限制，不過合成量受限制，不過其價格較低，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。其價格較低，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。體外轉錄法合成體外轉錄法合成siRNAConstruction of siRNA by T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription.siRNA表達載體表達載體 體外合成體外合成siRNA，不宜進行長期基因沉默研究。借助，不宜進行長期基因沉默研究。借助表達質粒或病毒載體在細胞內(nèi)產(chǎn)生表達質?；虿《据d體在細胞內(nèi)產(chǎn)生s

25、iRNA，使研究者，使研究者無需直接操作無需直接操作RNA就可達到長期抑制靶基因表達的目就可達到長期抑制靶基因表達的目的，且載體上的抗性標記有助于快速篩選出陽性克隆的，且載體上的抗性標記有助于快速篩選出陽性克隆，這將具有更為廣闊的應用前景。，這將具有更為廣闊的應用前景。短發(fā)夾短發(fā)夾RNA (shRNA) shRNA表達質粒多采用表達質粒多采用RNA聚合酶聚合酶 啟動子啟動子 (pol)。pol 在哺乳動物細胞內(nèi)引導非編碼小在哺乳動物細胞內(nèi)引導非編碼小RNA的轉錄，轉錄產(chǎn)物無的轉錄，轉錄產(chǎn)物無poly(A)尾，且在轉錄過尾，且在轉錄過程中遇到連續(xù)程中遇到連續(xù)45個個U時轉錄終止。時轉錄終止。 此

26、載體最后轉錄出的產(chǎn)物是經(jīng)折疊形成的發(fā)夾狀小此載體最后轉錄出的產(chǎn)物是經(jīng)折疊形成的發(fā)夾狀小RNA (small hairpin RNA，shRNA)；shRNA在細在細胞內(nèi)被胞內(nèi)被Dicer酶切割成酶切割成3 端帶有兩個端帶有兩個U突出的突出的siRNA，進而啟動，進而啟動RNAi，介導基因沉默。載體中的間隔，介導基因沉默。載體中的間隔序列為序列為9個核苷酸時最為有效。個核苷酸時最為有效。 (A) U6 or H1 PolIII promoters drive the expression of a hairpin structure in which the sense and antisens

27、e strands of the siRNAare connected by a loop sequence. (B) Two U6- or H1-based expression cassettes are used to drive the separate transcription of the sense and antisense strands in the cell. The two strands would then anneal to form a double-stranded siRNA. An oligo-U overhang is present on each

28、strand. (C) A PolII promoter (a shortened version of the human CMV) drives the expression of a hairpin siRNA. The transcript includes extra nucleotides at its 5 end and a poly-A tail (instead of an oligo-U) overhang at the 3 end.L用病毒載體介導用病毒載體介導RNAi近年來受到人們重點關注。利近年來受到人們重點關注。利用病毒載體可以解決質粒轉染效率低、效果不穩(wěn)定用病毒載

29、體可以解決質粒轉染效率低、效果不穩(wěn)定且某些類型細胞不能轉染等問題，從而擴大且某些類型細胞不能轉染等問題，從而擴大RNAi應應用范圍。常見病毒載體有腺病毒用范圍。常見病毒載體有腺病毒(Adenovirus)載體、載體、逆轉錄病毒逆轉錄病毒(Retrovirus)載體、慢病毒載體、慢病毒 (Lentivirus)載載體等。體等。RNAi 的機制2. dsRNA被加工成被加工成小干擾小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。）。 pdsRNA是是RNAi的初始誘導因子，的初始誘導因子， 但是但是dsRNA必須被必須被Dicer酶酶進一步加工成長度為進一步加工成長度為21

30、 - 23個核苷酸的個核苷酸的siRNA才能產(chǎn)生才能產(chǎn)生RNAi反反 應。應。 pDicer酶屬酶屬RNase家族中的第二類：家族中的第二類：l兩個兩個RNase結構域結構域l一個一個dsRNA結合結構域結合結構域( dsRNA-binding domain， dsRBD) ，l一個解旋酶結構域一個解旋酶結構域(helicase domain)l一個一個PAZ結構域結構域 體外實驗表明，人重組體外實驗表明，人重組Dicer酶對酶對dsRNA切割時，切割時，PAZ結構域綁定結構域綁定dsRNA的末端，的末端，dsRNA結合結構域綁定結合結構域綁定dsRNA 內(nèi)部，隨后通過兩個內(nèi)部，隨后通過兩個R

31、Nase結構域對結構域對dsRNA的的雙鏈分別進行切割成雙鏈分別進行切割成 長度約長度約22個核昔酸的個核昔酸的siRNA片段片段 。usiRNA片段帶有片段帶有5端磷酸基團，在其端磷酸基團，在其 3端有端有2個突出個突出的核苷酸的核苷酸 3.RISC裝載裝載siRNA p裝載裝載siRNA的的RISC ( RNA - induced silencing complex. RISC) 被稱為被稱為RNA誘導的沉默復合物，由誘導的沉默復合物，由多種蛋白組成，其中關鍵成分是具核擊內(nèi)切酶活性多種蛋白組成，其中關鍵成分是具核擊內(nèi)切酶活性的的Argonaut2 ( Ago2 )蛋白。蛋白。 psiRNA

32、 在在ATP參與下被參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導形成并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC由由siRNA、解旋酶、解旋酶、ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成。多種成分組成。RNAi 的機制 4. RISC剪切剪切mRNA pRISC裝載裝載siRNA的引導鏈而處于激活狀態(tài)，尋找和識的引導鏈而處于激活狀態(tài)，尋找和識別與之匹配的別與之匹配的mRNA，對，對mRNA進行剪切，這一過程與進行剪切，這一過程與前面提及的對前面提

33、及的對siRNA過客鏈的剪切過程類似。過客鏈的剪切過程類似。 pRISC剪切剪切mRNA可可以重復使用；可可以重復使用；p RISC剪切剪切mRNA位點一般處于位點一般處于siRNA的的5端數(shù)起的端數(shù)起的第第11個到第個到第12個堿基相對應的位置。個堿基相對應的位置。 p剪切過程不依賴于剪切過程不依賴于ATP的，但是有的，但是有ATP存在的情況存在的情況下，下，ATP可能促可能促 進進RISC對對mRNA剪切后產(chǎn)物的釋放，剪切后產(chǎn)物的釋放，或使或使RISC回復構象準備第二次剪切，回復構象準備第二次剪切， RNAi的機制的機制RNAiRNAi的放大效應機制的放大效應機制siRNA不僅可引導不僅可

34、引導RISC切割靶切割靶RNA，而且可作為引，而且可作為引物在物在RNA依賴的依賴的RNA聚合酶聚合酶(RdRP)作用下以靶作用下以靶mRNA為模板合成新的為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈新合成的長鏈dsRNA同樣可被同樣可被RNase樣核酸酶切割、樣核酸酶切割、降解而生成大量的降解而生成大量的次級次級siRNA。次級。次級siRNA又可進入又可進入合成合成-切割的循環(huán)過程，進一步放大切割的循環(huán)過程，進一步放大RNAi作用。這種作用。這種合成合成-切割的循環(huán)過程稱為切割的循環(huán)過程稱為隨機降解性隨機降解性PCR（random degradative PCR）。）。Gisela Storz,

35、 Science, 296(5571):1263-1265, 2002.RNAi 的特點PTGS 是指轉基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉錄，但在細胞質里卻無相應的mRNA 存在這一現(xiàn)象 能夠非常特異地降解與之序列相應的單個內(nèi)源基因的mRNA RNAi 的特點相對少量的dsRNA就可以使相應的基因表達受抑制 RNAi基因表達的效應可以突破細胞的界限，傳遞給子一代 (可遺傳給F1，但F2往往恢復為野生型。)RNA i應用應用1. RNA干擾介導的細胞發(fā)育調控干擾介導的細胞發(fā)育調控 n線蟲中調節(jié)幼蟲發(fā)育的線蟲中調節(jié)幼蟲發(fā)育的Lin14 基因受到基因受到Lin4基因基因控制。控制。Lin4基因基因轉錄物經(jīng)

36、轉錄物經(jīng)Dicer酶切割后產(chǎn)生一種由酶切割后產(chǎn)生一種由22個核苷酸組成的個核苷酸組成的miRNA，然，然后該后該miRNA可以和可以和Lin14 mRNA3 端非翻譯區(qū)中存在的端非翻譯區(qū)中存在的7個重復序個重復序 列互補配對，導致該列互補配對，導致該mRNA的降解。的降解。 n人類細胞中存在幾百種不同的人類細胞中存在幾百種不同的miRNA，它們形成了一個十分復，它們形成了一個十分復雜的調控網(wǎng)絡，在發(fā)育時間調控、造血細胞分雜的調控網(wǎng)絡，在發(fā)育時間調控、造血細胞分 化、細胞繁殖、細化、細胞繁殖、細胞凋亡、組織發(fā)育等過程中扮演重要的角色。胞凋亡、組織發(fā)育等過程中扮演重要的角色。 n果蠅中也發(fā)現(xiàn)果蠅中

37、也發(fā)現(xiàn)miRNA調控一套特殊的基因，使其在細胞發(fā)育過調控一套特殊的基因，使其在細胞發(fā)育過程中適時表達程中適時表達 2. RNA干擾和病毒防御干擾和病毒防御 pRNA沉默是植物和無脊椎動物主要的病毒防御機制；沉默是植物和無脊椎動物主要的病毒防御機制； p病毒本身既是病毒本身既是 RNA干擾的誘導物，又是干擾的誘導物，又是RNA干擾的攻擊干擾的攻擊目標；目標； p病毒為了抵抗病毒為了抵抗RNA干擾的攻擊，普遍編碼了干擾的攻擊，普遍編碼了RNA干擾的干擾的抑制蛋白抑制蛋白 。p迄今為止未發(fā)現(xiàn)在病毒感染哺乳動物細胞過程中能自然迄今為止未發(fā)現(xiàn)在病毒感染哺乳動物細胞過程中能自然誘發(fā)有效的防御病毒的誘發(fā)有效

38、的防御病毒的RNA干擾反應。干擾反應。 3. 基因治療：基因治療： 在利用在利用RNAi技術對技術對HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等進行基因治療等進行基因治療研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作為抑制序列可在抑制病毒復制的同時避免對正常組織的毒副作用。為抑制序列可在抑制病毒復制的同時避免對正常組織的毒副作用。同時將抑制序列選擇在特定的位點，可對部分有明確基因突變同時將抑制序列選擇在特定的位點，可對部分有明確基因突變的的惡性腫瘤惡性腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡誘導作用以及抑制細胞產(chǎn)生凋亡誘導作用以及抑制MDR 基因。

39、 科學家們已經(jīng)應用科學家們已經(jīng)應用RNA干擾技術，在多種不同的動物疾病模型干擾技術，在多種不同的動物疾病模型中獲得了良好療效。目前，中獲得了良好療效。目前，6種基于該技術的藥物已經(jīng)在美國進種基于該技術的藥物已經(jīng)在美國進入入II期臨床試驗。期臨床試驗。4. RNAi在探索基因功能中的應用：在探索基因功能中的應用：n在在RNAi技術出現(xiàn)以前，基因敲除（技術出現(xiàn)以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反）是主要的反向遺傳學（向遺傳學（reverse genetics）研究手段，但其技術難度較高、操作）研究手段，但其技術難度較高、操作復雜、周期長。復雜、周期長。n 由于由于RNAi技術可以

40、利用技術可以利用siRNA或或siRNA表達載體快速、經(jīng)濟、表達載體快速、經(jīng)濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。同時索基因功能的重要研究手段。同時siRNA表達文庫構建方法的建表達文庫構建方法的建立，使得利用立，使得利用RNAi技術進行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉技術進行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉導通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點有重要意義。導通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點有重要意義。 總總 述述 J植物、動物、人類都存在植物、動物、人類都存在RNA干擾現(xiàn)象，干擾現(xiàn)象，RNA干擾已經(jīng)作為一

41、種干擾已經(jīng)作為一種強大的強大的“基因沉默基因沉默”技術而出現(xiàn)。技術而出現(xiàn)。JRNAi技術與基因組學、蛋白質組學和功能蛋白質組學密切相關，技術與基因組學、蛋白質組學和功能蛋白質組學密切相關，因此，因此， RNAi本身可作為一項實驗技術為生物工程及制藥業(yè)等相關本身可作為一項實驗技術為生物工程及制藥業(yè)等相關行業(yè)服務，從而在更深更廣的領域發(fā)揮其作用。行業(yè)服務，從而在更深更廣的領域發(fā)揮其作用。J動物實驗已證明，可以通過動物實驗已證明，可以通過RNAi的方法使導致血膽固醇升高的基的方法使導致血膽固醇升高的基因因“沉默沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代謝性疾病等方面的臨床；病毒性疾病，眼疾，心血管代謝性疾病

42、等方面的臨床試驗也正在進行中；這一方法為病毒性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類試驗也正在進行中；這一方法為病毒性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類頑疾的治療指了一條新路頑疾的治療指了一條新路 。RNA干干 擾的治療技術正在進入人體試驗階段，擾的治療技術正在進入人體試驗階段，不過還有一些不過還有一些難題難題有待解決有待解決:如何在生物體內(nèi)如何在生物體內(nèi) 實現(xiàn)有效的組織特異性的實現(xiàn)有效的組織特異性的siRNA轉轉染染;如何降低這種療法對目的基因以外的其他基如何降低這種療法對目的基因以外的其他基 因的影因的影響，從而避免產(chǎn)生副作用響，從而避免產(chǎn)生副作用;如何實現(xiàn)如何實現(xiàn)RNA干擾效應在細胞與細胞、組織與組織干擾效應在

43、細胞與細胞、組織與組織 間的系統(tǒng)性擴散等。間的系統(tǒng)性擴散等。 反義核酸及藥物 一、反義核酸概述： 反義核酸反義核酸（antisense nucleic acid）是指與體內(nèi)某RNA或DNA序列具有互補順序并能通過堿基配對與互補鏈雜交從而影響其目的基因表達的RNA或DNA片段。 反義核酸與目的 反義核酸也稱反義寡核苷酸，最初是指與單鏈RNA互補的一段寡核苷酸序列。 反義抑制機理：目前普遍認為反義核酸可以在復制、轉錄、表達3個水平上發(fā)揮作用。其機制為：(1)在細胞核內(nèi)以堿基配對原理與基因組DNA 結合，從復制與轉錄水平發(fā)揮反義阻止作用,這種反義技術稱為“反基因治療”(Anti-genetherap

44、y); (2)與引物結合,從而在復制水平上阻止基因表達; (3)與mRNA 的5末端的SD(Shine-Dalgarno)序列或核糖體結合位點結合,阻礙核糖體的結合,從而阻礙翻譯,或使反義RNA 與mRNA 形成雙鏈,以被水解酶水解; (4)與mRNA 的SD 序列上游的非編碼區(qū)結合，改變mRNA 的二級結構，從而阻礙核糖體的結合; (5)與mRNA 的5末端編碼區(qū)(主要是起始密碼AUG) 結 合，阻止RNA 的翻譯; (6)作用于mRNA 的poly A 形成位點， 阻止成熟和轉運; (7)作用于mRNAR 的5末端，阻止帽子結構的形成;(8)結合到前體RNA的外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū),阻止其剪切成熟; 二、反義核酸技術與藥物反義核酸技術是指根據(jù)堿基互補原理，用人工合成或生物體合成的特定互補的DNA或RNA片段（或其化學修飾產(chǎn)物）抑制或封閉目的基因表達的技術。它包括反義RNA、反義DNA和肽核酸三大技術。第一代反義寡核苷酸藥物硫代修飾寡聚核苷酸；第二代反義寡