醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)五年制本科使用） 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系組編 2005年12月 第一章 外周血常規(guī)檢驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)【檢驗(yàn)流程】 熟悉檢驗(yàn)方法及原理 試劑配制及準(zhǔn)備標(biāo)本采集及處理白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白測(cè)定血小板計(jì)數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果綜合評(píng)價(jià)及臨床意義探討實(shí)驗(yàn)一 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)【目的】 掌握顯微鏡紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（red blood cell count）方法?！驹怼?用等滲稀釋液將血液稀釋一定的倍數(shù)，充入計(jì)數(shù)池后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定體積內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量，經(jīng)換算求出每升血液中的紅細(xì)胞數(shù)量?！酒鞑摹?顯微鏡、改良Neubauer計(jì)數(shù)板、試管、微量吸管、玻璃棒?！驹噭?紅細(xì)胞稀釋液（

2、Hayem液）：氯化鈉1.0g，結(jié)晶硫酸鈉5.0g（或無(wú)水硫酸鈉2.5g）蒸餾水加至200ml。溶解后加20g/l伊紅溶液1滴，過(guò)濾后使用?！緲?biāo)本】 外周血或抗凝血（EDTA抗凝）。【操作】 1 稀釋液 取小試管1支，加紅細(xì)胞稀釋液2ml。2加血 用清潔干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，檫去管外余血，輕輕加至紅細(xì)胞稀釋液底部，再輕吸上清夜清洗吸管23次，立即混勻。3充池 混勻或用微量吸管或玻璃棒將紅細(xì)胞懸液充入計(jì)數(shù)池，室溫下平放35min，待細(xì)胞下沉后于顯微鏡下計(jì)數(shù)。4計(jì)數(shù) 用高倍鏡依次計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)4角和正中5個(gè)方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)。5計(jì)算 紅細(xì)胞/L=N×25/5×

3、10×106×200=N×1010=N/100×1012 N ： 表示5個(gè)方格內(nèi)數(shù)得的紅細(xì)胞數(shù)。 25/5 ：將5個(gè)大方格內(nèi)數(shù)得的紅細(xì)胞數(shù)換算成1個(gè)大方格的紅細(xì)胞數(shù)。 ×10 ：將1個(gè)大方格紅細(xì)胞換算成1ul血液內(nèi)紅細(xì)胞。×106：1L106ul200：為血液的稀釋倍數(shù)。【注意事項(xiàng)】1 采血時(shí)不能過(guò)分?jǐn)D壓采血部位，針刺部位深度必須適當(dāng)。2 采血應(yīng)順利、準(zhǔn)確，采血部位不得有水腫、發(fā)紺、凍瘡、炎癥等。紅細(xì)胞數(shù)量增高時(shí)可適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)。3 大小方格內(nèi)壓線細(xì)胞的計(jì)數(shù)遵循數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則。避免多數(shù)或漏數(shù)。4 稀釋液要過(guò)濾，小試管、

4、計(jì)數(shù)板均須清潔干燥，以免雜質(zhì)、微粒等被誤認(rèn)為是細(xì)胞。5 如無(wú)上述稀釋液時(shí)，也可用新鮮配制的等滲鹽水代替。6 將細(xì)胞懸液充入計(jì)數(shù)池時(shí)要一次完成，不能產(chǎn)生滿溢、氣泡、或充池不足的現(xiàn)象。7 紅細(xì)胞在計(jì)數(shù)池中若分布不均，每個(gè)方格之間相差超過(guò)20個(gè)以上時(shí)要重新充池計(jì)數(shù)。正常數(shù)值范圍內(nèi)，2次紅細(xì)胞計(jì)數(shù)相差不得超過(guò)5%。【方法學(xué)評(píng)價(jià)】 目視計(jì)數(shù)法是傳統(tǒng)的的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法，不需要特殊設(shè)備，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。【質(zhì)量控制】1計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)在細(xì)胞計(jì)數(shù)的評(píng)價(jià)中，多采用兩差比值（r）評(píng)價(jià)。2稀釋造成稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確的常見(jiàn)原因有：稀釋液或血液加樣不準(zhǔn)確。吸血時(shí)吸管內(nèi)有氣泡。未檫去吸管外血。血液加入稀釋液時(shí)使上清液渾濁，血液被吸管帶

5、出。稀釋液放置的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蒸發(fā)濃縮?！緟⒖贾怠?成年男性：（4.05.5）×1012。成年女性：（3.55.0）×1012。新生兒： （6.07.0）×1012。實(shí)驗(yàn)二 血紅蛋白測(cè)定氰花高鐵血紅蛋白測(cè)定法【目的】 掌握氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）測(cè)定方法?！驹怼?在血紅蛋白轉(zhuǎn)化液中，除硫化血紅蛋白外，其余血紅蛋白均可被高鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白，再與氰離子（CN-）結(jié)合，生成穩(wěn)定的復(fù)合物氰化高鐵血紅蛋白（hemoglobin cyanide，HiCN）。棕紅色的氰化高鐵血紅蛋白在波長(zhǎng)540nm處有吸收峰，可用校正的高精密分光光度計(jì)進(jìn)行直接定量測(cè)定，或用HiCN

6、參考液進(jìn)行比色法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)本的吸光度即可求出血紅蛋白濃度?！酒鞑摹?一次性消毒采血針，微量吸管，試管。5ml移液管，75%（V/V）乙醇棉球，無(wú)菌干棉球，分光光度計(jì)，試管?！驹噭?HiCN轉(zhuǎn)化液（文齊液）氰化鉀（KCN）50mg，高鐵氰化鉀K3Fe（CN）6200mg，無(wú)水磷酸二氫鉀（KH2PO4）140mg，Triton X 100 1.0ml，蒸餾水加至1000ml，糾正pH至7.07.4。此液淡黃色透明溶液，用蒸餾水調(diào)零，比色杯徑1.000cm，波長(zhǎng)540nm處的吸光度應(yīng)<0.001。貯存在棕色有塞玻璃瓶中，放4冰箱保存，一般可保存數(shù)月。如發(fā)現(xiàn)試劑變綠、渾濁不能使用。2HiCN

7、標(biāo)準(zhǔn)液（200g/L）商品試劑?！緲?biāo)本】 外周血?！静僮鳌?直接定量測(cè)定（1）加轉(zhuǎn)化液：試管內(nèi)加5mlHiCN轉(zhuǎn)化液。（2）采血與轉(zhuǎn)化：取全血20ul，加到盛有轉(zhuǎn)化液的試管底部，用上清液反復(fù)沖洗吸管3次，充分混合，靜置5min。（3）測(cè)定：以符合WHO標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計(jì)（常規(guī)測(cè)定時(shí)帶寬應(yīng)小于6cm）。波長(zhǎng)540nm處，光徑（比色杯內(nèi)徑）1.000cm，HiCN轉(zhuǎn)化液或蒸餾水調(diào)零，測(cè)定吸光度（A）。（4）計(jì)算：根據(jù)標(biāo)本的吸光度（A）直接計(jì)算出血紅蛋白濃度（g/L）。血紅蛋白（g/L）=A×64458/44000×251+A×367.7A： 540nm處測(cè)定管吸光度。6

8、4458：目前國(guó)際公認(rèn)的血紅蛋白平均相對(duì)分子量。44000：1965年國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSH）公認(rèn)的血紅蛋白摩爾消光系數(shù)。251：稀釋倍數(shù)。2HiCN標(biāo)準(zhǔn)液比色法測(cè)定（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和K值計(jì)算。用HiCN標(biāo)準(zhǔn)液倍比稀釋后（50g/L、100g/L、150g/L、200g/L），在所用的分光光度計(jì)上（相當(dāng)540nm處）分別測(cè)定各稀釋度的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品血紅蛋白含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蚯蟪龃藫Q算常數(shù)K。（2） 標(biāo)本的血紅蛋白轉(zhuǎn)化和比色同直接測(cè)定，得到標(biāo)本的吸光度（A）。（3） 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)樣本的血紅蛋白濃度或用K值來(lái)計(jì)算血紅蛋白濃度，即Hb（g/L）=K

9、×A例，如倍比稀釋后HiCN標(biāo)準(zhǔn)液50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，分別測(cè)得540nm處的吸光度為0.13、0.27、0.41、0.54，標(biāo)本的吸光度為0.32。先求K值，再計(jì)算出標(biāo)本的血紅蛋白濃度（g/L）。 K=Hb/A=50+100+150+200/0.13+0.27+0.41+0.54=370.37Hb=370.37×0.32=118.52（g/L） 【注意事項(xiàng)】1 血紅蛋白測(cè)定方法很多。但無(wú)論采用何種方法，都必須以HiCN法為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線或K值應(yīng)定期檢查，并與分光光度計(jì)相配。2 標(biāo)準(zhǔn)微量吸管必須經(jīng)過(guò)水銀稱重法校正。加液必須準(zhǔn)確，

10、血液與轉(zhuǎn)化液充分混勻?？捎醚t蛋白代替抗凝血進(jìn)行鑒定。3 HiCN轉(zhuǎn)化液不能貯存在塑料瓶中，否則會(huì)使CN-丟失，測(cè)定結(jié)果偏低。HiCN轉(zhuǎn)化液應(yīng)貯存在棕色他塞是玻璃瓶中，4冰箱保存一般可用數(shù)月，但不能在0以下保存，因?yàn)榻Y(jié)冰可引起高鐵氰化鉀還原，使轉(zhuǎn)化液褪色失效。HiCN轉(zhuǎn)化液是一種低離子強(qiáng)度而pH又近中性的溶液，遇到白細(xì)胞過(guò)多或異常球蛋白增高的血液標(biāo)本，HiCN比色液會(huì)出現(xiàn)渾濁。若因白細(xì)胞過(guò)多引起的渾濁，可離心后去上清液比色；若因球蛋白異常增高（如肝硬化者）引起的渾濁，可向比色液中加如少許固體氯化鈉或碳酸鉀，混勻后可使溶液澄清。氰化鉀是劇毒品，配置轉(zhuǎn)化液時(shí)要按劇毒品管理程序操作。配制好的HiCN

11、轉(zhuǎn)化液中因氰化鉀含量低，又有高鐵氰化鉀存在。毒性不是很大。若進(jìn)入人體寧日，高鐵氰化鉀氧化血紅蛋白，生成高鐵血紅蛋白。后者結(jié)合CN-，起到一定的解毒作用，但仍應(yīng)妥善保管。測(cè)定后的廢液不能與酸性溶液混合，因?yàn)榍杌浻鏊峥僧a(chǎn)生劇毒的氰氫算氣體。為防止氰化鉀污染環(huán)境，比色測(cè)定后的廢液集中于廣口瓶中。按沒(méi)升HiCN廢液加次氯酸鈉溶液（安替福民）40ml，充分振搖混勻，敞開(kāi)容器，置室溫3h。 【方法學(xué)評(píng)價(jià)】 HiCN法操作簡(jiǎn)便，試劑單一，除SHb外所有血紅蛋白均可迅速轉(zhuǎn)化為HiCN，顯色快且穩(wěn)定（顯色后若保存得當(dāng)可達(dá)6年不褪色），可以根據(jù)吸光度直接計(jì)算結(jié)果，因此被列為國(guó)際血紅蛋白測(cè)定的參考方法，也是我國(guó)推

12、薦的首選方法，但其試劑中氰化鉀為劇毒藥品，須妥善保存，處理。另外，高鐵蛋白血癥和白細(xì)胞明顯增高的標(biāo)本可導(dǎo)致反應(yīng)液渾濁而影響結(jié)果?！举|(zhì)量控制】 若用分光光度計(jì)作精密定量測(cè)定，分光光度計(jì)的波長(zhǎng)和吸光度需要校正，帶寬應(yīng)小于1nm，比色杯光徑1.000cm，允許誤差為0.5%（即0. 9951.005），測(cè)定溫度為2025。儀器的校正是測(cè)定中的關(guān)鍵。校正大致分為以下幾個(gè)步驟。1波長(zhǎng) 將100150g/L的HiCN標(biāo)準(zhǔn)液放在待檢分光光度計(jì)中，從500600nm分幾個(gè)波段測(cè)定H iCN標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，如所測(cè)最大吸收鳳在540nm，表示分光光度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確；實(shí)際工作中對(duì)波長(zhǎng)偏差不大的分光光度計(jì)可把吸收峰波長(zhǎng)（

13、如在536nm）當(dāng)作540nm進(jìn)行測(cè)定。2HiCN吸收光譜峰值在540nm，峰谷在504nm。雜光的增加使HiCN在吸收峰處吸光度下降，而對(duì)峰谷處吸光度影響不大。設(shè)Q值為反映雜光水平的參數(shù)，Q=A540/A504，合格的分光光度計(jì)Q值應(yīng)為1.591.63。雜光可使吸收光譜的Q值減低。3比色杯 用HiCN試劑作空白，波長(zhǎng)710800nm，比色杯光徑1.000時(shí)，吸光度應(yīng)小于0.002。4 敏度和線性 用HiCN標(biāo)準(zhǔn)液倍比稀釋（應(yīng)包括高，低病理濃度）后，在數(shù)用的分光光度計(jì)上相當(dāng)540nm分別測(cè)定各稀釋度的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液血紅蛋白含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線。觀察各點(diǎn)連線是否為直線，如有個(gè)

14、別點(diǎn)不在直線上，作圖時(shí)應(yīng)使直線通過(guò)盡量多的點(diǎn)。也可用直線回歸法計(jì)算回歸曲線（y=bx+a）后作圖。將直線以外的實(shí)測(cè)吸光度與直線上理論吸光度比較，如兩者之差在5%以內(nèi)則可認(rèn)為儀器符合線性的要求。直線的最低點(diǎn)即為該儀器HiCN法的靈敏度；最低與最高點(diǎn)間的范圍即為儀器HiCN法的測(cè)定線性范圍。此外，引起測(cè)定值增高的常見(jiàn)誤差是稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，因紅細(xì)胞溶解不當(dāng)引起標(biāo)本濁度增加，血漿中脂質(zhì)或蛋白量增加?！緟⒖贾怠?成年男性：120160g/L；成年女性：110150g/L。 70歲以上老年男性：94.2122.2g/L；女性：86.5111.8g/L。 新生兒：170200g/L。實(shí)驗(yàn)三 白細(xì)胞計(jì)數(shù)【目的

15、】 掌握顯微鏡法白細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理及方法?！驹怼?用白細(xì)胞稀釋液將血液稀釋一定的倍數(shù)，同時(shí)破壞溶解紅細(xì)胞。將稀釋的血液注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定體積內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)，經(jīng)換算即可求出每升血液中的白細(xì)胞數(shù)量?！酒鞑摹?顯微鏡、改良Neubauer計(jì)數(shù)板、試管、吸管、微量吸管、滴棒?！驹噭?白細(xì)胞稀釋液：2%冰乙酸溶液中加入10g/l結(jié)晶紫（或亞甲藍(lán)）3滴?！緲?biāo)本】 新鮮全血或末梢血。【操作】1 加稀釋液 喲拗不過(guò)吸管吸取白細(xì)胞稀釋液0.38ml于小試管中。2吸取血液 用微量吸管吸取新鮮全血或末梢血20ul，查去管尖外部余血。將吸管插入小試管中白細(xì)胞稀釋液的底部，輕輕放出血液，并吸取上層白細(xì)

16、胞稀釋液清洗吸管23次。3混勻 將試管中血液與稀釋液混勻，待細(xì)胞懸液完全變?yōu)樽睾稚?充池 再次將小試管中的細(xì)胞懸液混勻。用滴棒蘸取細(xì)胞懸液1滴，充入改良Neubauer計(jì)數(shù)池中，室溫靜置23min，待白細(xì)胞完全下沉。5 計(jì)數(shù) 在低倍鏡下計(jì)數(shù)四角4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。6 計(jì)算 白細(xì)胞= 4個(gè)大方格內(nèi)白細(xì)胞數(shù)（N）×10×20×106/4=N/20×109/L【注意事項(xiàng)】1 吸管、微量吸血管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板均為計(jì)量工具，使用前需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的校正，否則將直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確。2 是用標(biāo)本可為由靜脈穿刺采取的新鮮全血，也可為靜脈末梢血。采集末梢血時(shí)，應(yīng)注意采

17、血部位不得有凍瘡、水腫、發(fā)紺、炎癥等，以免標(biāo)本失去代表性；同時(shí)也注意不能過(guò)度擠壓，以免組織液混入引起血液凝固或造成計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。3 在充池時(shí)，如充液不足、液體外溢、斷續(xù)充液，或產(chǎn)生氣泡、充液 后移動(dòng)蓋玻片等，均會(huì)使細(xì)胞分布不均勻，造成計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。4 計(jì)數(shù)池內(nèi)的細(xì)胞分布應(yīng)均勻，一般情況下各大方格間的細(xì)胞數(shù)相差不超過(guò)10%。若相差太大應(yīng)重新充池。5 計(jì)數(shù)大小方格內(nèi)的壓線細(xì)胞時(shí)，應(yīng)遵循數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則。6 白細(xì)胞數(shù)量過(guò)多時(shí)，可采用加大稀釋倍數(shù)的方法。如20ul血加入到0.78ml稀釋液中或10ul血加到0.38ml稀釋液中。7 白細(xì)胞數(shù)量過(guò)少時(shí)，可采用擴(kuò)大計(jì)數(shù)域的方法，計(jì)數(shù)8個(gè)或9

18、個(gè)大方格；也可采用減少稀釋倍數(shù)的方法。8 白細(xì)胞稀釋液不能破壞有核紅細(xì)胞，它可使白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果偏高，此時(shí)應(yīng)計(jì)算白細(xì)胞校正值（公式中的有核紅細(xì)胞是指分類100個(gè)細(xì)胞時(shí)所遇見(jiàn)的有核紅細(xì)胞）。 白細(xì)胞校正值/L=100/（100+有核紅細(xì)胞）×校正前白細(xì)胞數(shù)【方法學(xué)評(píng)價(jià)】 顯微鏡目視計(jì)數(shù)法是傳統(tǒng)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)法，簡(jiǎn)便易行，不需昂貴的儀器，可用于校正血液分析儀?？筛鶕?jù)公式計(jì)算固有誤差總變異系數(shù)。 CV=1002/nb+4.62/nc+4.72/np式中，為所數(shù)白細(xì)胞總數(shù)；n為計(jì)數(shù)板使用的次數(shù)；np所用吸管使用的次數(shù)；因此，用于標(biāo)準(zhǔn)血液分析儀時(shí)，應(yīng)在嚴(yán)格規(guī)范的田間下進(jìn)行。如操作人員的選擇、同一標(biāo)

19、本使用多只吸管、多個(gè)計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定的程度、多次重復(fù)等。這樣才能避免計(jì)數(shù)板的固有誤差、計(jì)數(shù)板和吸管的系統(tǒng)誤差和操作隨機(jī)誤差的影響，使計(jì)數(shù)結(jié)果接近真值。在實(shí)際工作中，顯微鏡目視計(jì)數(shù)法由于微量吸管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、細(xì)胞分布狀態(tài)、人為因素等影響因素，其精密度和重復(fù)性欠佳。因而目前在臨床工作中，多應(yīng)用血液分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。經(jīng)校準(zhǔn)后的血液分析儀由于其計(jì)數(shù)細(xì)胞多，易于標(biāo)準(zhǔn)化，逼供內(nèi)在嚴(yán)格質(zhì)量控制和規(guī)范的操作步驟等條件下進(jìn)行，因此，計(jì)數(shù)的精確性及準(zhǔn)確性均較高。血液分析儀檢測(cè)速度快，適合大規(guī)模健康人群的普查，但需要特殊儀器，某些人為或病理情況（如外周血出現(xiàn)有核紅細(xì)胞、巨大血小板和血小板凝集等）可

20、干擾白細(xì)胞計(jì)數(shù)。【質(zhì)量控制】 顯微鏡目視白細(xì)胞計(jì)數(shù)法質(zhì)量控制的關(guān)鍵在于掌握誤差規(guī)律，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，減少誤差，以期獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。根據(jù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與血涂片上白細(xì)胞分布密度是否相符來(lái)粗略判斷計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性的方法，是人們?cè)趯?shí)際工作中總結(jié)出來(lái)純經(jīng)驗(yàn)控制方法。另外還有幾種方法可以用來(lái)進(jìn)行一般的質(zhì)量控制與考核：常規(guī)考核標(biāo)準(zhǔn)（routine checking standard，RCS）：根據(jù)白細(xì)胞在計(jì)數(shù)池內(nèi)四個(gè)大方格里的分布情況而規(guī)定。變異百分率評(píng)價(jià)法：以測(cè)定值和靶值差值的和絕對(duì)值來(lái)表示。兩差比值評(píng)價(jià)法：兩差比值是同一標(biāo)本或同一患者在短時(shí)間內(nèi)2次計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)之差與2次計(jì)數(shù)細(xì)胞之和的標(biāo)準(zhǔn)之比。雙份計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

21、差評(píng)價(jià)法：選1020份標(biāo)本，每份重復(fù)2次計(jì)數(shù)，用雙份之差計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（s），然后求得變異系數(shù)（CV）及質(zhì)量得分?！緟⒖贾怠?成人：（410）×109/L 初生兒：（1520）×109/L 6個(gè)月2歲：（1112）×109/L。實(shí)驗(yàn)四 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)【目的】 掌握顯微鏡外周血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的方法及白細(xì)胞的在正常形態(tài)，【原理】 將血液制成分布均勻的血涂片，用瑞氏染液染色，根據(jù)各類細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和顏色差異將白細(xì)胞進(jìn)行分；類并計(jì)數(shù)。通常分類100個(gè)白細(xì)胞，計(jì)算得出各種白細(xì)胞所占的百分率?！酒鞑摹?顯微鏡、分類計(jì)數(shù)器、香柏油、拭鏡紙、清潔液?！驹噭?瑞氏染液、磷酸鹽緩沖液（

22、pH6.46.8）。【標(biāo)本】 制備良好的血涂片?！静僮鳌? 染色 將血涂片用瑞氏染液染色，沖洗干凈，自然干燥后待用。2 低倍鏡觀察 低倍鏡下觀察白細(xì)胞的分布和染色情況。3 油鏡觀察 選擇涂片體尾交界處細(xì)胞分布均勻、著色良好的區(qū)域，按一定的方向順序?qū)λ?jiàn)到的每一個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類，并用白細(xì)胞分類記數(shù)器作好記錄，共計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞。4 計(jì)算 求出各類白細(xì)胞所占百分率?！咀⒁馐马?xiàng)】1由于各種白細(xì)胞體積大小不等、體積較小的淋巴細(xì)胞在血涂片的頭、體部較多，而尾部和兩側(cè)以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞較多，因此分類最佳區(qū)域?yàn)轶w、尾交界處。2分類時(shí)要有秩序地、沿一定方向地連續(xù)進(jìn)行。既不重復(fù)亦不遺漏，避免主觀選擇視野。

23、3分類計(jì)數(shù)結(jié)果的記錄也可采用手工畫(huà)“正”或“+”的方法。4白細(xì)胞總數(shù)在（3.015.0）×109/L之間者，分類計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞?？倲?shù)在15.0×109/L以上時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞，而總數(shù)低于3.0×109/L時(shí)。則應(yīng)選用2張涂片計(jì)數(shù)50100個(gè)白細(xì)胞。5白細(xì)胞所占百分率，乘以白細(xì)胞總數(shù)，即可求出每升血液中各類白細(xì)胞數(shù)量的絕對(duì)值。6分類中如見(jiàn)血涂片上有幼紅細(xì)胞，應(yīng)逐個(gè)計(jì)數(shù)但不計(jì)入100個(gè)白細(xì)胞內(nèi)，以分類100個(gè)白細(xì)胞見(jiàn)到幼紅細(xì)胞多少個(gè)來(lái)報(bào)告，并應(yīng)注明其所屬階段。7分類中還應(yīng)注意觀察成熟紅細(xì)胞和血小板的形態(tài)、染色及其分布情況，注意有無(wú)寄生蟲(chóng)（如虐原蟲(chóng)）及其他異

24、常所見(jiàn)?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 顯微鏡法白細(xì)胞分類是經(jīng)典、傳統(tǒng)的血細(xì)胞分類法，目前還無(wú)任何儀器可以完全取代。它能夠準(zhǔn)確得根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，并可及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞。血液分析儀進(jìn)行細(xì)胞分類主要是從細(xì)胞的體積大小、細(xì)胞核形、細(xì)胞化學(xué)染色等方面進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)速度快，分析細(xì)胞多，適宜于大批量標(biāo)本的篩檢。對(duì)其篩檢出來(lái)的異常標(biāo)本，要準(zhǔn)確識(shí)別細(xì)胞類別及確認(rèn)病理改變還必須以顯微鏡檢查為準(zhǔn)?！緟⒖贾怠?見(jiàn)下表表：正常成人外周血白細(xì)胞分類參考值白細(xì)胞分類百分率（）分?jǐn)?shù)數(shù)絕對(duì)值（×109）中性桿狀核粒細(xì)胞150.010.050.040.50中性分葉核粒細(xì)胞50700.50.727嗜酸性粒細(xì)胞0.550.0

25、050.050.020.50嗜堿性粒細(xì)胞0100.0101淋巴細(xì)胞20400.200.400.84.0單核細(xì)胞380.030.080.120.80實(shí)驗(yàn)五 血小板計(jì)數(shù)【目的】 掌握血小板的顯微鏡目視技術(shù)方法?！驹怼?血液經(jīng)稀釋液按一定比例稀釋和破壞紅細(xì)胞后，充入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定范圍內(nèi)的血小板數(shù)量，經(jīng)過(guò)換算求出每升血液中血小板的數(shù)量?！酒鞑摹?顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，采血針，血紅蛋白吸管，試管【試劑】 10g/L草酸銨稀釋液（草酸銨10g，EDTANa20.12g溶于1000ml蒸餾水中，混勻）【標(biāo)本】 外周血【操作】1 吸取稀釋液 準(zhǔn)確吸取10g/L草酸銨稀釋液0.38ml置于

26、清潔小試管中。2 采血 常規(guī)消毒無(wú)名指，穿刺后，讓血液自然流出，準(zhǔn)確采血20ul置于含有草酸銨的稀釋液中，立即充分混勻。3 稀釋靜置 待完全溶血后再混勻1min，置室溫10min。4 充液靜置 取混勻的血小板懸液1滴充入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，靜置1015min，使血小板充分下沉?？諝飧稍锏募竟?jié)應(yīng)將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置濕盒內(nèi)。5 計(jì)數(shù) 用高倍鏡計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央大方格內(nèi)的四角和中央共5個(gè)中方格內(nèi)血小板數(shù)量。6 計(jì)算 每升血小板數(shù)5個(gè)中方格內(nèi)血小板數(shù)×109/L?！咀⒁馐马?xiàng)】1稀釋液要清潔，無(wú)細(xì)菌、塵埃等污染。存放時(shí)間較長(zhǎng)后應(yīng)過(guò)濾后再使用。2毛細(xì)血管采血時(shí)，針刺應(yīng)達(dá)3mm深，使血液流暢。拭去第一滴

27、血后立即采血，以防止血小板聚集和破壞。如果同時(shí)做白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先采血做血小板計(jì)數(shù)。3血液加入血小板稀釋液內(nèi)要充分混勻，但不可過(guò)度振蕩，以免導(dǎo)致血小板破壞和聚集。4血小板懸液充入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)需要靜置1015min，使血小板完全下沉后再計(jì)數(shù)。但應(yīng)注意保持濕度，避免水分蒸發(fā)而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。5計(jì)數(shù)時(shí)光線不可太強(qiáng)，注意微有折光性的血小板與塵埃等的鑒別，附著在血細(xì)胞旁的血小板也要注意，不要漏計(jì)。6應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)計(jì)數(shù)完畢，否則結(jié)果偏低。7所用計(jì)量器材必須標(biāo)準(zhǔn)化。8檢查前，患者應(yīng)避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板藥物?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 目前血小板計(jì)數(shù)方法主要有兩大類，血小板分析儀法和目視顯微鏡計(jì)數(shù)法（

28、普通光學(xué)顯微鏡和相差顯微鏡目視計(jì)數(shù)法）。顯微鏡血小板計(jì)數(shù)法以草酸銨法為參考方法。草酸銨稀釋液為首選的稀釋液（其對(duì)紅細(xì)胞破壞力強(qiáng)，血小板清楚）。血液分析儀法由于重復(fù)性好目前逐漸普及。但由于血液分析儀不能完全將血細(xì)胞與其他類似大小的物質(zhì)區(qū)別開(kāi)來(lái)，因此計(jì)數(shù)結(jié)果有時(shí)仍需目視顯微鏡計(jì)數(shù)法作校正，因而國(guó)內(nèi)外仍將目視顯微鏡計(jì)數(shù)法（特別是相差顯微鏡計(jì)數(shù)法）作為參考方法?！举|(zhì)量控制】1 定期檢查稀釋液的質(zhì)量，檢測(cè)前先作稀釋液空白計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)值為零時(shí)方可充液計(jì)數(shù)。2 在充液之前，必須輕輕搖動(dòng)標(biāo)本2min或200次以上，但用力不宜造成血小板破壞或產(chǎn)生氣泡，引起計(jì)數(shù)誤差。3 血小板如成族分布，應(yīng)重新采血復(fù)查。溶血欠佳時(shí)

29、，應(yīng)更換稀釋液或用200倍稀釋法計(jì)數(shù)整個(gè)中間大方格內(nèi)的全部血小板數(shù)，最后計(jì)算出每升血液中的血小板數(shù)量。4 如果血小板懸液沖入計(jì)數(shù)板后時(shí)間較長(zhǎng)，血小板會(huì)失去光澤而不易辨認(rèn)，因此應(yīng)掌握好計(jì)數(shù)時(shí)間。5 每份標(biāo)本最好計(jì)數(shù)2次，若計(jì)數(shù)之差在10以內(nèi)，取其均值報(bào)告。若計(jì)數(shù)之差大于10，應(yīng)作第3次計(jì)數(shù)，取2次相近結(jié)果的均值報(bào)告。6 草酸銨質(zhì)量必須是AR級(jí)或GR級(jí)，若用CP級(jí)溶血效果差。【參考值】 （100300）×109/L第二章 尿液常規(guī)檢驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)【檢驗(yàn)流程】熟悉檢驗(yàn)方法及原理試劑配制及準(zhǔn)備標(biāo)本采集及處理尿液有形成分檢查尿液化學(xué)檢查尿液理學(xué)檢查檢驗(yàn)結(jié)果綜和平價(jià)及臨床意義探討實(shí)驗(yàn)一 尿葡萄糖

30、定性檢查一班氏法【目的】 掌握尿葡萄糖定性的班氏（Benidict）法。【原理】 葡萄糖或其他還原糖的醛基在熱堿性溶液中，能將班氏試劑的蘭色硫酸銅還原為黃色的氫氧化亞銅，進(jìn)而形成紅色氧化亞銅沉淀。【器材】 試管架、中試管（12mm×100mm）、滴管、試管夾、酒精燈?！驹噭?甲液 枸櫞酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）8.5g，無(wú)水碳酸鈉76.4g，蒸餾水700ml，加熱助溶。2乙液 硫酸銅（CuSO4·5H2O）13.4g，蒸餾水100ml，加熱助溶。冷卻后，將乙液緩慢加入甲液中，不段混勻，冷卻至室溫后補(bǔ)充蒸餾水1000ml/、。如溶液不透明則需要過(guò)濾，煮沸

31、后出現(xiàn)沉淀或變色則不能應(yīng)用。【標(biāo)本】 新鮮尿液。【操作】 1鑒定班氏試劑質(zhì)量 取中號(hào)試管1支，加入班氏試劑2.0ml，搖動(dòng)試管徐徐加熱至沸騰，觀察試劑有無(wú)顏色及性狀變化，若試劑仍為透明藍(lán)色，可進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。2尿液 向班氏試劑中加離心后的尿液0.2ml（約4滴），混勻。3加熱煮沸 繼續(xù)煮沸12min，或置沸水浴5min。自然冷卻。4判斷結(jié)果 判斷結(jié)果見(jiàn)下表表 班氏法糖定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷 反應(yīng)現(xiàn)象報(bào)告方式葡萄糖含量（mmol/L）藍(lán)色不變 5.6藍(lán)色中略帶綠色，但無(wú)沉淀 +- 5.611.2藍(lán)色，伴少許黃綠色沉淀 + 28較多黃綠色沉淀，以黃為主 + 2856土黃色渾濁，有大量沉淀 + 57112大

32、量棕紅色或磚紅色沉淀 + 112【注意事項(xiàng)】1 試劑與尿液的比例為10：1。2 煮沸時(shí)應(yīng)不時(shí)搖動(dòng)試管以防爆沸噴出，也可在沸水浴中實(shí)驗(yàn)。3 檢驗(yàn)糖尿病患者尿液中的葡萄糖，應(yīng)空腹或餐后2h留取尿標(biāo)本。4 尿液中有大量尿酸鹽存在，煮沸后呈渾濁并帶綠色，但久置后并不變黃色而 呈灰藍(lán)色，故必須于冷卻后觀察結(jié)果。尿中含大量氨鹽時(shí)可抑制氧化亞銅沉淀的生成，應(yīng)加堿煮沸除去。蛋白含量較高時(shí)也影響銅鹽的沉淀，可用加熱乙酸法除去。5 一些非糖還原性物質(zhì)，如水合氯醛、氨基比林、PAS、阿司匹林、青霉素、鏈霉素、VitC、異煙肼等，當(dāng)其在尿中含量過(guò)高時(shí)亦呈陽(yáng)性反應(yīng)，應(yīng)停藥3d后再行檢查。對(duì)靜脈輸入大量VitC 者5d內(nèi)

33、不宜做尿糖定性，或定性時(shí)先將尿液煮沸使之分解破壞?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 尿糖定性方法有班氏法和干化學(xué)試帶法。班氏法穩(wěn)定，靈敏度為5.5mmol/L，但都缺乏特異性。尿中其他糖類（果糖、乳糖、戊糖等）和許多還原性物質(zhì)（肌酐、尿酸、Vit C等）都可起反應(yīng)，因此容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。本法逐漸被葡萄糖氧化酶試帶法取代。【質(zhì)量控制】1 容器要清潔，不含氧化性物質(zhì)，最好使用一次性尿杯。2 如氣溫較高，標(biāo)本不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，以免細(xì)菌繁殖消耗尿中葡萄糖，造成假陰性。3 消除VitC的干擾，VitC對(duì)于實(shí)驗(yàn)有影響，因此注射大劑量VitC后5d內(nèi)不做尿糖定性。如確實(shí)需要測(cè)定，則需注明用藥劑量及時(shí)間，以便采取措施消除VitC的

34、干擾，最簡(jiǎn)單的處理方法是先將尿液煮沸幾分鐘后再進(jìn)行測(cè)定。4 在規(guī)定時(shí)間內(nèi)判斷結(jié)果，班氏法需待反應(yīng)物自然冷卻后觀察?！緟⒖贾怠?陰性。二干化學(xué)試帶法【目的】 掌握尿葡萄糖定性的干化學(xué)試帶法?！驹怼?尿液中葡萄糖使尿液?jiǎn)温?lián)或多聯(lián)試帶上的特殊試帶模塊顏色發(fā)生變化，呈色深淺與中葡萄糖濃度成正比。【器材】 尿糖測(cè)定單聯(lián)或多聯(lián)干化學(xué)試帶（附標(biāo)準(zhǔn)色板），尿液8項(xiàng)（或11項(xiàng)）分析儀，以及與之配套的干化學(xué)試帶等?！緲?biāo)本】 新鮮尿液。【操作】 取試帶1條，浸入尿液5s后取出。1min內(nèi)在自然光或日光燈光線下與標(biāo)準(zhǔn)色板比色，或以尿液分析儀比色并打印結(jié)果。以鄰聯(lián)甲苯氨試帶法為例。目測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)下表。表 試帶法葡

35、萄糖定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷反應(yīng)現(xiàn)象報(bào)告方式約含葡萄糖量（mmol/L）不變色 2.2淺灰色+5.5灰色+14.0灰藍(lán)色+28.0紫藍(lán)色+112.0【注意事項(xiàng)】1試帶應(yīng)避光干燥保存。2靈敏度受尿比密及溫度的影響，濃縮尿靈敏度低，溫度高時(shí)靈敏度高。3本法也受VitC等還原物質(zhì)的影響，處理方法同班氏法?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 干化學(xué)試帶法較班氏法更為靈敏（2.2mmol/L）、簡(jiǎn)便、快速，特異性高，具有半定量作用?？梢阅繙y(cè)，也可用于尿自動(dòng)分析儀，但尿中含有VitC等還原物質(zhì)時(shí)，將與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)過(guò)氧化酶而使結(jié)果呈假陰性。另外，高濃度酮體、高比密尿均可減低試帶的靈敏度，但該法極少出現(xiàn)假陽(yáng)性。除上述2種尿糖定性方法外，薄

36、層層析法是鑒別、驗(yàn)證尿糖種類的特異性方，但操作繁瑣，不適合臨床常規(guī)標(biāo)本的測(cè)定?！举|(zhì)量控制】1 容器要清潔，不含氧化性物質(zhì)，最好用一次性尿杯。2 如氣溫教高，標(biāo)本不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，以免細(xì)菌繁殖消耗尿中的葡萄糖，造成假陰性結(jié)果。3 VitC對(duì)測(cè)定有影響，注射大劑量VitC后5d內(nèi)不做尿糖定性。如確實(shí)需要測(cè)定，則應(yīng)先將尿液煮沸幾分鐘后再進(jìn)行測(cè)定。4 注意高比密尿或高酮體尿?qū)υ噹Хǖ挠绊?。必要時(shí)可用班氏法輔助確定陽(yáng)性程度。5 尿糖定性實(shí)驗(yàn)只是作為糖尿病的篩查實(shí)驗(yàn)，如需要確診或進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，必須結(jié)合血糖定量檢查。6 陽(yáng)性質(zhì)控的使用，低濃度質(zhì)控液（葡萄糖3g/L）定性為（+），高濃度質(zhì)控液（15g/L）定性

37、為（+）。【參考值】 陰性實(shí)驗(yàn)二 尿酮體定性實(shí)驗(yàn)一、改良Rothera法【目的】 掌握改良Rothera尿酮體定性的方法及注意事項(xiàng)?！驹怼?亞硝酸鐵氫化鈉Na2Fe（CN）5·2H2O遇尿分解為Na4Fe（CN）6、NaNO2、Fe（OH）3和Fe（CN）5 3-。如尿中存在可檢出量的酮體（NH2OON=）后者與Fe（CN）5 3-生成紫紅色化合物?！酒鞑摹?試管或載玻片、藥匙、滴管?！驹噭?亞硝基氫化鈉0.5g（AR），無(wú)水碳酸鈉10g（AR），硫酸銨10g（AR），試劑必須純而無(wú)水，配置前分別將各試劑烘干、稱量并研磨混勻。密閉存于棕色磨口瓶?jī)?nèi)，防止受潮。【標(biāo)本】 新鮮尿液。【

38、操作】 1 加入酮體粉 于載玻片上（或試管內(nèi)），加入1小勺酮體粉。2 加尿液 滴加尿液于酮體粉上，至完全將酮體粉浸濕。3 觀察結(jié)果 觀察酮體粉的顏色變化。5min內(nèi)出現(xiàn)紫色者為陽(yáng)性。4 判斷結(jié)果 判斷結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)下表【注意事項(xiàng)】 1 尿內(nèi)有大量非晶形尿酸鹽時(shí)，可出現(xiàn)橙色反應(yīng)，應(yīng)離心除去。2 試劑應(yīng)保存在干燥器內(nèi)，以免受潮失效。3 該法必須在堿性并產(chǎn)熱條件下進(jìn)行，因此冬季最好放在30水浴箱中進(jìn)行?！举|(zhì)量控制】 尿液要新鮮測(cè)定，因乙酰乙酸不穩(wěn)定、丙酮易揮發(fā)，陳舊性尿液會(huì)出現(xiàn)假陰性?！緟⒖贾怠?陰性。二干化學(xué)試帶法【目的】 掌握尿酮體定性測(cè)定的干化學(xué)試帶法。【原理】 以亞硝基鐵氰化鈉作酮體的顯示劑，

39、形成紫栗色化合物?！驹噭?多聯(lián)干化學(xué)試帶及標(biāo)準(zhǔn)色板?！緲?biāo)本】 新鮮尿液?！静僮鳌? 取尿液 將試帶浸入被檢尿液中，浸透后立即取出，及時(shí)那多余尿液在容器邊緣吸去，12min（詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）之內(nèi)在日光燈下與標(biāo)準(zhǔn)色板比較或以自動(dòng)分析儀測(cè)定。2 判斷結(jié)果 不變色為（-），棕色為（+），棕紅色為（+），紫栗色為（+）?！咀⒁馐马?xiàng)】1試帶應(yīng)放陰涼、干燥處，受潮后變軟發(fā)黃即失效。2尿中含肌酐、肌酸較多時(shí)，可呈假陽(yáng)性?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 目前使用的成品試帶有兩類，一類只于乙酰乙酸反應(yīng)，與其他酮體成分都不發(fā)生反應(yīng)；另一類與乙酰乙酸和丙酮都起反應(yīng)，但對(duì)乙酰乙酸的靈敏度明顯高于丙酮，前者為50100mg/L，而后者僅為

40、400700mg/L。兩類試帶與-羥丁酸都不反應(yīng)。由于試帶法敏感、方便、快速，已取代了上述兩種方法。此外，還有其他用于酮體單項(xiàng)成分定性的濕化學(xué)方法，如Gerhardt乙酰乙酸定性試驗(yàn)、-羥丁酸定性實(shí)驗(yàn)等。其中-羥丁酸定性試驗(yàn)對(duì)酮血癥的早期診斷意義較大，此時(shí)乙酰乙酸尚未大量排出。但這些試驗(yàn)操作均較繁瑣，影響因素多，而且靈敏度低，除特殊時(shí)需要外一般不用于常規(guī)檢查。【質(zhì)量控制】 1 尿液要新鮮，因乙酰乙酸不穩(wěn)定，丙酮易揮發(fā)。陳舊性尿液會(huì)出現(xiàn)假陰性。2 由于各種方法對(duì)乙酰乙酸和丙酮的靈敏度不同，在不同的病程中所出現(xiàn)的酮體種類也存在差異，因此個(gè)結(jié)果之間缺乏可比性。在選折實(shí)驗(yàn)方法及分析結(jié)果時(shí)應(yīng)加以注意。3

41、 由于上述所以方法均不能檢測(cè)-羥丁酸，因此懷疑早期酮血癥時(shí)最好測(cè)定血中D-3羥丁酸。4 陽(yáng)性質(zhì)控液的使用。低濃度質(zhì)控液（無(wú)丙酮）定性陰性，高濃度質(zhì)控液（丙酮1.6g/L）定性陽(yáng)性?！緟⒖贾怠?陰性。實(shí)驗(yàn)三 尿膽紅素定性檢查一Harrison法【目的】 掌握尿膽紅素定性測(cè)定的Harrison法。【原理】 用硫酸鋇吸附尿液中的膽紅素并濃縮，膽紅素與三價(jià)鐵（Fe3+）反應(yīng)，被氧化為膽青素、膽綠素和膽黃素的復(fù)合物，可顯藍(lán)綠色、綠色或黃綠色?！酒鞑摹?離心機(jī)、試管或離心管、5ml刻度吸管。【試劑】 10.14mol/L氯化鋇溶液 氯化鋇（BaCL2·2H2O）10.0g，溶于100ml蒸餾水中

42、。2Fouchet集市 100g/L的FeCL3+溶液10ml，250g/L三氯乙酸溶液90ml，混合后備用。3 鋇試紙 將優(yōu)質(zhì)濾紙裁策劃能夠0mm×80mm大小紙條，浸入飽和氯化鋇溶液內(nèi)（氯化鋇30g，溶于100ml蒸餾水）數(shù)分鐘后，室溫或37溫箱內(nèi)待干，貯于有塞瓶中密封備用?！緲?biāo)本】 新鮮尿液?！静僮鳌浚ㄒ唬?試管法1濃縮膽紅素 于10ml容量離心管中加入尿液5ml，再加入0.14mol/L氯化鋇溶液2.5ml，混勻后離心沉淀35min，棄去上清液。2加試劑 向沉淀表面加Fouchet試劑2滴，放置片刻觀察沉淀表面顏色的變化。3判斷結(jié)果 結(jié)果判斷見(jiàn)下表表 Harrison法尿膽紅

43、素檢查結(jié)果判斷反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果判斷報(bào)告方式沉淀即刻變?yōu)樗{(lán)綠色強(qiáng)陽(yáng)性+沉淀變?yōu)榫G色陽(yáng)性+沉淀逐漸變?yōu)榈G色弱陽(yáng)性+長(zhǎng)時(shí)間不變色陰性【注意事項(xiàng)】1膽紅素遇光易被氧化，因此標(biāo)本要新鮮并避光保存。2Harrison法需要尿中有作夠的硫酸根離子，如標(biāo)本與氯化鋇混合后不產(chǎn)生沉淀，可滴加硫酸氨試劑12滴，以促使沉淀形成。4 意藥物的干擾，患者尿中含大量牛黃、熊膽粉、水楊酸和阿司匹林時(shí)易產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)，可干擾Harrison法的結(jié)果觀察。5 加入Fouchet試劑要適量（5ml尿加2滴），過(guò)多會(huì)使膽紅素完全氧化成膽黃素而不顯綠色，造成判斷錯(cuò)誤。6 如尿液呈堿性，可減低反應(yīng)靈敏度，應(yīng)加乙酸調(diào)至酸性。【方法學(xué)評(píng)價(jià)】

44、Harrison法于反應(yīng)前加入吸附劑，提高了靈敏度（0.5mg/L）。盡管操作較為復(fù)雜（若快速檢驗(yàn)，也可采用紙條法），但準(zhǔn)確性高，為化學(xué)試帶篩檢后的確證試驗(yàn)，此法已取代了Smith碘環(huán)法。（二）氯化鋇試紙法1將氯化鋇試紙條一端浸入尿液中，至少深入50mm，510s后取出，平鋪與細(xì)水紙上。2在濾紙上浸有尿掖的部位滴加Fouchet試劑23滴，觀察顏色變化，結(jié)果判斷同試管法?！咀⒁馐马?xiàng)】 同試管法?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 該法操作簡(jiǎn)便，適用于快速檢驗(yàn)，與試管法具有相同的靈敏度?！緟⒖贾怠?陰性。二干化學(xué)試帶法【目的】 掌握尿膽紅素定性檢查的干化學(xué)試帶法?！驹怼?根據(jù)偶氮耦聯(lián)反應(yīng)原理，在強(qiáng)酸介質(zhì)中膽紅素與

45、重氮鹽發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)，生成紅色偶氮化合物。【試劑】 單聯(lián)或多聯(lián)干化學(xué)反應(yīng)試帶（附標(biāo)準(zhǔn)色板）?！緲?biāo)本】 新鮮尿液?！静僮鳌?將試帶浸入待測(cè)尿中約2s，吸取多余尿液，與標(biāo)準(zhǔn)色板比色，1min內(nèi)報(bào)告結(jié)果。按所用試帶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判斷，見(jiàn)下表表 試帶法膽紅素定性檢查結(jié)果判斷顏色變化結(jié)果判斷報(bào)告方式半定量（mg/L）不變色陰性 1.0淺棕色可疑+-1.5黃棕色弱陽(yáng)性+2.0紅棕色陽(yáng)性+4.0深棕色強(qiáng)陽(yáng)性+ 8.0【注意事項(xiàng)】1VitC和亞硝酸鹽能抑制偶氮反應(yīng)而呈假陰性，而大劑量氯丙嗪和高濃度的鹽酸苯氮吡啶的代謝產(chǎn)物在酸性條件下則呈假陽(yáng)性。2 試帶法結(jié)果可疑者，最好用Harrison方式加以驗(yàn)證?！痉椒▽W(xué)評(píng)

46、價(jià)】 該類試帶根據(jù)偶氮耦聯(lián)反應(yīng)原理而設(shè)計(jì)，各型號(hào)試劑帶所用偶氮鹽復(fù)合物大同小異。因反應(yīng)改在干化學(xué)試帶表面進(jìn)行，大大提高了檢測(cè)的靈敏度（二氯重氮氟化硼酸鹽試帶為25mg/L），有時(shí)還起到半定量的作用。加之操作簡(jiǎn)便、快速、可用儀器檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已得到臨床廣泛應(yīng)用，但本法仍不及Harrison法靈敏?！举|(zhì)量控制】1標(biāo)本要及時(shí)測(cè)定或避光保存，注意假陽(yáng)性或假陰性的分析。2試帶要密封、避光、干燥保存。定期檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本，以保證試帶質(zhì)量?！緟⒖贾怠?陰性實(shí)驗(yàn)四 尿膽原定性檢查一、改良Ehrlich法【目的】 掌握改良Ehrlich法尿膽原定性方法。【原理】 尿膽原在酸性條件下與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，生成櫻紅色化

47、合物。該反應(yīng)與尿膽原分子中的吡咯環(huán)有關(guān)，顏色深淺可反映尿膽原的含量?！酒鞑摹?中試管（10mm×150mm），白色襯紙，離心機(jī)，刻度吸管等。【試劑】1 Ehrlich試劑 對(duì)二甲基苯甲醛2.0g，溶于80ml蒸餾水，然后在緩慢加入濃鹽酸20ml，混勻后貯存與棕色試劑瓶中備用。2 無(wú)水氯化鈣、蒸餾水?！緲?biāo)本】 新鮮尿液?！静僮鳌?1 去除膽紅素 被檢尿液中如含有膽紅素應(yīng)除去，方法為：每5ml尿中加無(wú)水氯化鈣0.25g，混合后過(guò)濾（或離心23min），取濾液（或上清液）備用。2 加試劑 取濾液或上清液約5ml，按10：1的比例加入Ehrlich試劑（約0.5ml），一同放入試管中混合，室

48、溫下靜置10min。3 觀察結(jié)果 在白色背景下從管口向管底觀察顏色變化。結(jié)果判斷見(jiàn)下表。4 陽(yáng)性標(biāo)本稀釋 如為陽(yáng)性，則將尿液以蒸餾水分別稀釋為1：10；1：20；1：40；1：80和1：160等，按以上程序重新檢查，以最高稀釋倍數(shù)者報(bào)告。如稀釋1：160以上仍為陽(yáng)性則不再稀釋。表 改良Ehrlich法尿膽原定性結(jié)果判斷顏色變化結(jié)果判斷報(bào)告方式不變色，加溫后也無(wú)反應(yīng)陰性10min后呈微紅色弱陽(yáng)性+10min后呈櫻紅色陽(yáng)性+立即呈呈紅色強(qiáng)陽(yáng)性+【注意事項(xiàng)】1 標(biāo)本要新鮮，避光貯存，否則尿膽原氧化為尿膽素呈假陰性；尿中膽紅素陽(yáng)性應(yīng)先除去。2 磺胺。PAS等藥物可使反應(yīng)呈黃色或黃紅色渾濁；含氯丙嗪的尿

49、液成紫紅色反應(yīng)；糞臭素可顯藍(lán)色；吲哚類物質(zhì)和卟膽原遇醛試劑也顯紅色。但由尿膽原產(chǎn)生的櫻紅色化合物可被三氯甲烷萃取，吲哚類化合物能被正丁醇提取，都不能被提取的物質(zhì)是卟膽原，以此可以鑒別。3 尿中含有VitC、甲醛或?yàn)趼渫衅窌r(shí)要阻止醛反應(yīng)；如含有吡啶、酮體則出現(xiàn)假陽(yáng)性?？杉尤胛齑歼M(jìn)行鑒別，真陽(yáng)性加戊醇后仍呈紅色；由酮體等造成的假陽(yáng)性遇到戊醇后變成淡綠色。4 顯色速度受溫度影響較大，一般反應(yīng)溫度要求在20左右，室溫過(guò)低時(shí)需加溫。5 堿性尿可使反應(yīng)出現(xiàn)黃色沉淀而干擾結(jié)果觀察，應(yīng)先調(diào)節(jié)尿液PH至酸性?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】 改良Ehrlich法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易受膽紅素、卟膽原以及某些藥物的干擾?！举|(zhì)量控制】1

50、性質(zhì)控與飲水量有關(guān)，夜間和上午排泄較少，午餐后迅速增高（24h達(dá)到最高峰）。而且尿膽原的清除率與尿液的pH有關(guān)，pH為5.0時(shí)，排泄率為2ml/min；而 pH為8.0時(shí)的排泄率為25ml/min。測(cè)試前應(yīng)囑患者口服少量NaHCO3使尿液堿化，留取午餐后24h時(shí)尿液做尿膽原定性。檢測(cè)前再以乙酸調(diào)節(jié)pH至弱酸性。2 若尿膽原定性陰性，可加做尿膽素定性試驗(yàn)予以驗(yàn)證，以免標(biāo)本久置造成假陰性。3 長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素可抑制腸道菌群，嚴(yán)重腹瀉也會(huì)影響膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚰懺?，造成結(jié)果陰性。長(zhǎng)期便秘使尿膽原過(guò)度吸收，定性時(shí)陽(yáng)性程度增高，分析結(jié)果時(shí)應(yīng)注意?！緟⒖贾怠?陰性或弱陽(yáng)性，1：20稀釋后陰性。二、干化學(xué)試帶法【

51、目的】 掌握試帶法尿膽原定性方法及注意事項(xiàng)?！驹怼?試帶有兩種，一種是以Ehrlich醛反應(yīng)為基礎(chǔ)的快速檢驗(yàn)試帶，另一種是利用尿膽原與重氮化合物的耦聯(lián)反應(yīng)，根據(jù)產(chǎn)生紅色的深淺判斷尿膽原含量。既可以定性，也可以定量?！驹噭?干化學(xué)試帶（以國(guó)產(chǎn)醛反應(yīng)為例）與標(biāo)準(zhǔn)色板?！緲?biāo)本】 新鮮尿液?！静僮鳌?將試帶與待測(cè)標(biāo)本中浸濕后取出，吸去多余尿液，1min內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)色板比色，按下表判斷結(jié)果。表 試帶法尿膽原定性試驗(yàn)結(jié)果判斷顏色反應(yīng)結(jié)果判斷報(bào)告方式半定量（mg/L）不變色陰性-0淺棕色1:20陰性正常0.5黃棕色1:20陽(yáng)性陽(yáng)性1.5棕色1:40陽(yáng)性陽(yáng)性4.0深桔色1:80強(qiáng)陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性>80【注意事

52、項(xiàng)】1 由于醛反應(yīng)快速，應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察結(jié)果。2 卟膽原、內(nèi)生性吲哚、黑素原可造成假陽(yáng)性。3 陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)稀釋的方法同改良Ehrlich法。4 尿液要新鮮。【方法學(xué)評(píng)價(jià)】 干化學(xué)法操作簡(jiǎn)便、快速，既可定性，也可以定量，適用于肉眼觀察與儀器檢測(cè)，而且不受尿中膽紅素的影響，很少出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此該法優(yōu)于Ehrlich法?！举|(zhì)量控制】 同改良Ehrlich法?！緟⒖贾怠?陰性或弱陽(yáng)性，1：20稀釋后陰性。實(shí)驗(yàn)五 尿沉渣檢查非染色法尿沉渣顯微鏡檢查【目的】 掌握尿沉渣非染色法顯微鏡檢查的內(nèi)容和方法。【原理】 采用顯微鏡觀察的方法，根據(jù)尿液細(xì)胞、管型等有形成分的形態(tài)特征，識(shí)別并記錄其在顯微鏡一定視野內(nèi)（或

53、一定體積尿液內(nèi)）的數(shù)量。【器材】 載玻片、離心機(jī)、刻度離心管、蓋玻片（2mm×2mm）、滴管、普通顯微鏡、定量尿沉渣分析板?！緲?biāo)本】 新鮮尿液?！静僮鳌? 未離心直接涂片法 混勻：充分混勻尿液。 制備涂片：取混勻的尿液1滴與載玻片上，加蓋玻片，注意避免產(chǎn)生氣泡。 觀察計(jì)數(shù)：先用低倍鏡觀察全片細(xì)胞、管型等成分的分布情況，然后用高倍鏡確認(rèn)。注意使用暗視野觀察尿液有形成分，特別是透明管型。管型在低倍鏡下觀察。至少計(jì)數(shù)20個(gè)視野；細(xì)胞在高倍鏡下觀察至少計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取其平均值報(bào)告；結(jié)晶按高倍鏡視野中分布范圍估計(jì)報(bào)告。計(jì)數(shù)時(shí)要注意細(xì)胞的完整性，還要注意有無(wú)其他異常巨大的細(xì)胞、寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵、滴蟲(chóng)

54、、黏液絲等，男性尿液標(biāo)本還要注意有無(wú)精子及卵磷脂小體。2 離心沉淀涂片法（1） 離心尿液：適用與尿外觀非明顯渾濁的尿標(biāo)本，是尿沉渣檢查標(biāo)準(zhǔn)化推行的方法。取尿液10ml離心5min（1500r/min），要求相對(duì)離心力（RCF）為400g。（2） 提取尿沉渣：手持離心管傾斜45°90°，用滴管吸去上層尿液，保留下層尿0.2ml尿沉渣。（3） 涂片：輕輕混勻尿沉渣后，去1滴（大約50l）置載玻片上，用18mm×18mm或22mm×22mm的蓋玻片覆蓋后顯微鏡檢查。（4） 觀察計(jì)數(shù)：與未離心尿直接涂片法相同。3 定量尿沉渣分析板法 定量尿沉渣分析板由一塊硬質(zhì)塑料板制成。每塊板內(nèi)分為10個(gè)統(tǒng)一深度（0.1mm）的計(jì)數(shù)池，每個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)的計(jì)數(shù)區(qū)為1.0l。計(jì)數(shù)區(qū)分為10個(gè)大方格，每個(gè)大方格又分為9個(gè)小方格。 未離心法：直接取充分混勻的尿液1滴充入定量尿沉渣分析板計(jì)數(shù)池內(nèi)，在低倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)大方格內(nèi)管型總數(shù)，在高倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，此即每微升尿液某種細(xì)胞或