蛋白質與DNA的相互作用PPT課件

1、 分類： 與單鏈RNA結合 與莖環(huán)結構結合 與雙鏈DNA結合：普遍性結合 特異性結合第1頁/共36頁 蛋白質與DNA結合的特性：1.DNA識別部位有二度對稱性。蛋白質一般是有二度對稱結構的二聚體，兩個單體具有旋轉對稱性，與鹼基的旋轉對稱吻合。2.蛋白質和DNA的接觸區(qū)只在DNA的一側。3.在結合過程中，蛋白質和DNA都有構像改變。4.普遍性結合：蛋白質中帶正電荷氨基酸與DNA骨架的磷酸基團形成離子鍵。5. 特異性結合：識別螺旋區(qū)內氨基酸與DNA特定鹼基接觸。第2頁/共36頁 蛋白質與DNA的普遍性結合中DNA特點： 蛋白質與DNA主鏈骨架接觸，大多數(shù)涉及磷酸二酯鍵中的氧原子。 與DNA鹼基序列

2、特異性無關 結構的匹配性： 旋轉對稱性 特定距離的相反電荷 形成氫鍵基團排布上的匹配 形成足夠大的范德華力第3頁/共36頁1.蛋白質和DNA都存在0.7nm 的重復距離 DNA雙螺旋單鏈相鄰磷酸基團間的距離是0.7nm。 折疊，N原子間距離是0.7nm 伸展折疊C間距離是0.7nm 螺旋，Arg和Lys被另外三個殘基隔開，帶正電荷側鏈的距離是0.7nm.2.DNA對稱性 平移對稱： GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA 第4頁/共36頁二重軸對稱 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋轉對稱 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG旋轉對

3、稱 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT 第5頁/共36頁 蛋白質與DNA特異性結合中DNA特點： 大溝內存在特異性識別信息 氨基酸與堿基對共平面 氨基酸和堿基對之間形成氫鍵 第6頁/共36頁第7頁/共36頁第8頁/共36頁NNOHNNNHNNONHCOOCCNHHNHHHGluAgrH第9頁/共36頁 蛋白質與DNA普遍結合中蛋白質特點： -折疊結構的帶正電荷殘基與磷酸集團結合 可能是通過識別小溝結構實現(xiàn) 1.富含脯氨酸和堿性氨基酸 組蛋白有重復的SPKK Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列與A-T堿基對結合 KPRGRPK序列也能與小溝A

4、-T結合 2.堿性螺旋 組蛋白H1C端57個氨基酸 Lys和Gly,Lys在螺旋兩側，Gly夾在中間 第10頁/共36頁3.蛋白磷酸化作用 SP X X： Ser磷酸化 TPKK： Tyr磷酸化 磷酸化后和DNA結合能力下降 磷酸化失去氫鍵第11頁/共36頁 蛋白質與DNA特異性結合中蛋白質特點： 1.蛋白質多形成二聚體第12頁/共36頁 HTH復合物第13頁/共36頁第14頁/共36頁 同源盒結構第15頁/共36頁 亮氨酸拉鏈結構NH2COOH堿性氨基酸AgrAgr和LysLys第16頁/共36頁鋅指結構 Agr和G形成氫鍵第17頁/共36頁第18頁/共36頁 細胞核蛋白質的提取 收集細胞，

5、洗去血清和培養(yǎng)基 裂解細胞：Triton X-100 NP-40 去胞漿成分 裂解細胞核：高濃度KCl :600mM 變更緩沖液濃度第19頁/共36頁 快速抽提 裂解液： 提取液： 10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 1mM PMSF pH 7.9 0.5% NP-40 pH 7.9第20頁/共36頁 1X107細胞100ul裂解液、冰浴5分鐘、離心沉淀用不含NP-40的裂解液洗一次100ul提取緩沖液干冰異丙醇速凍，反復凍融3次離心沉淀 800C保存第21頁/共36頁 凝膠滯后試驗

6、第22頁/共36頁1.蛋白質和DNA結合復合物半衰期短 電泳緩沖液低離子強度 凝膠的籠效應2.探針以20-200bp 為宜。過小不利于蛋白結合，過大增加非特異性結合。3.用競爭性抑制檢測DNA與蛋白質結合的特異性4.加3ug Poly(dI-dC)減少非特異性結合5.超級凝膠電泳增強蛋白質的凝膠阻滯作用6.只能確定結合，無法確定序列第23頁/共36頁DNA足跡分析第24頁/共36頁DNA足跡分析第25頁/共36頁1.DNAase隨機水解核苷酸磷酸二酯鍵 每一個DNA分子最好只切一次2.蛋白質與DNA結合保護DNA不被切割3.電泳用的是變性凝膠： 相差一個核苷酸DNA彼此分開 蛋白質從DNA分子

7、上脫落4.可確定與蛋白質結合的DNA序列5.DNA序列是固定的第26頁/共36頁第27頁/共36頁隨機PCR 凝膠阻滯試驗：蛋白質和DNA結不結合， 不能確定結合的序列 DNA足跡分析：蛋白質結合DNA的序列 不能確定序列鹼基變化對 結合的影響 隨機PCR:結合序列鹼基變化對結合的影響第28頁/共36頁 寡核苷酸設計與合成：1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA2. 引物合成3.標準結合反應寡核苷酸的合成4.電泳回收第29頁/共36頁 探針標記： 合成的含隨機序列的單鏈寡核苷酸 3引物 32PdCTP dNTP(不包括dCTP) Klenow酶電泳純化第30頁/共36頁 凝膠阻

8、滯試驗純化探針1.蛋白質與標準結合寡核苷酸結合 蛋白質與隨機寡核苷酸結合 電泳（樣品隔開，防污染）2.凝膠回收3.酚、氯仿去蛋白4.PCR（底物加32PdCTP）5.PCR產(chǎn)物再做凝膠阻滯試驗，反復純化第31頁/共36頁 特異結合序列的克隆和序列分析： 酶切隨機核苷酸序列與質粒重組 用引物對質粒序列進行分析 N1 N2 N3 N4 N5A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01 T/A A/T/C C C G/A 超過50%：確定不可替換25-50%：兩種鹼基可替換小于25%：沒有鹼基特異性 第32頁/共36頁SouthWestern雜交試驗 確定與DNA結合的蛋白質分子量 蛋白質進行SDS-Pa